¹ По данным «Gnosis».
² Сертификат GMP №C0170889-173GMPMF-1, NSF International (США).

БАД. НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ

Витамин Е (токоферол) — в каких продуктах содержится?

Автор: врач, научный директор АО «Видаль Рус», Жучкова Т. В., [email protected]

Суточная потребность в витамине Е (альфа-токофероле ацетате или просто токофероле) определяется несколькими факторами (в т. ч. полом, массой тела). Мужчинам требуется 10 МЕ в сутки, женщинам 8 МЕ, беременным – 10 МЕ, а кормящим целых 12 МЕ.

Рассчитать дозировку витамина Е можно следующим образом: детям до 1 года полагается 0.5 мг витамина на 1 кг массы тела, а взрослым требуется 0.3 мг витамина на кг.

Зачем нужен витамин Е?

Это вещество улучшает циркуляцию крови, ускоряет регенерацию кожи, помогает при тяжелом предменструальном синдроме и лечении фиброзных заболеваний груди.

Токоферол нормализует свертываемость крови, ускоряет заживление ран и снижает вероятность образования шрамов. Его применяют в составе комбинированного лечения и профилактики многих заболеваний. Витамин Е применяют при интенсивных физических нагрузках, в т.ч. в программах подготовки спортсменов.

Витамин Е является антиоксидантом: он защищает клетки от повреждения, замедляя формирование разрушительных свободных радикалов.

К тому же токоферол защищает жирорастворимые витамины от разрушения кислородом. Именно поэтому он способствует усвоению витамина А.

Витамин Е замедляет старение и способствует оплодотворению и формированию плаценты.

Не так давно было установлено, что токоферол облегчает течение болезни Альцгеймера и сахарного диабета, укрепляет иммунитет и повышает защитные силы организма.

Примечательно, что эффективность витамина Е повышается в присутствии других антиоксидантов.

Таким образом, правильное применение витамина Е может вызывать следующие положительные эффекты:

• препятствовать тромбообразованию.
• укреплять иммунитет.
• защищать клетки от повреждающего действия свободных радикалов.
• участвовать в синтезе гема (входит в состав гемоглобина и отвечает за перенос кислорода и клеточное дыхание).
• участвовать в синтезе ряда гормонов.
• обеспечивать нормальную работу мышц.

Но помните, что витамин Е – это профилактическое средство, он не может лечить уже имеющиеся заболевания!

Где же искать витамин Е?

Витамином Е богаты растительные масла: кукурузное, хлопковое, оливковое и подсолнечное.

Токоферол так же содержится в яблочных семечках, миндале, арахисе, злаковых, бобовых и зеленых листовых овощах, в овсяной крупе, сое и соевых продуктах, в пшенице и ее проростках.

Среди продуктов животного происхождения больше всего витамина Е в яичных желтках, печени, молоке.

Что делать если витамина Е не хватает?

При недостаточном поступлении витамина Е или при нарушении его всасывания (например, при заболеваниях кишечника) развивается гиповитаминоз.

Самым первым и ярким признаком нехватки витамина Е является мышечная дистрофия. Волокна мышц распадаются и в них откладываются соли кальция.

В печени уменьшаются запасы гликогена, отмечаются некрозы и жировая дистрофия.

При недостаточности токоферола снижается продолжительность жизни эритроцитов, могут возникать нарушения работы сердца и репродуктивной функции организма.

Что касается гипервитаминоза, то встречается он довольно редко, так как витамин Е отличается малой токсичностью.

При одномоментном приеме слишком большого количества витамина Е может развиваться тошнота, вздутие живота и понос.

Железо в большом количестве может частично разрушать токоферол, поэтому препараты железа не следует принимать вместе с витамином Е!

Помните, что определить потребность в витамине Е и правильно подобрать его дозу может только врач.

Топ-9 продуктов, богатых биотином | Еженедельник АПТЕКА

Биотин, или витамин В₇, необходим организму для метаболизма углеводов, жиров и белков. Он также играет роль в регуляции генов и клеточной сигнализации, связан с сохранением здоровья волос, ногтей и кожи. Кроме того, биотин важен для развития плода во время беременности, а также здоровья печени. Поскольку это водорастворимый витамин, он не депонируется в организме. Однако биотин может синтезироваться кишечными бактериями или всасываться из пищи. Суточная норма биотина для взрослых — 30 мкг, для женщин во время грудного вскармливания — 35 мкг. К наиболее богатым биотином продуктам относят следующие:

Мясные продукты. Поскольку большая часть биотина хранится в печени, этот орган считается наиболее богатым биотином у животных. 85 г приготовленной говяжьей печени содержит около 30 мкг биотина. Почки также содержат высокий уровень этого витамина. Другие виды мяса содержат меньше биотина, однако являются относительно хорошим его источником. Например, 85 г свиной отбивной обеспечивают почти 4 мкг биотина.

Яичный желток. 1 целое яйцо содержит около 10 мкг биотина. Для максимального содержания в них биотина яйца следует готовить перед употреблением в пищу.

Дрожжи. Как пивные, так и пищевые дрожжи являются хорошим источником биотина, хотя его количество может сильно варьировать. 7 г пивных дрожжей содержат 1,4–14 мкг биотина.

Орехи и семена. Содержание биотина зависит от вида ореха или семян. Миндаль, арахис, грецкие орехи и орехи пекан содержат наибольшее количество этого витамина. В ¼ чашки жареного миндаля — 1,5 мкг биотина, в ¼ чашки жареных семян подсолнечника — 2,6 мкг. Кроме того, орехи и семена содержат другие питательные вещества, включая витамин Е, который также приносит пользу здоровью кожи и волос.

Лосось. Эта жирная рыба богата белком, омега-3 жирными кислотами и другими питательными веществами, которые способствуют сохранению здоровья кожи и волос. Она также хороший источник биотина — 85 г лосося содержат до 5 мкг этого витамина.

Молочные продукты. Молоко, сыр и йогурт содержат биотин в различных количествах. В сравнительном исследовании 23 видов сыра было установлено, что сыр камамбер и голубой сыр являются одними из самых богатых биотином. Сыр чеддер содержит 0,4 мкг биотина на 30 г, стакан 2% молока — 0,3 мкг, а стакан йогурта — 0,2 мкг.

Авокадо. По данным некоторых источников, один целый плод содержит 2–6 мкг биотина. Как орехи и семена, авокадо является богатым источником витамина Е.

Сладкий картофель. Этот продукт входит в число наиболее биотинсодержащих овощей. Половина стакана приготовленного сладкого картофеля содержит около 2,4 мкг биотина и всего 90 ккал. Сладкий картофель также богат бета-каротином, который организм превращает в витамин А, что делает его хорошим выбором для тех, кто хочет улучшить здоровье своей кожи.

Цветная капуста. 1 стакан сырой цветной капусты обеспечивает до 4 мкг биотина.

Стоит отметить, что количество биотина в продуктах меняется в зависимости от метода приготовления пищи. Например, консервирование может снизить уровень этого витамина.

По материалам www.medicalnewstoday.com

Витамин E — Клиника Мэйо

Обзор

Витамин Е — это питательное вещество, которое важно для зрения, репродукции и здоровья крови, мозга и кожи.

Витамин Е также обладает антиоксидантными свойствами. Антиоксиданты — это вещества, которые могут защитить ваши клетки от воздействия свободных радикалов — молекул, образующихся, когда ваше тело расщепляет пищу или подвергается воздействию табачного дыма и радиации. Свободные радикалы могут играть роль в сердечно-сосудистых заболеваниях, раке и других заболеваниях.Если вы принимаете витамин Е из-за его антиоксидантных свойств, имейте в виду, что добавка может не иметь тех же преимуществ, что и природные антиоксиданты в пище.

Продукты, богатые витамином Е, включают масло канолы, оливковое масло, маргарин, миндаль и арахис. Вы также можете получить витамин Е из мяса, молочных продуктов, листовой зелени и обогащенных злаков. Витамин Е также доступен в виде пероральных добавок в капсулах или каплях.

Дефицит витамина Е может вызвать нервную боль (невропатию).

Рекомендуемая дневная доза витамина Е для взрослых составляет 15 миллиграммов в день.

Доказательства

Исследования использования витамина Е в определенных условиях показывают:

• Болезнь Альцгеймера. Некоторые исследования показали, что высокие дозы витамина Е могут замедлить прогрессирование болезни Альцгеймера у людей, у которых была диагностирована болезнь Альцгеймера от легкой до умеренной. Другие исследования не показали этого преимущества. Добавки витамина Е не влияют на прогрессирование людей с умеренными когнитивными нарушениями до болезни Альцгеймера.
• Болезнь печени. Исследования показывают, что витамин Е может улучшить симптомы неалкогольной жировой болезни печени. Однако некоторые данные свидетельствуют о том, что прием витамина Е перорально с этой целью в течение двух лет связан с инсулинорезистентностью.
• Преэклампсия. Не было доказано, что увеличение потребления витамина Е предотвращает это состояние беременности, которое влияет на артериальное давление.
• Рак простаты. Исследования показывают, что добавки с витамином Е и селеном не предотвращают рак простаты.Также есть опасения, что употребление добавок витамина Е может увеличить риск рака простаты.

Наш дубль

Осторожно

Большинство людей получают достаточно витамина Е из сбалансированной диеты. Если у вас диагностирована болезнь Альцгеймера от легкой до умеренной, некоторые исследования показывают, что терапия витамином Е может помочь замедлить прогрессирование заболевания.

Однако пероральное употребление витамина Е может увеличить риск рака простаты. Использование добавки может представлять другие серьезные риски, особенно в высоких дозах и если у вас есть другие проблемы со здоровьем, или если у вас был сердечный приступ или инсульт.

Безопасность и побочные эффекты

При приеме в соответствующих дозах пероральное применение витамина Е обычно считается безопасным. Редко пероральное употребление витамина Е может вызвать:

• Тошнота
• Диарея
• Спазмы кишечника
• Усталость
• Слабость
• Головная боль
• Затуманенное зрение
• Сыпь
• Дисфункция гонад
• Повышенная концентрация креатина в моче (креатинурия)

Прием более высоких доз витамина Е может увеличить риск побочных эффектов. Также есть опасения, что люди с плохим здоровьем, принимающие высокие дозы витамина Е, подвергаются повышенному риску смерти.

Использование витамина Е может влиять на многие состояния. Например, исследования показывают, что пероральное употребление витамина Е может увеличить риск рака простаты. Другие исследования показывают, что употребление витамина Е может увеличить риск смерти у людей с тяжелыми сердечными заболеваниями, такими как сердечный приступ или инсульт. Перед приемом витамина Е проконсультируйтесь с врачом, если у вас есть:

• Дефицит витамина К
• Заболевание глаза с повреждением сетчатки (пигментный ретинит)
• Нарушения свертывания крови
• Диабет
• История перенесенного сердечного приступа или инсульта
• Рак головы и шеи
• Болезнь печени

Добавка может увеличить риск кровотечения.Если вы планируете операцию, прекратите прием витамина Е за две недели до этого. Кроме того, поговорите со своим врачом о применении витамина Е, если вы собираетесь принимать или только что прошли процедуру по открытию закупоренных артерий и восстановлению нормального кровотока в сердечной мышце (ангиопластика).

взаимодействия

Использование некоторых лекарств может повлиять на уровень витамина Е. Возможные взаимодействия включают:

• Алкилирующие средства и противоопухолевые антибиотики. Есть опасения, что высокие дозы витамина Е могут повлиять на использование этих химиотерапевтических препаратов.
• Антикоагулянты и антитромбоцитарные препараты, травы и пищевые добавки. Использование витамина E с этими лекарствами, травами и добавками для уменьшения свертывания крови может увеличить риск кровотечения.
• Субстраты цитохрома P450 3A4 (CYP3A4). Соблюдайте осторожность при приеме витамина E и других препаратов, на которые действуют эти ферменты, например омепразола (Prilosec, Zegerid).
• Статины и ниацин. Прием витамина Е со статинами или ниацином, который может принести пользу людям с высоким уровнем холестерина, может снизить эффект ниацина.
• Витамин К. Прием витамина Е вместе с витамином К может уменьшить действие витамина К.

Получите самую свежую информацию о здоровье от экспертов Mayo Clinic.

Зарегистрируйтесь бесплатно и будьте в курсе достижений в области исследований, советов по здоровью и актуальных вопросов здравоохранения, таких как COVID-19, а также опыта в области управления здоровьем.

Чтобы предоставить вам наиболее актуальную и полезную информацию и понять, какие информация полезна, мы можем объединить вашу электронную почту и информацию об использовании веб-сайта с другая имеющаяся у нас информация о вас. Если вы пациент клиники Мэйо, это может включать защищенную медицинскую информацию.Если мы объединим эту информацию с вашими защищенными информация о здоровье, мы будем рассматривать всю эту информацию как защищенную информацию и будет использовать или раскрывать эту информацию только в соответствии с нашим уведомлением о политика конфиденциальности. Вы можете отказаться от рассылки по электронной почте в любое время, нажав на ссылку для отказа от подписки в электронном письме.

Подписаться!

Спасибо за подписку

Наш электронный информационный бюллетень Housecall будет держать вас в курсе самой последней информации о здоровье.

Извините, что-то пошло не так с вашей подпиской

Повторите попытку через пару минут

Повторить

1. Витамин Е оральный.Факты и сравнения. Электронные ответы. http://www.wolterskluwercdi.com/facts-comparisons-online/. Доступ 10 августа 2017 г.
2. Витамин Е. Micromedex 2.0 Healthcare Series. http://www.micromedexsolutions.com. Доступ 10 августа 2017 г.
3. Витамин E. Натуральные лекарства. https://naturalmedicines.the mentalresearch.com. По состоянию на 27 сентября 2017 г.
4. Антиоксиданты. СпроситеMayoExpert. Рочестер, Миннесота: Фонд Мейо медицинского образования и исследований; 2017.
5. Press D, et al.Профилактика деменции. https://www.uptodate.com/contents/search. По состоянию на 15 августа 2017 г.
6. Sexton DJ, et al. Простуда у взрослых: лечение и профилактика. https://www.uptodate.com/content/search. Проверено 8 августа 2017 г.
7. Press D, et al. Лечение деменции. https://www.uptodate.com/contents/search. По состоянию на 17 августа 2017 г.
8. Витаминно-минеральные добавки. Американская Ассоциация Сердца. http://www.heart.org/HEARTORG/HealthyLiving/HealthyEating/Vitamin-and-Mineral-Supplements_UCM_306033_Article.jsp # .WDpy-X0mGLU. По состоянию на 17 августа 2017 г.

.

Семь лучших продуктов, богатых витамином Е, которые вы должны включить в свой рацион

Витамин Е — важный витамин, который необходимо включать в свой рацион для правильного функционирования вашего организма. Незаменимое питательное вещество необходимо для правильного функционирования многих органов. Он также является антиоксидантом и помогает предотвратить сердечные заболевания, рак и потерю памяти.Он также замедляет процессы, повреждающие клетки, а значит, уменьшает признаки старения. Ежедневная доза витамина Е должна составлять 14-15 мг. Витамин Е также доступен в форме капсул, рекомендуется употреблять натуральные источники питательных веществ. Вот список лучших источников витамина Е. Вы обязательно должны включить эти богатые витамином Е продукты в свой рацион. (ТАКЖЕ ПРОЧИТАЙТЕ 6 лучших способов включить в свой рацион больше мяты или пудины). Также читайте — вот как вариант омикрона не влияет на легкие, несмотря на более высокую скорость мутации

Миндаль

Также читайте — исследователи выяснили, как рак яичников может развиваться у женщин

Миндаль — самый богатый источник витамина Е.Начните свой день с 10 миндальных орехов, замоченных на ночь. Миндаль, богатый витамином Е, предотвратит ранние признаки старения и сохранит сияние вашей кожи. Выбирайте натуральный и несоленый миндаль или бадам. Читайте также — Омикрон: два новых симптома, которые нельзя игнорировать

Семечки подсолнечника

Семечки подсолнечника обладают рядом преимуществ для здоровья, а также являются отличной закуской между приемами пищи. Их можно есть сырыми или использовать для украшения любого блюда. Предполагается, что нужно есть только внутренние семена, а не внешнюю оболочку. (ТАКЖЕ ПРОЧИТАЙТЕ 5 лучших продуктов, богатых витамином А, которые вы должны включить в свой рацион).

Арахис

Арахис является источником многих полезных для сердца питательных веществ, включая витамин Е. Он также является полезным перекусом. Съешьте горсть арахиса для ежедневного потребления витамина Е. Но тем, у кого аллергия на этот орех, следует поискать альтернативный источник витамина Е.

Авокадо

Авокадо богат витамином Е. Хотя они и являются фруктами, они имеют высокое содержание жира, которые обеспечивают ваше тело полезными мононасыщенными жирными кислотами. Сделайте вкусный соус из авокадо, смузи или просто добавьте их в салат. Авокадо утоляет голод. (ТАКЖЕ ПРОЧИТАЙТЕ Best Avocado Hacks: 5 лучших быстрых способов включить авокадо в продукты для завтрака и закуски).

Брокколи

Брокколи — популярный овощ, известный своими различными питательными и лечебными свойствами. Это один из лучших продуктов для детоксикации. Вы можете употреблять этот богатый витамином Е овощ в приготовлении на пару, в виде смузи из брокколи или просто добавлять его в салат.Всего одна чашка брокколи покрывает четыре процента вашей суточной потребности в витамине Е.

Растительные масла

Растительные и растительные масла являются еще одним естественным источником витамина Е, и они могут удовлетворить до 28 процентов суточная потребность в приеме пищи. Включите в свой рацион растительные и растительные масла, такие как подсолнечное масло, оливковое масло и масло канолы. (ТАКЖЕ ПРОЧИТАЙТЕ Лучшие продукты, богатые железом для повышения гемоглобина: 10 лучших продуктов для повышения уровня гемоглобина в крови).

Шпинат

Вам следует включить в свой рацион зеленые овощи, такие как брокколи и шпинат. Шпинат богат витамином Е. Чтобы получить максимальную пользу, используйте приготовленный шпинат вместо сырого. Ешьте шпинатный суп или зеленый смузи, чтобы добавить в свой рацион немного зелени.

(Изображение предоставлено Shutterstock)

Эта история показалась интересной? Поставьте лайк на нашей странице в Facebook, чтобы читать больше таких статей. Также поделитесь своими комментариями ниже.Мы были бы рады получить известия от вас.

Границы | Регулирование биосинтеза витамина Е на дереве в оливковых фруктах в течение последовательных лет роста: влияние развития плодов и экологические сигналы

Введение

Оливковые деревья распространены в Средиземноморском регионе, и их культивируют по экономическим причинам, причинам здоровья и питания (Turktas et al., 2013). В плодах оливок было обнаружено множество полифенольных соединений, таких как гидрокситирозол олеуропеина, тирозол, ванильная кислота и лютеолин, и их присутствие коррелировало со многими заявлениями о здоровье человека плодов оливок и продуктов из них (Soler-Rivas et al. , 2000). Важно отметить, что плоды оливы содержат значительное количество токохроманолов, которые известны как мощные липофильные антиоксиданты и являются важными диетическими питательными веществами для млекопитающих, такими как витамин E (Schneider, 2005). Последний состоит из восьми различных форм, организованных в две химические группы (α-, β-, γ-, δ-токоферолы и α-, β-, γ-, δ-токотриенолы, соответственно). Токоферолы и токотриенолы — хорошо известные соединения, способствующие укреплению здоровья, обычно присутствующие в некоторых фруктах и ​​овощах, включая оливковое (Chun et al., 2006). Многочисленные исследования выявили несколько физиологических реакций на токохроманолы, которые могут иметь отношение к укреплению здоровья и профилактике или лечению некоторых хронических заболеваний (Sen et al., 2007). Токохроманолы защищают от рака (Colombo, 2010), сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний (Aggarwal et al., 2010) и снижают риск болезни Альцгеймера (Wollen, 2010).

Альфа-токоферол составляет до 68–89% от общего содержания токоферолов в плодах оливок в зависимости от сорта и стадии развития (Muzzalupo et al. , 2011). Было описано большое разнообразие концентраций токохроманолов в плодах оливок, что подчеркивает влияние генетических факторов и факторов окружающей среды на состав токохроманолов (Hassapidou and Manoukas, 1993; Bruno et al., 2009; Muzzalupo et al., 2011; Bodoira et al. ., 2015).

Исследования пути биосинтеза витамина Е в основном сосредоточены на таких растениях, как Solanum lycopersicum L. (Quadrana et al., 2013), Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (Li et al., 2010; Zhang et al., 2013, 2014), Nicotiana tabacum L. (Yabuta et al., 2013) и Lactuca sativa L. (Ren et al., 2011; Yabuta et al., 2013), в то время как очень мало имеется информация о культурах фруктовых деревьев, в том числе оливковых (Георгиаду и др., 2015; дополнительный рисунок S1). В нашем предыдущем исследовании (Georgiadou et al., 2015) профили экспрессии временных генов с высоким разрешением биосинтетических генов токохроманола были определены параллельно с содержанием восьми форм витамина E в течение 17 стадий развития плодов оливы на дереве, соответствующих 8 этапам развития плодов оливы. месячный период, начинающийся в июне и заканчивающийся в январе.Текущая работа направлена ​​на определение временных профилей транскриптов генов биосинтеза токоферола и токотриенола и количественную оценку содержания белка VTE5 параллельно с составом токохроманола и антиоксидантной способностью в течение последующих лет. Долгосрочная цель — регулирование пути биосинтеза токохроманолов с целью увеличения их содержания во время сбора урожая оливок для производства оливкового масла. Образцы были собраны на восьми стадиях развития на дереве (10–30 WAF) плодов оливы ( Olea europaea cv.Koroneiki) за три последовательных года роста, в конечном итоге стремясь исследовать любые различия между последовательными годами роста.

Материалы и методы

Материал плодов и схема отбора проб

Оливковые плоды собирали в течение трех лет подряд с четырех оливковых деревьев (сорт «Коронейки»), содержащихся в экспериментальном саду Средиземноморского агрономического института Ханьи (MAICh), Крит. Были записаны подробные метеорологические данные (температура, количество осадков и относительная влажность) на протяжении всех лет выращивания (дополнительные рисунки S2 и S3; таблица 1).Отобранные растения представляли собой продуктивные оливковые деревья (25–30 лет) сорта. «Коронейки» со схожими особенностями осанки и созревания. Средняя высота четырех оливковых деревьев составляла 4,01 м, а средний диаметр кроны — 4,87 м. Четыре оливковых дерева были примерно одинакового размера, и плоды, которые они приносили, были примерно на одной стадии. Оливковые деревья не подрезали, не удобряли и не орошали, но они получали естественные осадки в течение 3-летнего периода отбора проб. Деревья были выбраны и маркированы, а отбор плодов оливок всегда производился между 9 и 10 часами утра.м. Все пробы систематически отбирались по периметру от короны на высоте 1,7 м. Было собрано и объединено примерно 25 плодов оливы с дерева (Roca and Mínguez-Mosquera, 2003). Впоследствии мезокарпий отделяли от семян, замораживали в жидком азоте, измельчали ​​до мелкого порошка с помощью ступки и пестика и хранили при -80 ° C.

ТАБЛИЦА 1. Средняя температура воздуха (Tair) ° C и общее количество осадков в течение 10–30 WAF для каждого из трех последовательных лет в экспериментальном саду.

Первоначально особи были разделены на восемь сезонных фаз с середины июля до начала декабря в течение трех последовательных лет роста (дополнительная таблица S1). Полное цветение было в конце мая каждого последующего года и соответствует 0 WAF. Стадии развития ( S ₁ — S ₈ ) соответствовали 10–30 WAF (дополнительная таблица S2) в соответствии с фенологическими стадиями роста оливковых деревьев, по данным Biologische Bundesanstalt Bundessortenamt Industries Chemischerie (BBCH) ( Sanz-Cortes et al., 2002). Стадия развития мезокарпия соответствует 10–22 WAF, а стадия созревания плодов оливы соответствует 22–30 WAF (Conde et al., 2008; Alagna et al., 2009).

Экстракция РНК и обработка рДНазой

экстрагировали из трех независимых объемных образцов 100 мг оливковой ткани в соответствии с протоколом, разработанным Christou et al. (2014) и обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКаз (каталожный номер NU01a, HT Biotechnology LTD, Англия), для удаления гДНК.Вкратце, 0,5 мкл (1 единица) ДНКазы I (без РНКазы) добавляли к экстрактам и добавляли ddH ₂ O до конечного объема 50 мкл. Образцы смешивали и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Фермент инактивировали нагреванием при 75 ° C (5 мин) и объем увеличивали до 150 мкл добавлением ddH ₂ O. Затем 1/10 объема 3 M CH ₃ COONa (pH = 4,8 ) и 2,5 объема абсолютного этанола, образцы недолго встряхивали и инкубировали при -80 ° C в течение ночи.РНК осаждали центрифугированием при 16000 × g в течение 30 мин при 4 ° C (Eppendorf Centrifuge 5415 R, Германия). Супернатант отбрасывали, и пробирки Эппендорфа сушили при 50 ° C в течение 2–3 мин. РНК растворяли в 20 мкл ddH ₂ O. Целостность РНК проверяли спектрофотометрически (Nanodrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Scientific, США) и гель-электрофорезом перед хранением при -20 ° C.

Синтез кДНК и количественный анализ ОТ-ПЦР

Для синтеза кДНК первой цепи 1 мкг общей РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора реагентов PrimeScript ^TM RT (Takara Bio, Япония) в соответствии с инструкциями производителя.Количественную ОТ-ПЦР (qRT-PCR) проводили с использованием циклического устройства для ПЦР в реальном времени Biorad IQ5 (Bio-Rad, США). Всего было выполнено три биологических повтора для каждой сезонной фазы для каждого года. Реакционная смесь содержала 4 мкл кДНК в реакционном буфере (5-кратное разведение кДНК первой цепи), 0,5 мкл каждого праймера (10 пмоль / мкл) и 5 ​​мкл 2X мастер-смеси (KAPA SYBRR FAST qPCR Kit, Kapa-Biosystems, США. ). Общий реакционный объем составлял 10 мкл. Начальная стадия денатурации проходила при 95 ° C в течение 5 минут, затем следовали 40 циклов амплификации [95 ° C в течение 30 секунд, температура отжига (Ta ° C) в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд] и заключительное удлинение. этап при 72 ° C в течение 5 мин.За циклом амплификации гена следовал прогон кривой плавления, проводя 61 цикл с шагом 0,5 ° C между 65 и 95 ° C. Были использованы праймеры для биосинтеза токохроманола ( VTE5, геранилгеранилредуктаза, HPPD, VTE2, HGGT, VTE3, VTE1 и VTE4 ), как сообщили Georgiadou et al. (2015). Температура отжига использованных праймеров находилась в диапазоне от 54 до 65 ° C, как описано Georgiadou et al. (2015). Ген UBQ2 использовали в качестве эталонного гена домашнего хозяйства (Hernández et al., 2009).

Анализ филогенетического дерева

Аминокислотные остатки O. europaea VTE5 были запрошены на гомологию с известными белками в базе данных NCBI с использованием алгоритма Blastp. Сорок девять белков (дополнительная таблица S3), которые имели сходство с фитолкиназой оливок (и также были охарактеризованы как фитолкиназы), были отобраны для построения филогенетического дерева. Выравнивание аминокислот было проведено с использованием алгоритма MUSCLE, и все позиции, в которых были пробелы, были удалены с помощью курирования выравнивания. Метод максимального правдоподобия (ML) и приблизительный тест отношения правдоподобия (aLRT) были выбраны для построения дендрограммы и для тестирования статистической поддержки длин ветвей. Все вышеупомянутые процедуры были выполнены с использованием рабочего процесса «А ля карт», реализованного на сайте http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/index.cgi, как сообщили Dereeper et al. (2008). Визуализация дерева проводилась с помощью программного обеспечения Treeview (Page, 1996; дополнительный рисунок S4).

Повышение уровня антител к VTE5, экстракция белка и иммуноблоттинг белка VTE5

Чтобы идентифицировать белок VTE5, последовательность EST OeVTE5 (Георгиаду и др., 2015) был запрошен с использованием инструмента анализа ORF (открытая рамка считывания) в базе данных NCBI. Затем были получены поликлональные антитела (PAB), нацеленные на доставленный белок (против пользовательского пептида RLLIHGLSLATDEGLVK) компанией Metabion GmbH (Германия).

Белки экстрагировали из 0,5 г плодов оливок с использованием гомогенизатора Homex 6 (Bioreba, Швейцария) и 3 мл буфера для экстракции белка [0,05% масс. / Об. Твин 20, 2% масс. / Об. ПВП, 5% об. / Об. Глицерина, 25 мМ DTT, смесь ингибиторов протеазы 1% об. / Об., Растворенная в 1x PBS (pH 7.4, 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na ₂ HPO ₄ , 0,24 г KH ₂ PO ₄ )]. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Брэдфорда (Bradford, 1976). Экстракты общего белка смешивали с 50 мкл 4x SDS-буфера для образцов [который содержал 2,0 мл (1 M) трис-HCl pH 6,8, 0,8 г SDS, 4,0 мл (100% об. / Об.) Глицерина, 1,0 мл (0,5 M) EDTA. pH 8, 8 мг бромфенолового синего, до 10 мл ddH ₂ O и 14,7 M β-меркаптоэтанола] на общий объем 100 мкл (соотношение: 1: 1). Предварительно окрашенная протеиновая лестница PiNK (NIPPON Genetics, EUROPE GmbH, MWP02, Европа) использовалась в качестве стандартов молекулярной массы.Каждый образец нагревали при 95 ° C в течение 5 мин и сразу охлаждали на льду. Белки по 20 мкл (12 мкг на лунку) разделяли с помощью 12% разделяющего геля и 5% стекирующего геля в рабочем буфере SDS (144 г глицина, 30,2 г трис-основания, 10 г SDS, разведенных в 10 раз перед использованием) при постоянном напряжении. 90 В в течение 3 часов с использованием аппарата Mini PROTEAN III (Bio-Rad, США) перед нанесением на мембрану из ПВДФ с использованием влажного блоттера при 35 В в течение 80 минут. Буфер для переноса содержал 100 мл 10-кратного буфера для переноса [15,14 г трис-основания, 72.06 г глицина, 20 мл (10% мас. / Об.) SDS], 200 мл метанола и 700 мл ddH ₂ O.

Затем мембрану окрашивали 0,1% мас. / Об. Ponceau S в 5% об. Уксусной кислоте для проверки того, что белки были перенесены на мембрану, а затем обесцвечивали промывочным буфером (0,05% об. / Об. Твин 20, растворенный в 1x PBS. ). Мембрану блокировали блокирующим раствором (2,5% обезжиренного молока, растворенного в промывочном буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем трижды промывали промывочным буфером (по 5 минут каждый).Первичное антитело VTE5 разводили в блокирующем растворе в соотношении 1/500 и инкубировали мембрану в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем его трижды промывали промывочным буфером (по 5 мин каждый). Мембрану инкубировали с вторичным антителом (конъюгированным с кроличьей HRP от Sigma, Deutschland) (разведение 1/10000) в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре, трижды промывали промывочным буфером по 2 мин каждое и смесью с усиленной хемилюминесценцией ( ECL) (Продукт 34077, Super Signal @ WestPico, Thermo Scientific, США).Мембрану помещали в систему Infinite 1500 / 36M (Vilber Lourmat, Франция) и фотографировали при УФ-облучении.

Анализ токохроманолов с помощью ВЭЖХ

Некоторое количество плодов оливы (~ 100 мг) смешивали с 1 мл ацетонитрил-метанол-вода (72/18/10, об. / Об. / Об.) В 2-мл пробирке Эппендорфа. Смесь встряхивали в темноте в течение 15 минут при 60 ° C, используя настольный шейкер Lab Companion SI-600R, после 5 минут предварительной инкубации. Затем смесь центрифугировали при 16000 × g в течение 5 минут при 4 ° C (Eppendorf Centrifuge 5415 R, Германия), и супернатант собирали и хранили при -20 ° C до анализа ВЭЖХ (Gruszka and Kruk, 2007). Хроматографическое разделение проводили на системе HPLC серии Waters (модель «e2695»), оснащенной вакуумным дегазатором, четвертичным насосом, автосэмплером, термостатируемым отделением колонки и мультифлуоресцентным детектором. Сбор и анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения Empower (Waters Corporation, Милфорд, Ирландия). Экстракты загружали в колонку с обращенной фазой XTerra RP18 (5 мкм; 4,6 мм × 250 мм) (Waters Corporation, Милфорд, Ирландия). Скорость потока составляла 0,8 мл мин. ^-1 , а объем впрыска составлял 20 мкл.Изократическое элюирование также проводили с использованием подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила / метанола / 2-пропанола (40/55/5, об. / Об. / Об.). Элюирование токохроманолов регистрировали при длине волны возбуждения 292 нм и длине волны испускания 335 нм (Tsochatzis et al., 2012). Их количественная оценка проводилась с использованием шестиуровневой калибровочной кривой для каждого из исследованных токохроманолов.

Определение антиоксидантной способности

Всего было использовано три метода для определения антиоксидантной способности. Те же экстракты были использованы для первых двух методик: 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH) и 2,2′-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS). Антиоксиданты экстрагировали из образцов, используя следующую процедуру: два мл смеси этанол / н-гексан (1/1, об. / Об.) Добавляли к 0,05 г измельченной растительной ткани и встряхивали. Затем смеси помещали в ультразвуковую баню на 5 минут при 27 ° C, а затем встряхивали при 4 ° C в течение 48 часов. Затем образцы центрифугировали в течение 10 минут при 16000 × g при 4 ° C (Eppendorf Centrifuge 5415 R, Германия), и супернатант хранили в запечатанных флаконах при -20 ° C для дальнейшего анализа.Для третьего метода [способность плазмы к восстановлению железа (FRAP)] взвешивали 0,05 г измельченной ткани растения и добавляли 2 мл н-гексана. Приготовление экстрактов такое же, как для DPPH и ABTS.

Три мл свежеприготовленного раствора FRAP (0,3 моль л ^-1 ацетатный буфер (pH 3,6), содержащий 10 ммоль л ^-1 TPTZ и 40 ммоль л ^-1 FeCl ₃ ^∗ 10 H ₂ O) добавляли к 100 мкл каждого экстракта n -гексана (0. 05 г / 2 мл) и встряхивали на Polytron. Образцы инкубировали при 37 ° C в течение 4 минут и центрифугировали в течение 30 секунд при 16000 × g при 4 ° C (Eppendorf Centrifuge 5415 R, Германия) для разделения слоев. Наконец, абсорбция водной фазы была измерена при 595 нм, и общая антиоксидантная способность была выражена как мкмоль α-токоферола / г FW. Калибровочная кривая была построена с использованием свежеприготовленных растворов α-токоферола (63–1000 мкмоль L ^-1. ) (Muller et al., 2011).

Для анализа DPPH, 0.6 мл экстракта [0,05 г / 2 мл этанола / n -гексан (1/1, об. / Об.)] Смешивали с 0,3 мл 0,3 ммоль л этанольного этанольного раствора DPPH ^-1 (хранили при 4 ° C). ). Смесь встряхивали, помещали в темноту на 30 мин и измеряли оптическую плотность раствора при 515 нм; общая антиоксидантная способность рассчитывалась как мкмоль α-токоферола / г Ж. Калибровочная кривая была построена с использованием свежеприготовленных растворов α-токоферола (4,5–114 мкмоль л ^-1 ) (Muller et al. , 2010).

Катион-радикал ABTS (ABTS ^.+ ) получали путем взаимодействия 7 мМ исходного раствора ABTS с 2,45 мМ персульфата калия (конечная концентрация) и выдерживания смеси в течение ночи в темноте при комнатной температуре. После инкубации раствор разбавляли этанолом (липофильный анализ) до поглощения при 734 нм 0,70 (± 0,02). Для фотометрического анализа 10 мкл раствора антиоксиданта [0,05 г / 2 мл этанола / n -гексан (1/1, об. / Об.)] Смешивали в течение 45 с с 1 мл разбавленного раствора ABTS ^{⋅ +} и оптическую плотность при 734 нм определяли после 5 мин инкубации при 30 ° C.Калибровочную кривую строили с использованием свежеприготовленных растворов α-токоферола (7,81–1000 мкмоль л ^–1 ). Результаты выражали в мкмоль α-токоферола / г сырой воды (Jemai et al., 2009).

Статистический анализ

Относительные уровни транскриптов были рассчитаны с использованием программного обеспечения REST-XL, как сообщили Pfaffl et al. (2002). Ген UBQ2 использовался в качестве эталонного гена домашнего хозяйства, а 10 WAF для каждого года использовались для калибровки.

Статистический анализ для анализа с помощью ВЭЖХ-флуоресцентного детектора и анализов антиоксидантной способности проводили с использованием программного пакета SPSS v17.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Сравнение средних значений для каждого лечения было основано на дисперсионном анализе в соответствии с критерием множественного диапазона Дункана на уровне значимости 5% ( P ≤ 0,05). Результаты, полученные с помощью анализа детектора ВЭЖХ-флуоресценции, представлены в виде относительных уровней метаболитов на основе 10 WAF за каждый год.

Результаты

BLAST в базах данных NCBI и OLEA EST db привел к идентификации одной кДНК для генов VTE5 нескольких видов.Выведенные аминокислотные последовательности VTE5 выявили высокое сходство с гомологами других растений, предполагая, что VTE5 консервативен среди растений (дополнительная таблица S3). Это было дополнительно проиллюстрировано филогенетическим анализом всех исследованных компонентов пути, где OeVTE5 сгруппированы вместе с другими изоформами VTE5 из других однодольных и двудольных растений (дополнительный рисунок S4).

Расшифровка изобилия биосинтетических генов витамина Е во время развития и созревания плодов

В течение 1 ^-го года наблюдалась общая картина подавления биосинтетических генов токоферола и токотриенола в мякоти плодов (Рисунок 1; Дополнительные рисунки S5-S7).Уровни транскрипта VTE5 снижались во время развития мезокарпия (14–22 WAF) и фазы созревания (22–30 WAF), причем наибольшее снижение наблюдалось в фазе созревания в корреляции с понижением температуры воздуха и увеличением количества осадков. Транскрипты геранилгеранилредуктазы подавлялись, причем наибольшее снижение наблюдалось после 14-20 WAF (изменение в -2,49, -2,32 и -3,18 раза). HPPD показал понижающую регуляцию во всех исследованных WAF, кроме 16 WAF, при этом наибольшее снижение наблюдалось после 20 WAF. Уровни транскриптов VTE2 и HGGT в 1 ^{-м году} показали постепенное снижение во всех WAF. Наибольшее снижение для обоих генов наблюдалось при 20 WAF. Кроме того, уровни мРНК VTE3 были подавлены, причем наибольшее снижение наблюдалось на 20, 22 и 26 WAF в 1 ^-й -й год. Уровни VTE1 и VTE4 подавлялись на протяжении всего развития и созревания плодов. В частности, VTE1 показал максимальное снижение на 20, 24 и 26 WAF.Паттерн транскриптов VTE4 можно считать уникальным среди всех генов, участвующих в пути витамина Е, из-за флуктуированного паттерна на последних стадиях (Рисунок 1; Дополнительные Рисунки S5 – S7).

РИСУНОК 1. Тепловая карта, показывающая образец экспрессии временного транскрипта пути биосинтеза витамина Е в плодах оливы (сорт «Коронейки») в течение 10–30 WAF для каждого из трех последовательных лет в экспериментальном саду. Относительное количество мРНК оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием трех биологических повторов. Повышающая регулировка обозначена зеленым цветом; понижающее регулирование обозначено красным. Диагональная линия в рамке указывает на статистически значимое значение ( P ≤ 0,05). Шкала интенсивности цвета представлена ​​в виде легенды. Фактические относительные значения транскриптов показаны на дополнительных рисунках S5 – S7. Значения, которые отличаются от сезонной фазы на 10 WAF за каждый год, используются в качестве справочных.

В течение 2 ^-го года уровни мРНК VTE5 демонстрировали сходные паттерны с 1 ^{-м годом} ; однако, временная повышающая регуляция была обнаружена для конкретных генов ( геранилгеранилредуктаза, HPPD, VTE1 и VTE4 ) по сравнению с 1 ^{-м годом} (Рисунок 1; Дополнительные рисунки S5 – S7).Примечательно, что g эранилгеранилредуктаза проявляла повышающую регуляцию, достигая пика при 20, 26 и 30 WAF в 2 ^-й год. HPPD был понижен на 14 и 16 WAF и повышен, начиная с 20 WAF. Наивысшие уровни транскрипции наблюдались при 20, 22 и 30 WAF соответственно. Уровни транскриптов VTE2 и HGGT показали подавление регуляции, и наибольшее снижение для обоих генов наблюдалось при 14 и 22 WAF. Уровни мРНК VTE3 следовали аналогичному паттерну транскрипции с 1 ^{-м годом} , и наибольшее снижение было зарегистрировано на стадии созревания (22 и 26 WAF).Транскрипция VTE1 и VTE4 на 2 ^{-м году} обнаружила повышенную регуляцию с прогрессом стадий развития на дереве. В частности, VTE1 показал самые высокие уровни мРНК при 20 WAF, а транскрипция VTE4 достигла пика при 20, 24 и 30 WAF.

В целом, транскрипция генов биосинтеза токохроманола постепенно увеличивалась на всех стадиях развития в течение 3 ^года года, за исключением гена фитолкиназы (VTE5 ) (Рисунок 1; Дополнительные рисунки S5 – S7).Уровни транскрипта VTE5 демонстрировали сопоставимые модели с 1 ^-м и 2 ^-м годом, где значительное подавление наблюдалось после 22 WAF (стадия созревания), а самые высокие уровни подавления наблюдались при 30 WAF. Повышающая регуляция наблюдалась для геранилгеранилредуктазы с самыми высокими уровнями, обнаруженными при 20, 24, 26 и 30 WAF. Подобный паттерн транскрипции наблюдали также для HPPD с пиками транскрипции после 16 WAF, в то время как только одна стадия (14 WAF) демонстрировала профиль подавленной транскрипции.Уровни транскриптов VTE2 и HGGT были активированы на протяжении всего развития и созревания плодов с наивысшими уровнями для обоих генов на 20, 24 и 30 WAF в 3 ^-е года. VTE3 Транскрипция была постоянной от 14 WAF до 24 WAF, но быстро увеличивалась после 26 WAF до 30 WAF. Кроме того, VTE1 имел более высокое накопление мРНК в конце развития мезокарпа и стадии созревания в течение 3 ^-го года. Кроме того, этот паттерн изобилия транскриптов был сопоставим с паттерном для генов геранилгеранилредуктазы, VTE2, HGGT и VTE4 .Наконец, VTE4 был активирован во всех WAF с самыми высокими уровнями, обнаруженными после 24 WAF.

Иммуноблоттинг экспрессии белка VTE5 во время развития и созревания плодов

VTE5 было определено для восьми стадий развития в течение трех последовательных лет роста (рис. 2). Наибольшие количества белка VTE5 были обнаружены на ранних стадиях развития; 10, 14 и 16 WAF для 1 ^-го года и 10 и 14 WAF для 2 ^-го и 3 ^-го года.В течение всех лет содержание белка VTE5 постоянно снижалось во время развития мезокарпа (10–22 WAF) с небольшим увеличением на стадии разрушения (22 WAF) для 1 ^-го и 2 ^-го года. Затем снижение продолжилось во время созревания плодов оливы (22–30 WAF), за исключением заметного увеличения на 26 WAF за 2 ^-й год. По разным годам, 3 ^rd год показал общее самое низкое содержание белка VTE5. В частности, самые низкие количества белка VTE5 были обнаружены во время стадии созревания 3 ^-го года, что сопровождалось самой высокой температурой воздуха и минимальным количеством осадков, зафиксированных между тремя годами роста.

РИСУНОК 2. Вестерн-блот-анализ ткани плодов оливы, показывающий содержание белка VTE5 в пути биосинтеза витамина Е в плодах оливок (сорт «Коронейки») в течение 10–30 WAF для каждого из трех последовательных лет эксперимента. фруктовый сад. Размер белка VTE5 составлял приблизительно 30 кДа.

Количественное определение токоферолов и токотриенолов во время развития и созревания плодов

Обилие α, β, γ и δ форм токохроманолов определяли на восьми последовательных стадиях развития плодов и созревания на дереве у сорта cv.«Коронейки» через три года подряд, чтобы изучить их временную изменчивость. Обнаружены все формы токоферолов, α-токотриенола и (β + γ) -токотриенола. Альфа-токоферол был самой распространенной формой токохроманолов за все 3 года с концентрациями от 10,38 до 32,65 мг / 100 г FW по сравнению со всеми другими токоферолами и токотриенолами с концентрациями в диапазоне от 0,16 до 0,76 мг / 100 г FW Год за годом, наблюдалось небольшое общее снижение концентрации α-токоферола. С другой стороны, концентрации (β + γ) -токоферола незначительно увеличились в течение 2 ^-го -го и 3 ^-го года. Такая же тенденция к увеличению наблюдалась для δ-токоферола, α-токотриенола и (β + γ) -токотриенола. Концентрация α-токотриенола не определялась в течение 1 ^-го года, тогда как небольшие количества были обнаружены в течение 2 ^-го года и 3 ^-го года (Таблица 2).

ТАБЛИЦА 2. Метаболическое содержание (мг / 100 г Ж.В.) пути биосинтеза витамина Е в плодах оливок (cv.«Коронейки») в течение 10–30 WAF для каждого из трех последовательных лет в экспериментальном саду.

Что касается 1 ^-го года, были обнаружены все формы токоферолов и (β + γ) -токотриенола (Рисунок 3; Дополнительные рисунки S8 и S9). Относительные уровни метаболитов (по сравнению с 10 WAF) α-токоферола показали небольшое снижение (изменение в 0,80–0,88 раза) в течение периода 14–22 WAF. После 22 WAF (ранние стадии созревания плодов) уровень альфа-токоферола снизился до 30 WAF (0. Изменение в 58–0,64 раза). Интересная картина наблюдалась с содержанием метаболитов (β + γ) -токоферола. На ранних стадиях развития мезокарпия (14 и 16 WAF) наблюдалось снижение уровней метаболитов с последующим возвращением к исходной концентрации на 20 WAF, в то время как дальнейшее снижение было зарегистрировано в период позднего созревания плодов (26 и 30 WAF). . С другой стороны, содержание метаболитов δ-токоферола увеличивалось во всех WAF, за исключением 14 и 30 WAF. Подобно (β + γ) -токоферолу, наибольшее увеличение для δ-токоферола наблюдалось при 22 WAF (1.48-кратное изменение). Что касается содержания токотриенола (Рисунок 3; дополнительные рисунки S8 и S9), был обнаружен только (β + γ) -токотриенол, при этом уровни метаболитов снижались для всех WAF, причем наибольшее снижение наблюдалось при 30 WAF (изменение в 0,70 раза).

РИСУНОК 3. Тепловая карта относительных уровней метаболитов пути биосинтеза витамина Е в плодах оливы (сорт «Коронейки») в течение 10–30 WAF. Относительные уровни метаболитов оценивали с помощью ВЭЖХ с использованием трех биологических повторов.Шкала интенсивности цвета представлена ​​в виде легенды. Фактические относительные уровни метаболитов, полученные в трех независимых повторах, показаны на дополнительных рисунках S8 и S9. Альфа-токотриенол в течение 1 ^-го года и дельта-токотриенол не обнаруживались. Относительные уровни метаболитов на основе 10 WAF на каждый год.

За 2 ^-й год были обнаружены все формы токоферолов и (β + γ) -токотриенола (Рисунок 3; Дополнительные рисунки S8 и S9). Относительные уровни метаболитов (на основе 10 WAF) α-токоферола незначительно снизились (0.60–0,76-кратное изменение) во время развития мезокарпа (14–22 WAF) и даже дальнейшее снижение до 30 WAF (0,42–0,49-кратное изменение). С другой стороны, содержание метаболитов (β + γ) -токоферола очень мало изменилось по всем WAF, с незначительным увеличением в течение 20–24 и 30 WAF и незначительным уменьшением в течение 14, 16 и 26 WAF. Снижение уровней δ-токоферола наблюдалось на ранних стадиях развития мезокарпия (14 WAF) с последующим возвратом к исходной концентрации на 16 WAF. Дальнейшее увеличение затем наблюдалось после 20 WAF до 30 WAF.Тенденция уровня метаболитов (β + γ) -токотриенола была очень похожа на таковую для (β + γ) -токоферола. Было очень мало изменений во всех WAF с незначительным увеличением в течение 22, 24 и 30 WAF и уменьшением для остальных. Относительные уровни метаболитов α-токотриенола незначительно, но стабильно увеличивались в течение года (Рисунок 3; Дополнительные рисунки S8 и S9).

В течение 3 ^-го года все формы токоферолов и (β + γ) -токотриенола были снова обнаружены (Рисунок 3; Дополнительные рисунки S8 и S9).Относительные уровни метаболитов (по сравнению с 10 WAF) α-токоферола в целом сильно снизились во время всех WAF (изменение в 0,42–0,91 раза), при этом самые низкие уровни были зарегистрированы при 22 WAF. Снижение уровней (β + γ) -токоферола было зарегистрировано при 14, 22 и 30 WAF, за которым последовало повышение на 16–20 и 24–26 WAF. В случае δ-токоферола общее увеличение наблюдалось во всех WAF, кроме 22 WAF, где уровни были ниже. Наибольшее увеличение наблюдалось при 20 WAF (изменение в 1,25 раза). Аналогичная картина наблюдалась для (β + γ) -токотриенола с общим увеличением во время всех WAF, за исключением 22 и 30 WAF.Наибольший прирост был также отмечен на 20 WAF (изменение в 1,25 раза). С другой стороны, относительные уровни метаболитов α-токотриенола выявили интересную картину концентраций, которая включала увеличение в течение 14-20 WAF (до 1,23-кратного изменения), за которым следовало внезапное снижение на 22 WAF и еще одно небольшое увеличение. в течение 24–30 WAF (Рисунок 3; дополнительные рисунки S8 и S9).

Колебания антиоксидантной способности между разными стадиями развития и годами

Для определения антиоксидантной способности экстрактов оливок использовали три различных анализа (FRAP, DPPH и ABTS) (дополнительный рисунок S10).Все анализы показали, что антиоксидантная способность снижалась по мере прохождения стадии развития на дереве (10–22 WAF) и созревания (22–30 WAF) плодов оливы в течение всех трех лет выращивания.

Анализ FRAP показал аналогичную тенденцию для всех WAF, за исключением временного увеличения на 10 WAF в течение 1 ^-го года. Напротив, анализ DPPH показал увеличение антиоксидантной способности при 10 и 14 WAF во все три года роста. Уменьшение с 10 WAF до 14 WAF за 2 ^-й год было первоначально резким, а затем постепенно.Наконец, увеличение антиоксидантной способности при 10 и 14 WAF было обнаружено за 3 года с помощью анализа ABTS, в то время как продолжающееся снижение антиоксидантной способности было обнаружено после 16 WAF.

Обсуждение

Для изучения временного биосинтеза токохроманолов в плодах оливок во время развития деревьев и созревания в течение 3-летнего периода, был использован комбинированный набор аналитических, молекулярных, иммуноблоттинговых и антиоксидантных методов. Для сравнения, часть результатов за 1 ^{-й год} включена в недавнее исследование (Георгиаду и др., 2015), который обеспечил профиль временной транскрипции с высоким разрешением биосинтетических генов токохроманола на 17 стадиях развития. Эти стадии развития плодов оливы состоят из 8 месяцев, начиная с июня и заканчивая январем. В этом исследовании основное внимание уделяется временным профилям транскрипции генов витамина Е и количественной оценке белка VTE5 параллельно с составом токохроманола и антиоксидантной способностью в течение трех последовательных лет, и, следовательно, использовались восемь стадий развития (10–30 WAF) каждый год.

Наблюдалась общая картина подавления биосинтетических генов токохроманола ( VTE5, геранилгеранилредуктаза, HPPD, VTE2, HGGT, VTE3, VTE1 и VTE4 ) в мякоти плодов в течение 1 ^{-го года} г. повышение регуляции специфических генов ( геранилгеранилредуктазы, HPPD, VTE1 и VTE4 ) в течение 2 ^-го и 3 ^-го года общего повышения регуляции генов биосинтеза токохроманола (за исключением 21 VTE5 ). ) (Рисунок 1; дополнительные рисунки S5 – S7).Транскрипция VTE5 подавлялась во время развития мезокарпия (14–22 WAF) и фазы созревания (22–30 WAF), причем наибольшее снижение наблюдалось в фазе созревания в течение 3-летнего периода. Интересно, что значительное падение транскрипции было зарегистрировано на стадии разрыва (22 WAF). Это падение было ниже, чем у калибратора (10 WAF), и выдерживалось до 30 WAF. Подобный переход в концентрации наблюдался для токоферолов и токотриенолов (и особенно в α-токофероле) со значительно более высокими количествами до 22 WAF (для 1 ^st и 2 ^nd год) и 20 WAF (для 3 ^rd ). год) и намного ниже после этого, что указывает на тесную корреляцию с профилем транскрипции VTE5 .Более того, производство масла в плодах оливы достигает максимума в конце развития мезокарпа (Conde et al., 2008; Alagna et al., 2009; Bodoira et al., 2015). Аналогичные результаты можно найти в недавнем исследовании плодов томата (Quadrana et al., 2013) и плодов оливы (Georgiadou et al., 2015), где уменьшение транскрипта VTE5 связано со созреванием. Восстановление VTE5 напрямую ограничивает поступление фитолдифосфата [Phytyl-PP (PDP)] в биосинтез витамина Е (Quadrana et al. , 2013) и связано со снижением содержания токохроманола во время развития и созревания плодов оливы. Таким образом, VTE5 , по-видимому, играет ключевую роль в биосинтезе витамина Е в оливковых фруктах и, таким образом, предлагается в качестве маркерного гена в соответствующих исследованиях.

Аналогичные результаты с транскрипцией VTE5 наблюдались в содержании белка VTE5 (рис. 2). Наибольшие количества белка VTE5 были обнаружены на ранних стадиях развития; 10, 14 и 16 WAF для 1 ^-го года и 10 и 14 WAF для 2 ^-го и 3 ^-го года.В течение всех лет содержание белка VTE5 постоянно снижалось во время развития мезокарпа (10–22 WAF) с небольшим увеличением на стадии разрушения (22 WAF) для 1 ^-го и 2 ^-го года. Затем снижение продолжилось во время созревания плодов оливы (22–30 WAF), за исключением заметного увеличения на 26 WAF за 2 ^-й год. По разным годам, 3 ^rd год показал общее самое низкое содержание белка VTE5. Уровни транскрипции VTE5 демонстрировали аналогичное поведение в первый и 2 ^-й года, где наблюдалась значительная понижающая регуляция во всех WAF со значительным падением транскрипции после 22 WAF (причем наиболее резкое снижение было зарегистрировано на 26 WAF из 2 ^-й год) и выдержал до 30 WAF (результаты содержания белка VTE5 также показали снижение белка вместе с развитием и созреванием плодов оливы).Возможно, что молекула белка VTE5 может иметь более длительный период полужизни и более короткую скорость оборота по сравнению с соответствующими мРНК в соответствии с ранее продемонстрированными универсальными тенденциями свойств молекул, которые показывают, что белки в целом имеют более высокий средний период полужизни по сравнению с соответствующими мРНК (Schwanhäusser и др., 2011). Более того, существует вероятность существования дополнительных изоформ VTE5 либо в виде аллелей того же гена, либо в виде генных продуктов дополнительных генов VTE5. В этом случае содержание белка VTE5 не может быть связано исключительно с экспрессией гена VTE5. Однако уровни транскрипции VTE5 для 14 WAF были повышены в течение 3 ^-го года по сравнению с предыдущими годами (что согласуется с большими количествами белка VTE5 в 14 WAF). Содержание витамина Е немного снижается до конца развития мезокарпия, а затем резко снижается во время созревания плодов оливы (22–30 WAF). Эта закономерность сохраняется на протяжении всех 3 лет, что свидетельствует о том, что VTE5 играет важную роль. В этот период также снижается содержание хлорофилла в плодовых мезокарпиях (Alagna et al., 2009). Однако производство оливкового масла снижается после 22 WAF вместе с содержанием витамина Е. В начале стадии разжижения (22 WAF) процессы углеводного обмена, биосинтеза жирных кислот и триацилглицеринов (ТАГ) более очевидны и могут влиять на содержание масла и витамина Е. Фитол может быть преобразован в фитил-P, затем в фитил-PP, и в итоге вырабатывается хлорофилл, филлохинон (витамин K) и токоферолы. Кроме того, активная жирная ацильная группа может ограничивать свободный фитол за счет реакции ацилтрансферазы и вызывать синтез сложного эфира жирной кислоты и фирола (Ischebeck et al. , 2006). В соответствующих исследованиях сообщается, что деградация хлорофилла приводит к большей части фитил-PP для биосинтеза токоферола в семенах Arabidopsis (Ischebeck et al., 2006; Valentin et al., 2006).

Альфа-токоферол был наиболее распространенной формой токохроманолов за все 3 года по сравнению со всеми другими токоферолами и токотриенолами, в соответствии с предыдущими исследованиями (Hassapidou and Manoukas, 1993; Bruno et al., 2009; Muzzalupo et al., 2011; Bodoira и др., 2015). Концентрация альфа-токоферола в целом имеет тенденцию к снижению как внутри, так и по годам (таблица 2).Сообщалось о высоком содержании токохроманола на ранних стадиях развития плодов оливы (сорт «Арауко»), за которым следует тенденция к снижению по мере развития плодов на дереве (Bodoira et al., 2015). В течение каждого года самые высокие концентрации α-токоферола наблюдались в период 10–22 WAF (развитие плодов) с максимальным содержанием, обнаруженным при 10 WAF (Рисунок 3; Дополнительные рисунки S8 и S9). Содержание альфа-токоферола резко снизилось на ранних стадиях созревания плодов, после 22 WAF, и оставалось на таком уровне до 30 WAF.В ряде отчетов наблюдалось, что производство оливкового масла и фенольная фракция увеличиваются и достигают наивысшего уровня к концу развития мезокарпа (22 WAF), что связано с началом изменения цвета (Conde et al., 2008; Alagna et al., 2009; Sakouhi et al., 2011; Bodoira et al., 2015). Более того, углеводный обмен (гликолиз / гликонеогенез, цитратный цикл, метаболизм фруктозы, манозы и галактозы) более распространен во время развития мезокарпия.

Концентрация всех токохроманолов, кроме α-токоферола, была в целом ниже в течение 1 ^-го года по сравнению с концентрацией, зарегистрированной в течение 2 ^-го года и 3 ^-го года.Однако, учитывая подавляющее содержание альфа-токоферола (~ 92,16 ± 0,71% от общего количества токохроманолов за 3 года), общая концентрация токохроманолов снижалась год за годом. Эти результаты были аналогичны результатам Muzzalupo et al. (2011), которые обнаружили, что альфа-токоферол составляет до 68–89% от общего содержания токоферола в плодах оливы в зависимости от сорта и стадии развития. Результаты также согласуются с данными Georgiadou et al., 2015, которые показали, что α-токоферол составляет 95,6–97,9% в cv.«Коронейки» общего содержания токохроманолов. Разница по сравнению с данными Bodoira et al. (2015) заключается в том, что концентрация гамма-токоферола лишь немного ниже, чем у альфа-токоферола на ранних стадиях плодов оливы (сорта «Арауко»). В связанной работе было обнаружено, что на α-токоферол приходится 90,9% всех других токоферолов в плодах томатов (Quadrana et al., 2013) и более 80% всех других токохроманолов в сортах моркови (Luby et al., 2014). ). Кроме того, исследование содержания α- и γ-токоферола в коммерческих каперсах показало, что α-токоферол был преобладающим соединением во всех образцах со средним содержанием 66.9% (Тлили и др., 2011). Важно отметить, что также было замечено, что в винограде, неклимактерическом фрукте, таком как оливки, содержание токоферола постепенно снижалось в процессе его развития (Horvath et al. , 2006). Однако обратная картина наблюдается в климактерических фруктах, таких как манго (Singh et al., 2011) и томат (Quadrana et al., 2013), таким образом потенциально также задействуя этилен как регуляторную молекулу биосинтеза витамина E. Эта гипотеза требует дальнейшего прояснения.

В нескольких исследованиях изучалась высокая антиоксидантная способность витамина Е со специальной ссылкой на α-токоферол (Ohkatsu et al., 2001; Кармовский и др., 2015). Особая химическая структура α-токоферола, который имеет высокую степень метилирования в орто-положениях хроманольного кольца, усиливает его антиоксидантную способность. Точно так же это исследование фокусируется и подтверждает высокую антиоксидантную способность α-токоферола, особенно на ранних стадиях развития. С этой целью было использовано несколько анализов для определения антиоксидантной способности, поскольку одномерный метод не подходит для исследования антиоксидантной способности (Goulas et al., 2012). В текущем исследовании все три использованных анализа (FRAP, DPPH и ABTS) показали аналогичные результаты (дополнительный рисунок S10). Помимо наблюдаемой высокой антиоксидантной способности, была обнаружена закономерность снижения по мере развития плодов во все исследованные годы. Этот результат может быть потенциально объяснен предыдущими исследованиями, которые коррелировали снижение антиоксидантной способности во время созревания плодов оливы с расщеплением олеуропеина до глюкозида эленоловой кислоты или деметилолеуропеина эндогенными эстеразами (Goulas et al., 2012). Тем не менее, общее содержание токохроманола в плодах оливы (сорт «Коронейки») за 3 года показало умеренную корреляцию ( R = 0,750 и R = 0,636) с антиоксидантной способностью (с использованием TEAC и DPPH, соответственно). Слабая корреляция ( R = 0,454) наблюдалась между значениями FRAP и общим содержанием токохроманола. Наблюдаемую корреляцию можно объяснить тем фактом, что несколько фенольных соединений, а именно гидрокситирозол, сложные эфиры тирозола и — -дифенол, могут способствовать общей антиоксидантной способности экстракта плодов оливы (Jemai et al. , 2009).

Условия окружающей среды, по-видимому, играют важную роль в составе токохроманолов в оливковых фруктах. В частности, 1 ^-й год характеризуется достаточным уровнем воды на стадии созревания (общее количество осадков 25,20 мм / см ² для 22–30 WAF), который постепенно снижался в течение 2 ^-го года (общее количество осадков 17,40 мм). / см ² для 22–30 WAF), достигая самых низких (и потенциально стрессовых) уровней в течение 3 ^-го года (общее количество осадков 9.40 мм / см ² для 22–30 WAF) (таблица 1; дополнительный рисунок S2). Аналогичным образом, температура была самой низкой в ​​течение 1 ^-го года (средняя температура воздуха 16,28 ° C для 22–30 WAF), которая немного повысилась в течение 2 ^-го года (средняя температура воздуха 16,78 ° C для 22-30 WAF), но показали повышение температуры примерно на 2 ° C в фазе созревания, достигнув наивысшего уровня в течение 3 ^-го года (средняя температура воздуха 18,23 ° C для 22–30 WAF) (Таблица 1; Дополнительный рисунок S2). Возможно, что при попытке защиты от условий водного дефицита и повышенной температуры воздуха транскрипция генов, участвующих в биосинтезе витамина Е (за исключением VTE5 ), активируется в оливковых фруктах, что, вероятно, приводит к блокированию / деактивации этого пути. через регуляторный механизм отрицательной обратной связи (Antoniou et al., 2013), который приводит к снижению содержания токохроманолов, VTE5 и антиоксидантной способности по мере развития плодов оливы до созревания.

Прошлая работа по устойчивости растений к абиотическому стрессу показала снижение чистых уровней токоферола в результате увеличения стрессовых факторов, таких как засуха, особенно у чувствительных к стрессу растений, таких как Salvia officinalis (Munné-Bosch et al., 2001), а Pék et al. (2014) продемонстрировали увеличение содержания α-токоферола в томатах черри, выращиваемых неорошаемыми способами. Напротив, Loyola et al. (2012) продемонстрировали, что биосинтез α-токоферола является частью механизмов адаптации к стрессу засухи у Solanum chilense , генотипа дикого томата, естественно растущего в условиях дефицита воды. Наблюдаемая корреляция между сниженным содержанием альфа-токоферола во все более стрессовых условиях окружающей среды в течение трех лет роста (более низкие уровни дождя, повышенная температура) может, тем не менее, предложить другой возможный сценарий защиты в виде увеличения количества альфа-токотриенола.В предыдущих отчетах было установлено, что α-токохроманолы обладают наивысшей антиоксидантной эффективностью среди всех токохроманолов из-за их активности в качестве доноров водорода для свободных от липидов радикалов (Kamal-Eldin and Appelqvist, 1996). Хотя α-токоферол и α-токотриенол обладают одинаковой антиоксидантной способностью in vitro при анализе в гексане, было высказано предположение, что α-токотриенол обладает более высокой антиоксидантной активностью, чем α-токоферол, из-за комбинированных эффектов более высокой эффективности рециркуляции, a более равномерное распределение в мембранном бислое и более сильное разупорядочивающее действие на липиды мембран (Kamal-Eldin and Appelqvist, 1996). Следовательно, вероятно, что растения «компенсируют» снижение количества альфа-токоферола за счет увеличения содержания альфа-токотриенола в плодах оливок, поскольку условия окружающей среды становятся более стрессовыми в попытке обеспечить антиоксидантную защиту, роль, которую также поддерживают токотриенолы ». эксклюзивная локализация в семенах и фруктах (Falk and Munné-Bosch, 2010). Однако следует отметить, что общие результаты предполагают более выраженную регуляцию содержания токоферола в оливковых плодах, а не регулирование условиями окружающей среды.Эта регуляция может частично объясняться на уровне транскрипции, а также на уровне посттранскрипции в соответствии с нашими результатами по экспрессии генов и уровням белка. Более высокие уровни экспрессии по сравнению с более низким содержанием токоферолов в течение трех последовательных лет предполагают участие предполагаемых событий посттранскрипционной регуляции.

Наконец, стоит отметить, что другое возможное объяснение тенденций, наблюдаемых в настоящем исследовании, могло быть связано с чередованием плодоношения, феноменом, наблюдаемым у оливковых деревьев и который чувствителен к различным факторам окружающей среды, хотя данные по производству, подтверждающие это, отсутствуют. .У оливковых деревьев высокий урожайный год («годовой»), но сокращающийся на следующий год («негодовой») (Lavee, 2007; Turktas et al., 2013). Эмпирические наблюдения в экспериментальном саду показывают, что урожайность еще больше снизилась в течение 3 ^-го года по сравнению с 1 ^-м и 2 ^-м годами, в то время как плоды созрели раньше. Значительное снижение содержания токохроманолов, VTE5 и антиоксидантной способности в оливках, таким образом, можно частично объяснить более быстрым созреванием, наблюдаемым в 3 ^-й год, что вызывает более раннюю деградацию хлорофилла и более очевидный метаболизм углеводов, биосинтез жирных кислот и триацилглицеринов (ТАГ). .Кроме того, стрессовые условия окружающей среды также могут быть причиной более низкого урожая оливок, наблюдавшегося в течение 3 ^-го года (Lavee, 2007; Turktas et al., 2013).

Заключение

Это исследование описывает временную характеристику биосинтеза витамина Е в плодах оливы во время развития на дереве и созревания в течение 3-летнего периода роста. Ключевые наблюдаемые мотивы с 1 ^-го до 3 ^-го года заключались в том, что уровни транскрипции гена смещались от общего подавления к уровням индукции (исключая VTE5 ), в то время как содержание белка VTE5, содержание токохроманола и антиоксидантная способность снижались как на разных стадиях развития, так и на разных стадиях развития. через три года подряд.В дополнение к влиянию сигналов развития наблюдаемые тенденции коррелируют с изменяющимися условиями окружающей среды с постепенным повышением температуры воздуха и уменьшением количества осадков, особенно во время фазы созревания плодов, в течение трехлетнего периода. Поэтому предполагается, что, пытаясь отреагировать на стрессовые условия, растение индуцирует транскрипцию большинства генов, участвующих в биосинтезе витамина Е, что, вероятно, приводит к блокированию этого пути через регуляторный механизм отрицательной обратной связи, что в конечном итоге приводит к снижению содержания токохроманола. и общая антиоксидантная способность. Таким образом, настоящие результаты подчеркивают важную регулирующую роль условий окружающей среды во время биосинтеза витамина Е. Необходимы дальнейшие исследования для решения этих проблем, таких как воздействие на плоды оливок теплового стресса и стресса засухи, а также изучение того, как эти условия изменяют путь биосинтеза токоферолов.

Авторские взносы

Задумал и спроектировал эксперименты: GM, PK и VF. Проведены эксперименты: ЭГ, ВГ, ТН. Проанализированы данные: EG, VG и VF.Написал статью: EG, GM, PK и VF. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарность

EG частично финансировался Фондом Левентиса. Эта исследовательская статья финансировалась Фондом авторов открытого доступа Кипрского технологического университета.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01656/full#supplementary-material

Сноски

1. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

Сокращения

DMGGBQ, 2,3-диметил-6-геранилгеранил-1,4-бензохинол; DMPBQ, 2,3-диметил-6-фитил-1,4-бензохинол; GGPP или GGDP, геранилгеранилпирофосфат или геранилгеранилдифосфат; HGA, гомогентизиновая кислота; HGGT, гомогентизатгеранилгеранилтрансфераза; HPP, п- или 4-гидроксифенилпировиноградная кислота; HPPD, п- или 4-гидроксифенилпируват диоксигеназа; HPT или VTE2, гомогентизатфитилтрансфераза или витамин E2; MGGBQ, 2-метил-6-геранилгеранилбензохинол; MPBQ, 2-метил-6-фитилбензохинол; MPBQ MT или VTE3, 2-метил-6-фитил-1,4-бензохинолметилтрансфераза или витамин E3; фитил-P или PMP, фитилфосфат; фитил-PP или PDP, фитилдифосфат; TC или VTE1, токоферолциклаза или витамин E1; TPTZ, 2,4,6-трипиридил-втор-триазин; UBQ2, полиубиквитин2; VTE5, фитолкиназа или витамин E5; WAF через несколько недель после цветения; γ-TMT или VTE4, γ-токоферолметилтрансфераза или витамин E4.

Список литературы

Аггарвал Б. Б., Сундарам К., Прасад С. и Каннаппан Р. (2010). Токотриенолы, витамин Е 21 века: его потенциал против рака и других хронических заболеваний. Biochem. Pharmacol. 80, 1613–1631. DOI: 10.1016 / j.bcp.2010.07.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аланья, Ф., Д’Агостино, Н., Торчиа, Л., Сервили, М., Рао, Р., Пьетрелла, М., и др. (2009). Сравнительное пиросеквенирование 454 транскриптов двух генотипов оливок во время развития плодов. BMC Genomics 10: 399. DOI: 10.1186 / 1471-2164-10-399

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Антониу К., Филиппоу П., Милона П., Фасула Д., Иоаннидес И., Полидорос А. и др. (2013). Применение нитропруссида натрия в зависимости от стадии развития и концентрации приводит к регуляции нитратредуктазы и модификации нитратного метаболизма в листьях растений Medicago truncatula . Завод Сигнал. Behav. 8: e25479. DOI: 10.4161 / psb.25479

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бодойра, Р., Торрес, М., Пьерантоцци, П., Татички, А., Сервили, М., и Маэстри, Д. (2015). Биогенез масла и антиоксидантные соединения из оливкового сорта оливы «Арауко» ( Olea europaea L.) в процессе развития и созревания плодов. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 377–388. DOI: 10.1002 / ejlt.201400234

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брэдфорд, М.М. (1976). Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Анал. Биохим. 72, 248–254. DOI: 10.1016 / 0003-2697 (76)