Средний

картон масло

Рабочий размер

$ 1,700

Год

2012

Цена

$ 1,700

Статус работы

Параметры отображения

Ранг работы

9

Рейтинг страницы художника

9

• Stella Downer Fine Art
• Веллингтон-стрит, 1/24, Ватерлоо, 2017
• Часы работы: вторник – пт 10–17, сб 11–17


• T: +61 (0) 402 018 283
• E: info @ stelladownerfineart. com.au
• Член Ассоциации художественных галерей Австралии (AGAA)

Меню нижнего колонтитула

• Авторские права © Стелла Даунер Изобразительное искусство, 2021 г.
• Ссылки
• Условия
• Конфиденциальность
• Присоединиться к нашему списку рассылки
• Отписаться от рассылки
• Сайт разработан Norton Design

Социальные сети

• Instagram
• Твиттер
• Facebook

| Thermo Fisher Scientific

Тестирование эффективности антител против генетически модифицированных образцов

Проверка * специфичности антитела имеет решающее значение для обеспечения отсутствия неспецифического связывания и, следовательно, наивысшего уровня функциональности. Тестирование эффективности антител против генетически модифицированных образцов — один из способов проверить, распознает ли антитело конкретную мишень. Это можно сделать с помощью различных методов, включая модели нокаута мышей, доминантно-отрицательные мутанты, морфолино, миРНК и, самое последнее, редактирование генов. Thermo Fisher Scientific стремится предоставить самые лучшие доступные антитела. В настоящее время мы повторно тестируем весь портфель антител Invitrogen, чтобы убедиться, что они специфичны для указанных целей.

Расширенная проверка

Значок расширенной проверки применяется к продуктам, прошедшим тестирование приложений и специфичности. Расширенное верификационное тестирование антител Invitrogen продолжает расширяться по всему портфолио. Антитело без значка следует рассматривать как антитело, которое еще не прошло тестирование, а не как отражение специфичности продукта. Этот значок можно найти в результатах поиска и в верхней части веб-страниц, посвященных конкретным продуктам. Данные, поддерживающие значки расширенной проверки, можно найти в галереях данных по конкретным продуктам.

CRISPR-Cas9 в моделях нокаутных клеток

Используя систему CRISPR-Cas9, ученые могут создавать модели нокаутных клеток, которые впоследствии могут использоваться в качестве надежных средств контроля для проверки специфичности антител. Система CRISPR-Cas9 использует некодирующую молекулу одиночной направляющей РНК (sgRNA) для «направления» CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы Cas9 к намеченному целевому гену, где она расщепляет ДНК. Это расщепление ДНК приводит к нокауту целевого гена. Таким образом, технология CRISPR-Cas9 используется для подавления экспрессии целевого белка в соответствующих клеточных моделях, что делает его подходящим отрицательным контролем для проверки специфичности антитела (, рисунок 1, ).

CRISPR-Cas9 также можно использовать для одновременного тестирования специфичности антител к множеству сигнальных белков в пути путем отключения экспрессии вышестоящих медиаторов. Эта возможность мультиплексирования позволяет упростить и высокопроизводительную проверку антител. Учитывая это преимущество, технология CRISPR-Cas9 становится предпочтительным решением для проверки антител путем генетической модификации.

Рис. 1. Схема проверки специфичности антитела, опосредованной нокаутом CRISPR-Cas9.

В приведенном ниже примере специфичность антитела была продемонстрирована путем нокаута белка-мишени, опосредованного CRISPR-Cas9. Потеря сигнала наблюдалась для белка-мишени в линии клеток с нокаутом (KO) ErbB2 (HER-2) с использованием мышиного моноклонального антитела против ErbB2 (HER-2) (каталожный номер MA5-15702).

Рис. 2. Вестерн-блот-анализ ErbB2 (HER-2) ( Рис. 2 a ) проводили путем загрузки 30 мкг SK-BR-3 Control (дорожка 1) и SK-BR-3 ErbB2. нокаут (дорожка 2) экстракты целых клеток.ErbB2 (HER-2) был обнаружен при 185 кДа с использованием мышиного моноклонального антитела ErbB2 (HER-2) (каталожный номер MA5-15702, разведение 1: 500) и козьего антимышиного IgG (H + L) суперклонального вторичного антитела HRP. конъюгат (Кат. № A28177, разведение 1: 4000). Денситометрический анализ этого вестерн-блоттинга показан на гистограмме (, рис. 2, b, ). Потеря сигнала при нокауте, опосредованном CRISPR (KO), подтверждает, что антитело специфично к ErbB2 (HER-2).

В приведенном ниже примере иммунофлуоресцентный анализ EGFR был проведен на 70% конфлюэнтных клетках A431 в логарифмической фазе.Специфичность антител была продемонстрирована путем нокаута целевого белка, опосредованного CRISPR-Cas9. Потеря экспрессии EGFR наблюдалась в линии клеток с нокаутом EGFR по сравнению с контрольной линией клеток с использованием моноклонального антитела EGFR (h21) (каталожный номер MA1-12693).

Рис. 3. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут, пропитывали 0,1% Тритоном X-100 в течение 10 минут и блокировали 1% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки метили мышиным моноклональным антителом EGFR (кат.No. MA1-12693) в концентрации 2 мкг / мл в 0,1% BSA и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре, а затем метили суперклональными вторичными антителами козьих антител против мышиного IgG (H + L), конъюгатом Alexa Fluor 488 (Кат. A28175) при разведении 1: 2000 в течение 45 минут при комнатной температуре. Ядра (синие) окрашивали SlowFade Gold Antifade Mountant DAPI (каталожный № S36938). F-актин (красный) окрашивали родамином фаллоидином (каталожный № R415, 1: 300). Сигнал EGFR наблюдали в контрольной клеточной линии (панели a-d), но не в линии клеток с нокаутом EGFR (KO) (панели f-i).Панели e и j представляют соответствующие элементы управления без первичных элементов.

Рис. 4. Рабочий процесс CRISPR-Cas9 для демонстрации специфичности антител.

РНКи в стратегиях нокдауна

Технология РНК-интерференции (RNAi) использует преимущества естественного механизма клетки для эффективного подавления экспрессии интересующего гена. Это широко используемый метод проверки специфичности антител.

В клетках млекопитающих короткие фрагменты двухцепочечной РНК, иначе известные как короткие интерферирующие РНК (миРНК), инициируют деградацию или нокдаун конкретной целевой клеточной мРНК. В этом процессе антисмысловая цепь дуплекса миРНК становится частью мультибелкового комплекса, называемого РНК-индуцированным комплексом подавления (RISC). Затем RISC идентифицирует комплементарную мРНК и расщепляет ее в определенном месте. Затем это расщепленное сообщение подвергается деградации, что в конечном итоге приводит к потере экспрессии белка.

Существуют разные методы проведения экспериментов с РНКи. РНКи может быть достигнута путем трансфекции клеток-мишеней пулом синтетических малых РНК или пулом миРНК, полученным посредством расщепления in vitro ( in vitro, разделение РНК-мишени).РНКи также может быть получена путем трансфекции клеток векторами короткой шпилечной РНК (кшРНК). shRNA процессируется внутри клетки, и siRNA, генерируемая in vivo, затем может нацеливаться на ее специфическую молекулу мРНК для деградации. Для проверки специфичности нокдауна можно использовать нецелевые элементы управления.

Рисунок 5. Принцип siRNA-опосредованного нокдауна мРНК-мишени. На рисунке показано использование in vitro -синтезированной миРНК в типичном эксперименте с РНКи.

В приведенном ниже примере миРНК Invitrogen Silencer Select трансфицируют в клетки в 96-луночном формате с последующей RT-qPCR.Наиболее эффективный нокдаун (в зависимости от типа клеток и условий трансфекции siRNA) определяется с помощью анализа экспрессии генов. Выбранный скрининг затем масштабируется для подтверждения специфичности антител с помощью вестерн-блоттинга и иммуноцитохимии (ICC).

План трансфекции SiRNA

Рис. 6. Схема стратегии нокдауна, используемой для проверки специфичности антител.

Фигура 7. Вестерн-блоттинг для проверки антител. (A) Вестерн-блоттинг, показывающий нокдаун SMAD2 (дорожка 3) в лизатах целых клеток HeLa после трансфекции siRNA, нацеленной на SMAD2, с использованием моноклональных кроличьих антител Invitrogen SMAD2 ABfinity (каталожный № 700048). Нокдаун показан вместе с необработанной и скремблированной РНК в качестве контроля на дорожках 1 и 2 соответственно. Обнаружение актина использовали в качестве контроля загрузки. (B) Относительное количественное определение нокдауна полос SMAD2 на вестерн-блоте по сравнению с необработанной и скремблированной миРНК в качестве положительного контроля.Интенсивность каждой полосы нормализована с использованием относительной интенсивности полос актина.

Фигура 8. Иммуноцитохимия для проверки антител: Нокдаун CHD7 был достигнут путем трансфекции клеток SH-SY5Y с помощью миРНК, специфичной для CHD7 (Silencer select Cat. No. s31140, s529331). Иммунофлуоресцентный анализ выполняли на нетрансфицированных клетках SH-SY5Y (панель a, d), трансфицированных неспецифической скремблированной siRNA (панель b, e) и CHD7-специфической siRNA (панель c, f).Клетки фиксировали, повышали проницаемость и метили поликлональным антителом CHD7 (каталожный номер PA5-72964, разведение 1: 100), затем козьим суперклональным вторичным антителом против кроличьего IgG (H + L), конъюгатом Alexa Fluor 488 (кат. № A27034, 1: 2000). Ядра (синие) окрашивали, используя ProLong Diamond Antifade Mountant с DAPI (Кат. № P36962), и Родамин Фаллоидин (Кат. № R415, 1: 300) использовали для окрашивания цитоскелета F-актином (красный). Снижение специфического сигнала наблюдали при KD, опосредованном siRNA (панель c, f), подтверждая специфичность антитела к CHD7.

Проверка целевой специфичности антител Invitrogen с использованием генетически модифицированных образцов

Антитела Invitrogen, которые были проверены на генетически модифицированных образцах для связывания их мишени, отмечены символом «подтвержденная специфичность» в результатах поиска и на соответствующих страницах продуктов. Данные, подтверждающие подтверждение, будут представлены на каждой странице продукта.

* Использование или любое изменение слова «проверка» относится только к антителам с исследовательским использованием, которые были подвергнуты функциональному тестированию для подтверждения того, что антитело можно использовать с указанными исследовательскими методами. Это не гарантирует, что продукт (ы) был одобрен для клинического или диагностического использования.

Процедура нокдауна и обоснование анализа. A, чтобы сбить ERV …

Контекст 1

… являются конечным результатом серии генетических событий, которые включают не только трансформацию клеток как таковую, но также модификации взаимодействий между трансформированными клетками и гостья. В частности, теперь признано, что развивающиеся опухоли возникают из-за фракции трансформированных клеток, которые приобрели способность избегать иммунного надзора (см.1–3). Молекулярные основы приобретения иммунорезистентного фенотипа до конца не изучены, хотя были описаны несколько механизмов, в том числе подавление антигенов MHC класса I (2) и повышение уровня факторов, ингибирующих апоптоз (3). В этом направлении мы ранее показали, что введение вектора экспрессии для гена оболочки (env) инфекционного мышиного ретровируса может вызвать ускользание от иммунного надзора в клетках, которые в противном случае отторгаются после приживления иммунокомпетентным мышам (4). Подобные эффекты наблюдались с геном env эндогенного ретровируса человека (ERV; ссылка 5). ERV, которые занимают большую часть геномов млекопитающих, представляют собой геномные следы древних ретровирусных инфекций, которые достигли зародышевой линии, а интегрированные провирусы затем передаются менделевским способом (см. Ссылки 6, 7). Большинство этих последовательностей накопили точечные мутации и делеции, но в геномах человека и мыши все еще есть сотни полноразмерных провирусных элементов, причем некоторые из них все еще содержат кодирующие гены, ответственные, например, за наблюдение вирусоподобных частиц. при некоторых опухолях (6, 8).Соответственно, мы предположили, что экспрессия эндогенных ретровирусов может быть вовлечена в прогрессирование опухоли in vivo, подрывая иммунный ответ. В этом отчете мы использовали линию спонтанных опухолевых клеток меланомы мыши и показали, что ERV, ретровирус, связанный с меланомой (MelARV), экспрессия которого спонтанно индуцируется в меланоме происхождения C57Bl / 6 (9), необходим для регуляторного T -клеточно-опосредованный иммунный уход из опухолевых клеток in vivo. изменить трансформированный фенотип клеток меланомы B16.Мы использовали подход РНК-интерференции, основанный на стабильных векторах, продуцирующих короткую двухцепочечную РНК, направленную против вирусного генома элемента MelARV и нерелевантного гена gfp в качестве контроля. Обоснование процедуры и структура используемых плазмид проиллюстрированы на рис. 1 A и B. Рисунок 1C ясно показывает, что ERV-специфичный вектор двухцепочечной РНК почти полностью устраняет экспрессию ERV в трансдуцированных клетках B16 (клетки ERV KD B16) с> 10-кратным снижением количества вирусных белков Env и Gag по сравнению с с контрольными трансдуцированными клетками (контрольные клетки B16).На следующем этапе трансформированный фенотип ERV KD и контрольных клеток B16 исследовали как in vitro, так и in vivo. In vitro мы измерили скорость роста, не зависящую от закрепления, после посева в полутвердую среду (анализ мягкого агара). Как показано на фиг. 2А, клеточная линия ERV KD B16 дала такое же количество колоний, что и контрольные клетки B16. In vivo мы проанализировали скорость роста двух популяций клеток после прививки мышам с рентгеновским облучением или мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Как показано на рис.2B, обе клеточные популяции имеют трансформированный фенотип со сходной скоростью роста. В целом эти результаты показывают, что подавление эндогенного ретровируса MelARV не влияет на трансформированное состояние клеток меланомы. иммунокомпетентные хозяева. Чтобы исследовать, могут ли опухолевые клетки подавлять противоопухолевый ответ in vivo посредством ERV-зависимого механизма, мы исследовали влияние подавления MelARV на прогрессирование опухоли путем инъекции иммунокомпетентным мышам C57BL / 6 с контролем и клетками ERV KD B16.Как показано на фиг. 3A, рост контрольных клеток B16, как и ожидалось, приводил к большим опухолям у большинства животных, тогда как клетки ERV KD B16 давали опухоли ограниченного размера и только у небольшого числа привитых мышей. Разница в росте опухолевых клеток также четко подтверждается степенью выживаемости животных (рис. 3B): уже на 70-й день 90% мышей, которым были привиты контрольные клетки B16, были убиты своей опухолью, тогда как 80% мышей, которым были привиты клетки ERV KD B16, были живы и не имели опухолей (и все еще оставались такими на 130 день).В попытке идентифицировать гены MelARV, участвующие в наблюдаемых эффектах, мы ввели обратно в клетки ERV KD B16 вектор экспрессии (без двухцепочечной РНК-целевой последовательности) для единственного гена env MelARV. Затем полученные дважды трансдуцированные клетки ERV KD + env (или контрольные) B16 прививали мышам C57BL / 6. Как проиллюстрировано на фиг. 3C, это привело к частичной реверсии эффекта нокдауна, причем уже 50% мышей с привитыми Env-экспрессирующими клетками погибали к 70 дню.Эта реверсия указывает на то, что ген env, по крайней мере частично, ответственен за ускользание от опухоли. Частичный эффект реверсии, скорее всего, объясняется более низкой экспрессией (дополнительный рис. S1) белка Env при экспрессии экзогенным вектором. восстанавливает опухолевую прогрессию клеток ERV B16. Сообщалось, что для роста опухоли B16 in vivo необходимо присутствие регуляторных Т-клеток (14, 15). С другой стороны, вирусы лейкемии мышей, тесно связанные с MelARV, также, как было показано, индуцируют регуляторные Т-клетки (16, 17).Таким образом, можно предположить, что экспрессия ERV меланомой B16 непосредственно отвечает за индукцию регуляторных Т-клеток, что приводит к прогрессированию опухоли. Чтобы проверить эту проблему, мы попытались дополнить снижение опухолевой прогрессии клеток ERV KD B16 адоптивным переносом регуляторных Т-клеток CD4 + CD25 +, выделенных от мышей C57BL / 6, прививаемых клетками B16 дикого типа. Как показано на фиг.4, перенос этих CD4 + CD25 + клеток не повлиял на прогрессирование опухоли привитых контрольных клеток B16 (фиг.4 A, слева и B), но увеличивал рост опухолевых клеток ERV KD B16 до уровней, аналогичных уровням контрольных клеток B16 (рис. 4 A, справа и B). Эти результаты, таким образом, убедительно свидетельствуют о том, что регуляторные Т-клетки являются необходимыми промежуточными продуктами для опосредованного ERV эффекта. Заключение и перспективы. Настоящие данные показывают, что опухоли способны подавлять иммунную систему, экспрессируя оболочку ERV. Блокирование экспрессии ERV приводило к усиленному отторжению опухоли, а экспрессия единственного белка оболочки ERV частично восстанавливала исходную степень прогрессирования опухоли.Мы также показываем, что регуляторных Т-клеток достаточно, чтобы линия опухолевых клеток, лишенная экспрессии ERV, могла развиваться в опухоль. В более общем плане результаты также предполагают, что опухолевые клетки, вероятно, подлежат иммуноредактированию, концепция, разработанная Dunn et al. (1) и относящиеся к иммунному надзору, как первоначально описано Burnet и Thomas (18). В самом деле, мы иллюстрируем, что развитие опухоли включает не только мутации в классических протоонкогенах или антионкогенах, но также включает активные процессы, нацеленные на непредвиденные гены, которые не влияют на состояние трансформации как таковые, такие как идентифицированный в настоящее время ген MelARV. В сочетании с классической химиотерапией или лучевой терапией, нацеливание на такие гены любыми доступными способами, включая инъекцию невекторизованной малой интерферирующей РНК, может способствовать регрессии опухоли за счет восстановления естественной способности иммунной системы отторгать опухолевые клетки и, следовательно, способствовать развитию рака. лечение. В этой связи интересно, что первая серия экспериментов с использованием синтетической малой интерферирующей РНК, нацеленной на MelARV, и инъекции i.p. Через 12 дней после приживления клеток B16 иммунокомпетентным мышам это фактически привело к ингибированию роста опухоли на одну треть по сравнению с мышами, которым вводили контрольную малую мешающую РНК, и, как показано на дополнительном рис.S2 — умеренное, но воспроизводимое увеличение задержки выживания. Наконец, следует отметить, что у людей экспрессия генов env ERV, в основном ограниченная плацентой и семенником в нормальных тканях, может наблюдаться при нескольких типах опухолей, таких как семиномы и меланомы (8, 19, 20). Более того, некоторые из полностью кодирующих генов env, которые могут быть идентифицированы в геноме человека, являются иммуносупрессивными in vivo в тесте на мышиной модели (5) и, таким образом, могут действовать как ген env MelARV, способствуя ускользанию от опухоли.Дальнейшая работа теперь должна быть направлена ​​на определение возможной роли таких генов у человека …

Контекст 2

… se, но также модификации взаимодействий между трансформированными клетками и хозяином. В частности, теперь признано, что развивающиеся опухоли возникают из-за фракции трансформированных клеток, которые приобрели способность избегать иммунного надзора (см.1–3). Молекулярные основы приобретения иммунорезистентного фенотипа до конца не изучены, хотя были описаны несколько механизмов, в том числе подавление антигенов MHC класса I (2) и повышение уровня факторов, ингибирующих апоптоз (3). В этом направлении мы ранее показали, что введение вектора экспрессии для гена оболочки (env) инфекционного мышиного ретровируса может вызвать ускользание от иммунного надзора в клетках, которые в противном случае отторгаются после приживления иммунокомпетентным мышам (4). Подобные эффекты наблюдались с геном env эндогенного ретровируса человека (ERV; ссылка 5). ERV, которые занимают большую часть геномов млекопитающих, представляют собой геномные следы древних ретровирусных инфекций, которые достигли зародышевой линии, а интегрированные провирусы затем передаются менделевским способом (см. Ссылки 6, 7). Большинство этих последовательностей накопили точечные мутации и делеции, но в геномах человека и мыши все еще есть сотни полноразмерных провирусных элементов, причем некоторые из них все еще содержат кодирующие гены, ответственные, например, за наблюдение вирусоподобных частиц. при некоторых опухолях (6, 8).Соответственно, мы предположили, что экспрессия эндогенных ретровирусов может быть вовлечена в прогрессирование опухоли in vivo, подрывая иммунный ответ. В этом отчете мы использовали линию спонтанных опухолевых клеток меланомы мыши и показали, что ERV, ретровирус, связанный с меланомой (MelARV), экспрессия которого спонтанно индуцируется в меланоме происхождения C57Bl / 6 (9), необходим для регуляторного T -клеточно-опосредованный иммунный уход из опухолевых клеток in vivo. изменить трансформированный фенотип клеток меланомы B16.Мы использовали подход РНК-интерференции, основанный на стабильных векторах, продуцирующих короткую двухцепочечную РНК, направленную против вирусного генома элемента MelARV и нерелевантного гена gfp в качестве контроля. Обоснование процедуры и структура используемых плазмид проиллюстрированы на рис. 1 A и B. Рисунок 1C ясно показывает, что ERV-специфичный вектор двухцепочечной РНК почти полностью устраняет экспрессию ERV в трансдуцированных клетках B16 (клетки ERV KD B16) с> 10-кратным снижением количества вирусных белков Env и Gag по сравнению с с контрольными трансдуцированными клетками (контрольные клетки B16).На следующем этапе трансформированный фенотип ERV KD и контрольных клеток B16 исследовали как in vitro, так и in vivo. In vitro мы измерили скорость роста, не зависящую от закрепления, после посева в полутвердую среду (анализ мягкого агара). Как показано на фиг. 2А, клеточная линия ERV KD B16 дала такое же количество колоний, что и контрольные клетки B16. In vivo мы проанализировали скорость роста двух популяций клеток после прививки мышам с рентгеновским облучением или мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Как показано на рис.2B, обе клеточные популяции имеют трансформированный фенотип со сходной скоростью роста. В целом эти результаты показывают, что подавление эндогенного ретровируса MelARV не влияет на трансформированное состояние клеток меланомы. иммунокомпетентные хозяева. Чтобы исследовать, могут ли опухолевые клетки подавлять противоопухолевый ответ in vivo посредством ERV-зависимого механизма, мы исследовали влияние подавления MelARV на прогрессирование опухоли путем инъекции иммунокомпетентным мышам C57BL / 6 с контролем и клетками ERV KD B16.Как показано на фиг. 3A, рост контрольных клеток B16, как и ожидалось, приводил к большим опухолям у большинства животных, тогда как клетки ERV KD B16 давали опухоли ограниченного размера и только у небольшого числа привитых мышей. Разница в росте опухолевых клеток также четко подтверждается степенью выживаемости животных (рис. 3B): уже на 70-й день 90% мышей, которым были привиты контрольные клетки B16, были убиты своей опухолью, тогда как 80% мышей, которым были привиты клетки ERV KD B16, были живы и не имели опухолей (и все еще оставались такими на 130 день).В попытке идентифицировать гены MelARV, участвующие в наблюдаемых эффектах, мы ввели обратно в клетки ERV KD B16 вектор экспрессии (без двухцепочечной РНК-целевой последовательности) для единственного гена env MelARV. Затем полученные дважды трансдуцированные клетки ERV KD + env (или контрольные) B16 прививали мышам C57BL / 6. Как проиллюстрировано на фиг. 3C, это привело к частичной реверсии эффекта нокдауна, причем уже 50% мышей с привитыми Env-экспрессирующими клетками погибали к 70 дню.Эта реверсия указывает на то, что ген env, по крайней мере частично, ответственен за ускользание от опухоли. Частичный эффект реверсии, скорее всего, объясняется более низкой экспрессией (дополнительный рис. S1) белка Env при экспрессии экзогенным вектором. восстанавливает опухолевую прогрессию клеток ERV B16. Сообщалось, что для роста опухоли B16 in vivo необходимо присутствие регуляторных Т-клеток (14, 15). С другой стороны, вирусы лейкемии мышей, тесно связанные с MelARV, также, как было показано, индуцируют регуляторные Т-клетки (16, 17).Таким образом, можно предположить, что экспрессия ERV меланомой B16 непосредственно отвечает за индукцию регуляторных Т-клеток, что приводит к прогрессированию опухоли. Чтобы проверить эту проблему, мы попытались дополнить снижение опухолевой прогрессии клеток ERV KD B16 адоптивным переносом регуляторных Т-клеток CD4 + CD25 +, выделенных от мышей C57BL / 6, прививаемых клетками B16 дикого типа. Как показано на фиг.4, перенос этих CD4 + CD25 + клеток не повлиял на прогрессирование опухоли привитых контрольных клеток B16 (фиг.4 A, слева и B), но увеличивал рост опухолевых клеток ERV KD B16 до уровней, аналогичных уровням контрольных клеток B16 (рис. 4 A, справа и B). Эти результаты, таким образом, убедительно свидетельствуют о том, что регуляторные Т-клетки являются необходимыми промежуточными продуктами для опосредованного ERV эффекта. Заключение и перспективы. Настоящие данные показывают, что опухоли способны подавлять иммунную систему, экспрессируя оболочку ERV. Блокирование экспрессии ERV приводило к усиленному отторжению опухоли, а экспрессия единственного белка оболочки ERV частично восстанавливала исходную степень прогрессирования опухоли.Мы также показываем, что регуляторных Т-клеток достаточно, чтобы линия опухолевых клеток, лишенная экспрессии ERV, могла развиваться в опухоль. В более общем плане результаты также предполагают, что опухолевые клетки, вероятно, подлежат иммуноредактированию, концепция, разработанная Dunn et al. (1) и относящиеся к иммунному надзору, как первоначально описано Burnet и Thomas (18). В самом деле, мы иллюстрируем, что развитие опухоли включает не только мутации в классических протоонкогенах или антионкогенах, но также включает активные процессы, нацеленные на непредвиденные гены, которые не влияют на состояние трансформации как таковые, такие как идентифицированный в настоящее время ген MelARV. В сочетании с классической химиотерапией или лучевой терапией, нацеливание на такие гены любыми доступными способами, включая инъекцию невекторизованной малой интерферирующей РНК, может способствовать регрессии опухоли за счет восстановления естественной способности иммунной системы отторгать опухолевые клетки и, следовательно, способствовать развитию рака. лечение. В этой связи интересно, что первая серия экспериментов с использованием синтетической малой интерферирующей РНК, нацеленной на MelARV, и инъекции i.p. Через 12 дней после приживления клеток B16 иммунокомпетентным мышам это фактически привело к ингибированию роста опухоли на одну треть по сравнению с мышами, которым вводили контрольную малую мешающую РНК, и, как показано на дополнительном рис.S2 — умеренное, но воспроизводимое увеличение задержки выживания. Наконец, следует отметить, что у людей экспрессия генов env ERV, в основном ограниченная плацентой и семенником в нормальных тканях, может наблюдаться при нескольких типах опухолей, таких как семиномы и меланомы (8, 19, 20). Более того, некоторые из полностью кодирующих генов env, которые могут быть идентифицированы в геноме человека, являются иммуносупрессивными in vivo в тесте на мышиной модели (5) и, таким образом, могут действовать как ген env MelARV, способствуя ускользанию от опухоли.Дальнейшая работа теперь должна быть направлена ​​на определение возможной роли таких генов у человека …

Руководители Санта-Фе выясняют, как двигаться дальше после протеста на площади Санта-Фе

Когда его спросили, почему на площади больше не было офицеров, когда ситуация начала накаляться, начальник полиции Санта-Фе сказал, что они специально вывели офицеров

«Наблюдатели связались с дежурным командиром. Этот командир решил покинуть площадь и не взаимодействовать с кем-либо еще, если чья-то жизнь не окажется в опасности», — сказал начальник SFPD Эндрю Падилла.«На этот раз сохранение жизни важнее собственности. Я поддерживаю решение этого командира. Это правильное решение. Если бы я был начальником или командиром, мы бы приняли такое же решение. Многие люди задаются вопросом, что мы должны были использовать там слезоточивый газ, стрелять в людей резиновыми пулями, перцовым баллончиком или слезоточивым газом. Это бы прервало жизнь туристов, зевак. Просто гуляю по площади, просто гадаю, что происходит ».

Падилья сказал, что они координируют свои действия с другими агентствами, чтобы помочь идентифицировать людей, которые принимали участие в свержении обелиска.

«Мы согласовали действия с полицией штата и департаментом шерифа. Если они получат какие-либо подсказки или информацию относительно этого инцидента, они собираются привлечь к ответственности, извините, поделитесь информацией с нашим отделом как агентством, занимающимся обработкой, чтобы мы могли привлечь к ответственности этих лиц », — сказал он.

В течение нескольких месяцев городские власти заявляли, что собираются разработать план по удалению обелиска и других спорных памятников в Санта-Фе. Мэр Санта-Фе Алан Уэббер сказал, что хочет провести диалог с сообществом о том, как двигаться дальше.

«Руководящий орган в целом сказал очень громким и ясным голосом, что нам нужно быстро двигаться вперед, чтобы удовлетворить эту потребность сообщества в диалоге», — сказал мэр. «Ясно, что люди хотят, чтобы их слышали. Они хотят, чтобы их голоса были услышаны. Они хотят, чтобы интересы их племен были представлены. Они хотят, чтобы история города была широко представлена ​​».

KOB 4 не смог взять интервью у лидеров Санта-Фе во вторник, но продолжит требовать от них ответов в текущей ситуации.

Кто был Эдвард Колстон, деятель работорговли, памятник которому британские демонстранты сбили с ног?

ДЖАКАРТА — Джордж Флойд, чернокожий мужчина, погибший из-за того, что белый полицейский прижал его шею коленом, вызвал протесты против расовой несправедливости во всем мире. Во время заключительной церемонии дани перед похоронами Флойда говорят, что Флойд был «обычным братом», которого судьба превратила в «основу движения».

Как сообщает CNN в среду, 10 июня, инцидент со смертью Флойда вызвал протесты против расизма в различных странах, одной из которых была Великобритания. Даже протестующие в Бристоле, Англия, связали бронзовую статую Эдварда Колстона веревкой, прежде чем бросить ее в окружающую толпу, которую они бросили в реку.

Протестующие отметили крушение статуи Эдварда Колстона. Однако противники бюста Эдварда Колстона утверждали, что это был вандализм и попытка стереть историю.Местная полиция сообщила, что по факту происшествия начато расследование.

«Есть небольшая группа людей, которые явно совершили преступление, сбив статую возле порта Бристоля. Будет проведено расследование для установления личности причастных к этому, и мы собрали кадры инцидента», — заявила полиция.

Статуя Колстона стоит в центре Бристоля с 1895 года. Статуя становится все более спорной, и подаются петиции с требованием ее удаления.

Официальный сайт Бристольского музея описывает Колстона как «оскорбленного филантропа / работорговца». Говорят, что Колстон родился в городе в 1636 году, но прожил в Лондоне. Он стал активным членом руководящего органа RAC (Королевской африканской компании), которая торговала рабами из Африки в Америку.

RAC также отправила в рабство больше мужчин, женщин и детей, чем любая другая компания в истории работорговли.Известно, что в период с 1672 по начало 1720-х годов RAC перевозил почти 150 000 человек.

К этому времени Колстон быстро продвигался по служебной лестнице в RAC. Подсчитано, что за время его пребывания на посту заместителя губернатора компании с 1680 по 1692 год на корабле RAC было перевезено до 84000 порабощенных африканцев. Во время путешествия почти четверть этих людей или около 19 тысяч человек погибли в пути, не дойдя до побережья.

Все рабы были заклеймены на груди инициалами RAC; в том числе дети в возрасте от шести лет. Каждый четвертый ребенок умирает в пути. Условия на лодке были переполненными и антисанитарными, что привело к распространению смертельных заболеваний.

«Изображение Эдварда Колстона было очень спорным и оскорбительным для многих, и, отбрасывая его (статую Колстона), важно отметить, что мы не стираем историю, а творим ее», — говорится в заявлении Международного музея рабства.

Затем Колстон покинул RAC и стал членом парламента от партии Тори, представляющей Бристоль, где он защищал «право» города «продавать» порабощенных африканцев.В последние годы своей жизни он стал крупным инвестором другой компании по работорговле, компании South Seas Company (SSC), которая в основном торговала с Южной Америкой.

За время сотрудничества Колстона с SSC компания перевезла около 15 931 африканца в рабство, причем почти каждый пятый погиб в пути. С другой стороны, Колстон также заработал репутацию филантропа.

Он пожертвовал большую часть своего состояния на благотворительные цели, такие как строительство школ и больниц в Бристоле и Лондоне. Его филантропический характер заставил имя Колстона проникнуть в Бристоль. Помимо статуи, есть частная школа Colston’s.

Есть также концертный зал под названием Colston Hall, многоэтажный офисный блок под названием Colston Tower и Colston Street. Хотя показано, что Колстон имеет связи с африканской работорговлей, Бристольский музей объясняет, что работорговля «не была исключительно его желанием».

Для некоторых в 19 веке Колстон олицетворял честь большого богатства, патернализм как оплот против социализма и благотворительность.Рабство, в котором было построено его богатство, скрыто для конкретного повествования истории Бристоля. Свержение и затопление статуи — подтверждение нового исторического письма.

Версии на английском, китайском, японском, арабском, французском и испанском языках создаются системой автоматически. Поэтому при переводе все еще могут быть неточности, пожалуйста, всегда выбирайте индонезийский в качестве основного языка. (система поддерживается DigitalSiber.id)

Knock down анализ выявляет критические фазы для специфических функций некодирующих oskar РНК во время оогенеза дрозофилы | G3 Гены | Геномы | Генетика

Аннотация

Транскрипт oskar , действуя как некодирующая РНК, способствует разнообразному набору путей в яичнике Drosophila , включая образование кариосом, расположение центра организации микротрубочек (MTOC), целостность определенных частиц рибонуклеопротеина, контроль кормления грудью. деления клеток, ограничение нескольких белков зародышевой линией и прохождение оогенеза.Как мРНК oskar выполняет эти функции, остается неясным. Здесь мы используем подход «нокдауна» для определения критических фаз, когда oskar требуется для трех из этих функций. Существующая трансгенная кшРНК для удаления мРНК oskar в зародышевой линии нацелена на последовательность, перекрывающуюся регуляторный сайт, связанный с белком Bruno1, чтобы обеспечить репрессию трансляции, и была неэффективной во время оогенеза. Новые трансгенные кшРНК, нацеленные на другие сайты, были эффективны при сильном снижении уровней мРНК oskar и воспроизводстве фенотипов, связанных с отсутствием мРНК.Используя драйверы GAL4, активные на разных стадиях развития оогенеза, мы обнаружили, что ранняя потеря мРНК oskar воспроизводит дефекты в формировании кариосом и позиционировании MTOC, но не останавливает оогенез. Потеря мРНК oskar на более поздних стадиях необходима для предотвращения прогрессирования через оогенез. Таким образом, некодирующая функция мРНК oskar требуется для более чем одного события.

Введение

Drosophila oskar ( osk ) мРНК необходима, независимо от белка Osk, во время оогенеза (Jenny et ​​al. 2006). Мутанты, в которых уровни мРНК или существенно снижены или устранены, обнаруживают множество дефектов. Наиболее заметным из них является женское бесплодие, являющееся следствием остановки оогенеза. Еще до остановки появляются более тонкие дефекты: в яйцевых камерах часто бывает слишком много питательных клеток, конденсация хромосом ооцита для образования кариосомы неполная, расположение центра организации микротрубочек (MTOC) в ооците ненормальное, некоторые частицы рибонуклеопротеинов находятся в неправильном положении. дезорганизованы, и белки, обычно ограниченные клетками зародышевой линии яичника, могут быть обнаружены на низких уровнях в окружающих соматических фолликулярных клетках (Jenny et ​​al. 2006; Канке и др. 2015; Kenny et ​​al. 2021 г.). Обнаружение дополнительных дефектов кажется вероятным, поскольку остается только применить соответствующие анализы. Разнообразие фенотипов или нуль-мутантных РНК без видимой общей зависимости от конкретного клеточного пути ниже или , может указывать на существование множества различных некодирующих функций. Однако каждый из перечисленных выше фенотипов чувствителен к мутации одних и тех же определенных функциональных последовательностей в 3 ‘UTR мРНК osk : плотно кластерная комбинация сайтов связывания Bruno1 (Bru1), некодирующего элемента osk (ONCE) и A -богатые последовательности (ARS) (Vazquez-Pianzola et ​​al. 2011; Канке и др. 2015; Kenny et ​​al. 2021 г.). Таким образом, эти элементы либо опосредуют несколько событий или взаимодействий, либо выполняют одну функцию с несколькими путями, на которые влияет нарушение этого события. Крайняя версия последнего варианта будет исходным событием «ворот» с немедленным исходом, таким как образование кариосом или правильная организация MTOC, что является предпосылкой для более поздних результатов, таких как прогрессия через оогенез.

Один из подходов к исследованию взаимосвязи различных или RNA null дефектов состоит в том, чтобы нарушить активность или ncRNA на разных стадиях оогенеза и спросить, могут ли определенные дефекты индуцироваться отдельно от других. Классическое применение этой стратегии часто основывалось на чувствительных к температуре мутантах (, например, , Jarvik and Botstein 1973). Более поздний подход к этой концепции основан на индуцибельной активации или подавлении гена (например, , Gossen and Bujard 1992; Gossen et ​​al. 1995; Kumar et ​​al. 2009; Fenno et ​​al. 2011). В Drosophila полезным методом является нокдаун генов (KD), основанный на трансгенных shРНК под контролем UAS / GAL4 (https: // fgr.hms.harvard.edu/fly-in-vivo-rnai) и различные драйверы GAL4 (Brand and Perrimon, 1993) с разными временными и / или пространственными паттернами выражения.

Здесь мы использовали подход KD, начав с разработки эффективных трансгенов osk -shRNA, чтобы устранить ограничение, приводящее к отключению существующих версий. Мы предоставляем доказательства различных критических периодов для различных ролей нкРНК osk и показываем, что начальные дефекты от ранней потери мРНК osk не имеют длительного эффекта, если мРНК osk восстанавливается.

Материалы и методы

Мухи и трансгены

Для конструирования трансгенов osk-shRNA пары олигонуклеотидов отжигали и клонировали в сайты Nhe I и Eco RI вектора VALIUM22. Пары олигонуклеотидов, все показанные 5 ’слева: osk-shRNA № 1 , CTAGCAGTACGATTCTCTGCTGACGATTATAGTTATATTCAAGCATATAATCGTCAGCAGAGAATCGTGCG и AATCTGCACGATTCTCGAATCGATAGACG и AATCTGCACGATTCTCGAATGATAGACTCAG и AATCTGCACGATTCTCGATGATGACTGAC; оск-шРНК № 2 , CTAGCAGTAAGGAGATGCACAATATGCGATAGTTATATTCAAGCATATCGCATATTGTGCATCTCCTTGCG и AATTCGCAAGGAGATGCACAATATGCGATATGCTTGAATATAGCACAATATGCGATATGCTTGAATATAGCACTTGCGCTTGAATATAGCACTGCGC оск-шРНК № 3 , CTAGCAGTTCGACATACACTCCTGTCTAATAGTTATATTCAAGCATATTAGACAGGAGTGTATGTCGAGCG и AATTCGCTCGACATACACTCCTGTCTAATATGCTTGAATATAACTATTAGACTCAGGAGTGTATAT.Дизайн shRNA был великодушно выполнен Клэр Янху Ху из TRiP, Гарвардская медицинская школа. Каждый трансген вставляли в сайт attP40 на 25С6 (запас Bloomington # 25709).

Трансгенный штамм TRiP для KD osk был TRiP.GL01101, запас Bloomington # 36903, а для KD bru1 был TRiP.GL00314, Stock Bloomington # 35394.

Трансген osk ^syn был основан на спасающем геномном трансгене (Kim-Ha et ​​al. 1991), в котором часть гена osk от 3 ‘до начала второго экзона до стоп-кодон (координаты 8935984–8937367 в выпуске r6.40 из геномной последовательности D. melanogaster ) была заменена синтетической последовательностью, сохраняющей последовательности интронов дикого типа и кодирующей последовательность белка Osk дикого типа, но синонимичными кодонами для максимизации различий в последовательности ДНК (см. Дополнительный файл S1). Координаты геномной последовательности Drosophila были получены из FlyBase (Larkin et ​​al. 2021).

Были описаны аллели osk, osk ⁰ , и osk ^N (Kanke et ​​al. 2015; Mohr et ​​al. 2021 г.). Драйверы GAL4 от Bloomington Stock Center: (с использованными здесь сокращениями в скобках) P (GAL4 :: VP16-nos.UTR) CG6325 [MVD1] ( NGV ), BL # 4937; P (matalpha4-GAL-VP16) V37 ( MAT ), BL # 7063; P (GAL4-номера .NGT) 40 ( NGT ), BL № 4442. Дополнительные драйверы GAL4 из коллекции Janelia Research Campus (также известные как «линии Rubin GAL4»), 12B02 , 25D06 , 29E01 и 34C10 , были получены от Allan Spradling.Они были среди группы, которую он определил, когда его спросили, проверила ли его лаборатория с положительными результатами какую-либо коллекцию Janelia на активность в яичниках.

Анализы откладки яиц выполняли, как описано (Kenny et ​​al. 2021).

Обнаружение РНК и белков

РНК определяли с помощью кПЦР, как описано (Kenny et ​​al. 2021). Гибридизация in situ для обнаружения мРНК или с использованием черепичных коротких олигонуклеотидов ДНК (smFISH) 3 ‘-конца, меченных флуорофором Quasar 670 (LGC Biosearch Technologies) и используемых на этапе 1.5 нМ. Анализы выполняли, как описано (Abbaszadeh and Gavis 2016). Иммунодетекция белков в яичниках была описана (Ryu and Macdonald 2015) с другим протоколом фиксации для гамма-тубулина (Kenny et ​​al. 2021). Иодид TO-PRO-3 (Invitrogen) (1: 1000) или DAPI (1: 4000) использовали для окрашивания ДНК. Антитела для визуализации представляли собой мышиное анти-1B1, которое обнаруживает белок аддуцин (Hts) (банк гибридом развивающихся исследований), разведенный 1: 1, мышиный анти-ламин Dm0 (ADL84.12) (банк гибридом исследований развития), разведенный 1: 100, и кроличий анти-гамма-тубулин (Sigma T-0950), разведенный 1: 2000.Образцы получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon C2 +. Для всех экспериментов по визуализации образцы были получены как минимум от пяти мух, как правило, от многих других. Количественная оценка данных гибридизации in situ была проведена в FIJI, при этом были отслежены зародышевые клетки или камеры для яиц и измерена максимальная интенсивность пикселей. Измерения площадей ооцитов, ограниченных очагами гамма-тубулина, проводили, как описано (Kenny et ​​al. 2021).

Статистические методы

Воспроизводимость подтверждена независимыми экспериментами.Эксперименты по визуализации включали изучение нескольких отдельных яичных камер в каждом эксперименте. Здесь повторение служило для выявления любых технических проблем, а большое количество отдельных яичных камер, оцениваемых в каждом эксперименте, обеспечивало согласованность и воспроизводимость. Эксперименты по откладке яиц проводили не менее трех раз. Скорость откладки яиц часто показывает циркадные колебания, но поскольку каждый эксперимент состоял из сбора яиц в течение нескольких дней, этот источник отклонений был минимизирован. Эксперименты не были рандомизированы, и статистический метод не использовался для предварительного определения размера выборки. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался, чтобы спросить, есть ли существенные различия между наборами данных с тремя или более переменными. Для всех анализов критерии Шапиро-Уилка отклонили нормальность, а критерии суммы рангов Вилкоксона использовались для апостериорного анализа .

Результаты и обсуждение

Разработка и валидация новых реагентов

Один из подходов к определению критической фазы или фаз активности или нкРНК заключается в удалении или РНК путем нокдауна (KD), полагаясь на драйверы GAL4 с различной временной активностью для экспрессии трансгенной shРНК, которая нацелена на или мРНК.Однако материнский тройной драйвер ( MTD-Gal4 ) в сочетании с трансгенным реагентом osk shRNA для экспрессии зародышевой линии (TRiP.GL01101) из Transgenic RNAi Project (TRiP) неэффективен для имитации наиболее впечатляющего osk РНК-нулевой фенотип, остановка оогенеза, так как откладка яиц существенно не снижается (Liu and Lasko 2015). Точно так же драйвер matalpha4-GAL-VP16 (далее именуемый MAT ; сокращения, используемые для других драйверов, приведены в разделе «МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ») в сочетании с TRiP.GL01101 лишь незначительно снизил уровень мРНК или яичников (рис. 1B) и не смог существенно снизить яйценоскость (рис. 1C).

Рисунок 1

Нокдаун или мРНК в оогенезе. (A) Схема гена osk , показывающая положения сайтов-мишеней osk-shRNA . Последовательности РНК непосредственно ниже показывают перекрытие между сайтом связывания Bru1 (BRE) и целью osk-shRNA (GL01101) проекта TRiP . Последовательности РНК внизу показывают последовательности, мутировавшие (красный цвет) в трансгене osk ^syn на участке мишени osk-shRNA # 3 , с нуклеотидами, расположенными по кодонам.(B) Уровни мРНК osk , проанализированные с помощью кПЦР, из яичников самок, в которых присутствовал драйвер MAT GAL4 в комбинации с указанным osk-shRNA . Планки погрешностей указывают стандартные отклонения. (C) Скорость откладки яиц самками, в которых драйвер MAT GAL4 присутствовал в комбинации с указанным osk-shRNA , за исключением генотипа osk ^N / osk ^N . Для образца, протестированного в присутствии трансгена osk ^syn , фон osk был osk ^N / osk ⁺ , чтобы компенсировать трансгенную копию osk .Значения выше 3 яиц на самку в час усечены (конец полосы зазубрен): поголовье w ¹¹¹⁸ , используемое в качестве контроля дикого типа, часто имеет немного более низкую скорость откладки яиц, чем различные экспериментальные штаммы. (D) Овариолы, показывающие время остановки оогенеза у мутанта osk и KD. Масштабная линейка 100 мкм.

Рисунок 1

Нокдаун мРНК osk в оогенезе. (A) Схема гена osk , показывающая положения сайтов-мишеней osk-shRNA . Последовательности РНК непосредственно ниже показывают перекрытие между сайтом связывания Bru1 (BRE) и целью osk-shRNA (GL01101) проекта TRiP . Последовательности РНК внизу показывают последовательности, мутировавшие (красный цвет) в трансгене osk ^syn на участке мишени osk-shRNA # 3 , с нуклеотидами, расположенными по кодонам. (B) Уровни мРНК osk , проанализированные с помощью кПЦР, из яичников самок, в которых присутствовал драйвер MAT GAL4 в комбинации с указанным osk-shRNA .Планки погрешностей указывают стандартные отклонения. (C) Скорость откладки яиц самками, в которых драйвер MAT GAL4 присутствовал в комбинации с указанным osk-shRNA , за исключением генотипа osk ^N / osk ^N . Для образца, протестированного в присутствии трансгена osk ^syn , фон osk был osk ^N / osk ⁺ , чтобы компенсировать трансгенную копию osk . Значения выше 3 яиц на самку в час усечены (конец полосы зазубрен): поголовье w ¹¹¹⁸ , используемое в качестве контроля дикого типа, часто имеет немного более низкую скорость откладки яиц, чем различные экспериментальные штаммы. (D) Овариолы, показывающие время остановки оогенеза у мутанта osk и KD. Масштабная линейка 100 мкм.

Возможные объяснения слабой KD включают недостаточную активность драйвера или ограниченную эффективность shRNA во время оогенеза. Примечательно, что сайт-мишень shRNA osk существенно перекрывается с сайтом связывания белка Bru1 (рис. 1A), который действует в регуляции трансляции мРНК osk (Kim-Ha et ​​al. 1995; Reveal et ​​al. 2010). Bru1 присутствует на самых ранних стадиях оогенеза (Webster et ​​al. 1997), и когда он связан с мРНК osk , он может мешать связыванию shРНК, тем самым ограничивая эффект KD.

Три новых трансгена для экспрессии shРНК, нацеленных на другие сайты в мРНК osk , были изготовлены и протестированы ( osk-shRNAs № 1 , № 2 и № 3 ; Рисунок 1A). Используя драйвер MAT для экспрессии, каждая новая osk-shRNA резко снижала уровни мРНК osk (Рисунок 1B) и в значительной степени устраняла производство яиц (Рисунок 1C).Чтобы подтвердить специфичность для мРНК osk , KD с osk-shRNA # 3 был протестирован в присутствии трансгена osk — osk ^syn — с синонимичными изменениями кодона, которые изменяют osk-shRNA # 3. целевой сайт (рис. 1A): откладка яиц была восстановлена ​​(рис. 1C). Трансген osk-shRNA # 3 использовали во всех последующих экспериментах с osk кД.

Контрастные свойства исходной osk-shRNA и новой osk-shRNA решительно поддерживают идею о том, что Bru1 может нарушать связывание shRNA, когда их мишени в мРНК перекрываются.Было бы неудивительно, если бы подобный эффект лежал в основе подмножества других неэффективных shRNA, и компиляции эффективности shRNA могли потенциально быть добыты для информации, способствующей идентификации сайтов узнавания для других белков, связывающих РНК.

Эффективность драйверов GAL4 в снижении

Несколько драйверов GAL4, активных в женской зародышевой линии, были протестированы с osk-shRNA № 3 для мониторинга эффектов на активность osk ncRNA, сосредоточив внимание первоначально на кладке яиц (рис. 2A).Для сравнения также были выполнены КД брю1 . Самки, мутантные по сильным аллелям bru1 , не производят яиц и обнаруживают раннюю остановку оогенеза, ожидаемого фенотипа для эффективного KD.

Рисунок 2

Сравнение драйверов GAL4 для активности во время оогенеза. (A) Скорость откладки яиц самками, в которых указанный драйвер GAL4 присутствовал в комбинации с трансгенами для KD osk или bru1 .(B) Шаблоны экспрессии из комбинации UAS-GFP и указанного драйвера GAL4. Каждая панель показывает одну овариолу от гермария (слева) до стадии 8 (справа). Панель (B ’) — это тот же набор панелей с увеличенным усилением в зеленом канале RGB. Масштабная линейка 100 мкм.

Рисунок 2

Сравнение драйверов GAL4 для активности во время оогенеза. (A) Скорость откладки яиц самками, в которых указанный драйвер GAL4 присутствовал в комбинации с трансгенами для KD osk или bru1 .(B) Шаблоны экспрессии из комбинации UAS-GFP и указанного драйвера GAL4. Каждая панель показывает одну овариолу от гермария (слева) до стадии 8 (справа). Панель (B ’) — это тот же набор панелей с увеличенным усилением в зеленом канале RGB. Масштабная линейка 100 мкм.

Три из протестированных драйверов, NGV , MAT и 34C10 , существенно снизили кладку яиц в моделях osk KD; каждый должен быть активен на стадии или до нее, когда активность или нкРНК необходима для прохождения через оогенез.При использовании для bru1 KD каждый из этих драйверов также был эффективен в отношении остановки оогенеза. Один драйвер, NGT , вызывал остановку оогенеза у bru1 KD, но не мешал прохождению через оогенез у или KD. Хотя KD osk и bru1 сходны в том, что вызывают остановку оогенеза, природа ареста совершенно различна. В то время как osk KD допускает прогрессирование через ранние стадии, арест bru1 KD связан с избыточной пролиферацией половых клеток в псевдо-яичных камерах (дополнительный рисунок S1), что наблюдается у мутантов, лишенных активности bru1 (Parisi et ​​al. . 2001).

Каждый из этих драйверов использовался в комбинации с трансгеном UAS-GFP для сравнения периодов активности во время оогенеза. Для всех генотипов использовались одинаковые настройки визуализации. Чтобы обнаружить более низкие уровни активности, исходные изображения (рис. 2B) были настроены идентично в зеленом (GFP) канале для повышения чувствительности (рис. 2B ’). Только те факторы, которые оказывают существенное влияние на кладку яиц в osk KD, были сильно активны в отношении экспрессии UAS-GFP на средних стадиях оогенеза.

И драйверы MAT, и драйверы 34C10 производили GFP на значительном уровне от этапа 3, по крайней мере, до этапа 8 (конечная точка этого анализа). В принципе, постоянное появление GFP может возникать в результате начальной фазы экспрессии и сохранения белка на более позднем этапе развития или в результате постоянной экспрессии. Два наблюдения предполагают, что персистенция белка GFP не внесла существенного вклада в наблюдаемые закономерности. Во-первых, период полужизни GFP оказался коротким по сравнению со временем, необходимым для прохождения через оогенез: GFP, продуцируемый драйвером NGT в гермарии, не сохранялся (фигура 2B ’).Во-вторых, интенсивность сигнала GFP от драйверов MAT и 34C10 оставалась высокой и даже увеличивалась на этапах 3–8 (рис. 2, B и B ‘), несмотря на более чем 10-кратное увеличение объема яйца. камеры в тот период развития (King 1970). Если бы был только короткий период экспрессии, полученный GFP должен был бы постепенно становиться более разбавленным по мере увеличения объема.

Последствия удаления

Драйвер NGT был активен только на очень ранней стадии оогенеза: экспрессия репортера UAS-GFP была обнаружена в гермарии и в камерах яйца стадии 2, в профиле развития, примерно дополняющем активность MAT (Рисунки 2B ‘). и 3А).Несмотря на раннюю активность NGT, не было никакого эффекта на кладку яиц у osk KD (Рисунок 2A). Таким образом, либо NGT не эффективен для osk KD, либо мРНК osk не требуется на ранних стадиях для прохождения через оогенез. Чтобы оценить эффективность NGT KD osk , мы контролировали уровни мРНК osk с помощью гибридизации in situ . В гермарии, включая камеры яйца стадии 1, еще не отпочковавшиеся, или мРНК были в значительной степени элиминированы (Рисунок 3, B и C).К стадии 4 уровни мРНК osk начали восстанавливаться: значительная часть яичных камер все еще содержала очень мало мРНК osk , в то время как другие имели уровни, приближающиеся к уровню w ¹¹¹⁸ контроля. Напротив, osk KD с MAT вызвали лишь умеренное снижение мРНК osk в гермарии, в то время как яичные камеры стадии 4 были существенно истощены (рис. 3, B и C). Мы пришли к выводу, что активность или нкРНК не требуется на самых ранних стадиях оогенеза для прогрессирования через оогенез. Более того, результаты с драйвером NGT еще больше сужают определение критической фазы для требования активности или нкРНК в прогрессии через оогенез. Поскольку значительная часть яичных камер стадии 4 в osk KD с NGT все еще имеет чрезвычайно низкие уровни мРНК osk , но при этом не происходит снижения яйценоскости, активность osk ncRNA может потребоваться только позже. Мы пришли к выводу, что в какой-то момент между стадией 5 и временем ареста на стадии 6/7 мРНК osk выполняет функцию, которая делает возможным дальнейшее продвижение через оогенез.

Рисунок 3

мРНК osk может быть удалена с помощью KD на ранних этапах оогенеза. (A) MAT и NGT управляют активностью в раннем оогенезе. Показаны самые передние части яичников с гермарием слева и отдельными яйцевыми камерами справа. Масштабная линейка 10 мкм. На панелях справа отображается только зеленый канал RGB. (B) In situ обнаружение мРНК osk на ранних стадиях оогенеза. Для обеих стадий сигнал мРНК osk из левого столбца показан сам по себе в правом столбце.Для стадии 4 уровни мРНК osk в KD с драйвером NGT были переменными, и показаны два примера, указывающих на эту вариацию. Шкала 10 мкм. (C) Количественное определение уровней мРНК osk на ранних стадиях оогенеза из изображений гибридизации in situ (репрезентативные примеры на панели B). Для этапа 4 анализа были выбраны условия визуализации, чтобы лучше всего выявить различия в низких уровнях мРНК osk в мутанте osk и KD; следовательно, для образца дикого типа наблюдалось насыщение сигнала (интенсивность пикселей 255). P -значения были получены из критерия суммы рангов Вилкоксона. Для всех парных сравнений P <0,01, за двумя исключениями: в образцах гермария / стадии 1 P <0,1 для w ¹¹¹⁸ vs MAT≫osk-shRNA # 3 и для osk ⁰ против NGT≫osk-shRNA # 3 .

Рисунок 3

мРНК osk может быть удалена с помощью KD на ранних этапах оогенеза. (A) MAT и NGT управляют активностью в раннем оогенезе.Показаны самые передние части яичников с гермарием слева и отдельными яйцевыми камерами справа. Масштабная линейка 10 мкм. На панелях справа отображается только зеленый канал RGB. (B) In situ обнаружение мРНК osk на ранних стадиях оогенеза. Для обеих стадий сигнал мРНК osk из левого столбца показан сам по себе в правом столбце. Для стадии 4 уровни мРНК osk в KD с драйвером NGT были переменными, и показаны два примера, указывающих на эту вариацию.Шкала 10 мкм. (C) Количественное определение уровней мРНК osk на ранних стадиях оогенеза из изображений гибридизации in situ (репрезентативные примеры на панели B). Для этапа 4 анализа были выбраны условия визуализации, чтобы лучше всего выявить различия в низких уровнях мРНК osk в мутанте osk и KD; следовательно, для образца дикого типа наблюдалось насыщение сигнала (интенсивность пикселей 255). P -значения были получены из критерия суммы рангов Вилкоксона.Для всех парных сравнений P <0,01, за двумя исключениями: в образцах гермария / стадии 1 P <0,1 для w ¹¹¹⁸ vs MAT≫osk-shRNA # 3 и для osk ⁰ против NGT≫osk-shRNA # 3 .

Остановка оогенеза — лишь одно из проявлений отсутствия или мРНК. Другие или нулевые фенотипы РНК, такие как измененная организация MTOC (Kenny et ​​al. 2021) и дефектное формирование кариосомы (Jenny et ​​al. 2006; Канке и др. 2015), может явиться до момента задержания. Ожидается, что эти процессы будут чувствительны к потере мРНК или на ранних этапах оогенеза от KD. Действительно, распределение мРНК osk , когда она присутствует в яичных камерах стадии 4 после osk KD с NGT (Рисунок 3B), предполагает дефект MTOC. В ооцитах дикого типа MTOC от стадий 2 до 6 расположен в задней части ооцита (Theurkauf et ​​al. 1992), и это распределение лежит в основе заднего обогащения множественных мРНК, включая саму или (Clegg et ​​al. . 1997). По сравнению с ооцитами стадии 4 дикого типа, в osk KD с NGT , заднее обогащение мРНК osk оказалось сниженным.

Организация MTOC отслеживалась с использованием гамма-тубулина в качестве маркера, первоначально фокусируясь на камерах 3 и 4 яиц. Заднее обогащение теряется в отсутствие мРНК или с множественными очагами гамма-тубулина, присутствующими по всему ооциту (Kenny et ​​al. 2021) (рис. 4A). Похожий дефект был обнаружен в начале osk KD с драйвером NGT (рис. 4, A и B).

Рисунок 4

Нарушение MTOC из KD osk в раннем оогенезе. (A) Типичная стадия 3-4 яичных камер от самок с указанными генотипами. Каждая яйцеклетка ориентирована кзади, положение ооцита — вправо. Левая колонка: полные камеры яйца, окрашенные на гамма-тубулин (зеленый) и ДНК (красный). Масштабная линейка 10 мкм. Средний столбец: изображения из левого столбца только с сигналом гамма-тубулина (белый). Правый столбец: увеличение участков, выделенных желтым цветом в среднем столбце, содержащих ооцит.(B) Измерения площадей, ограниченных очагами гамма-тубулина в ооците (см. Материалы и методы). Для каждого генотипа было проанализировано не менее 19 ооцитов. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01. (C) Репрезентативная стадия 5–6 яичных камер от самок с указанными генотипами. Каждая камера для яиц ориентирована кзади вправо. Слева: полные камеры яйца, окрашенные на гамма-тубулин (зеленый) и ДНК (красный). Масштабная линейка 10 мкм.Задний участок с ооцитом показан справа только с сигналом гамма-тубулина (белый).

Рисунок 4

Нарушение MTOC из KD osk в раннем оогенезе. (A) Типичная стадия 3-4 яичных камер от самок с указанными генотипами. Каждая яйцеклетка ориентирована кзади, положение ооцита — вправо. Левая колонка: полные камеры яйца, окрашенные на гамма-тубулин (зеленый) и ДНК (красный). Масштабная линейка 10 мкм. Средний столбец: изображения из левого столбца только с сигналом гамма-тубулина (белый).Правый столбец: увеличение участков, выделенных желтым цветом в среднем столбце, содержащих ооцит. (B) Измерения площадей, ограниченных очагами гамма-тубулина в ооците (см. Материалы и методы). Для каждого генотипа было проанализировано не менее 19 ооцитов. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01. (C) Репрезентативная стадия 5–6 яичных камер от самок с указанными генотипами. Каждая камера для яиц ориентирована кзади вправо.Слева: полные камеры яйца, окрашенные на гамма-тубулин (зеленый) и ДНК (красный). Масштабная линейка 10 мкм. Задний участок с ооцитом показан справа только с сигналом гамма-тубулина (белый).

Потеря или мРНК из NGT KD не сохранялась по мере развития оогенеза. Следовательно, мы могли бы спросить, восстановилась ли организация MTOC, поскольку или мРНК вновь появились из продолжающейся транскрипции. В яичных камерах стадии 5 и 6 дикого типа скопления гамма-тубулина переходили в один или два преобладающих очага (рис. 4C).В отсутствие мРНК или аномальное распределение гамма-тубулина сохранялось на более поздних стадиях оогенеза (рис. 4С). Напротив, в начале osk KD с драйвером NGT нормальный паттерн был восстановлен без значительных отличий от дикого типа на стадиях 5/6.

Мы также наблюдали за формированием кариосом на тех же ранних и средних стадиях оогенеза. На 2 стадии оогенеза хромосомы появляются по всему ядру ооцита. По завершении мейотической рекомбинации хромосомы ооцитов конденсируются, образуя кариосому, единый компактный кластер внутри ядра (King 1970) (Рисунок 5).Формирование кариосом является дефектным при отсутствии активности нкРНК или , при этом хромосомы разделены на два или более фокусов (Jenny et ​​al. 2006; Kanke et ​​al. 2015) (Рисунок 5). KD мРНК osk с драйвером NGT вызывал такой же дефект (фиг. 5A), статистически неотличимый от мутанта osk ⁰ (фиг. 5C).

Рисунок 5

Нарушение образования кариосом из KD osk в раннем оогенезе.(A) Репрезентативные стадии 3-4 камеры яйца от самок с указанными генотипами. Каждая камера для яиц ориентирована кзади вправо. Слева: полные камеры яйца, окрашенные на ДНК (красный) и ламин (зеленый), чтобы очертить ядра. Масштабная линейка 10 мкм. Справа: увеличение ядер ооцитов на изображениях слева. (B) Репрезентативная стадия 5–6 яичных камер от самок с указанными генотипами. Представлено как на панели A, за исключением того, что масштабная линейка составляет 20 мкм. (C) Доля ооцитов 3-4 стадии указанных генотипов с нормальными кариосомами, определяемая как единый кластер ДНК в ядре ооцита.Указывается количество (n) ооцитов, проанализированных для каждого генотипа. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01. (D) Доля ооцитов 5-6 стадии указанных генотипов с нормальными кариосомами, определяемая как единый кластер ДНК в ядре ооцита. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01.

Рисунок 5

Нарушение образования кариосом из KD osk в раннем оогенезе.(A) Репрезентативные стадии 3-4 камеры яйца от самок с указанными генотипами. Каждая камера для яиц ориентирована кзади вправо. Слева: полные камеры яйца, окрашенные на ДНК (красный) и ламин (зеленый), чтобы очертить ядра. Масштабная линейка 10 мкм. Справа: увеличение ядер ооцитов на изображениях слева. (B) Репрезентативная стадия 5–6 яичных камер от самок с указанными генотипами. Представлено как на панели A, за исключением того, что масштабная линейка составляет 20 мкм. (C) Доля ооцитов 3-4 стадии указанных генотипов с нормальными кариосомами, определяемая как единый кластер ДНК в ядре ооцита.Указывается количество (n) ооцитов, проанализированных для каждого генотипа. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01. (D) Доля ооцитов 5-6 стадии указанных генотипов с нормальными кариосомами, определяемая как единый кластер ДНК в ядре ооцита. Значения P были получены с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона: *** P <0,01.

Дефекты кариосом из ранних osk KD с драйвером NGT были существенно исправлены по мере продолжения оогенеза, и уровни мРНК osk увеличились, хотя значительная часть яичных камер все еще имела аномальные кариосомы на стадиях 5/6 (Рисунок 5, B и D; пример, показанный на рисунке 5B, — это тот, в котором кариосома остается ненормальной).

Поскольку начальная неспособность сформировать кариосому или правильно расположить MTOC не помешала хотя бы частичному восстановлению, когда уровни мРНК osk начали восстанавливаться, критический период для активности osk ncRNA в этих двух процессах продолжается, и Роль мРНК osk должна встречаться многократно, а не только один раз. Различная степень исправления этих дефектов может отражать разные способы действия или нкРНК в каждом процессе или различную чувствительность к потере или мРНК. При любом объяснении кажется маловероятным, что мРНК osk выполняет единичное начальное событие, которое затем участвует в различных путях.

Доступность данных

Данные, лежащие в основе этой статьи, доступны в статье и в дополнительных материалах к ней.

Дополнительные материалы доступны по адресу G3 в Интернете.

Благодарности

Авторы благодарят Клэр Янхуи Ху за дизайн shРНК и Аллана Спредлинга за штаммы мух.Аллан Спрэдлинг щедро поделился информацией о примерах драйверов Janelia Farm GAL4, которые активны в яичнике. В этом исследовании использовались поголовья мух, полученные из Центра содержания дрозофил Блумингтона (NIH P40OD018537). Антитела были получены из банка гибридом исследований развития, созданного NICHD Национального института здоровья и поддерживаемого на факультете биологии Университета Айовы, Айова-Сити, Айова 52242.

Финансирование

Финансирование было предоставлено грантом R01 GM118526 Национального института здравоохранения.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Цитированная литература

Аббасзаде

EK

Гавис

ER.

2016

Фиксированная и живая визуализация РНК в ооцитах и ​​эмбрионах дрозофилы

Методы

98

34

41

Марка

AH

Perrimon

N.

1993

Нацеленная экспрессия генов как средство изменения судьбы клеток и создания доминантных фенотипов

Развитие

118

401

415

Clegg

NJ

Frost

DM

Larkin

MK

Subrahmanyan

L

Bryant

Z

1997

водоворот необходим для ранней стадии установления полярности ооцитов Drosophila : задняя локализация мРНК grk

Развитие

124

4661

4671

Fenno

L

Yizhar

O

Deisseroth

K.

2011

Развитие и применение оптогенетики

Анну Рев Neurosci

34

389

412

Gossen

M

Bujard

H.

1992

Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью промоторов, чувствительных к тетрациклину

Proc Natl Acad Sci USA

89

5547

5551

Gossen

M

Freundlieb

S

Bender

G

Müller

G

Hillen

W

1995

Активация транскрипции тетрациклинами в клетках млекопитающих

Наука

268

1766

1769

Ярвик

J

Ботштайн

D.

1973

Генетический метод определения порядка событий в биологическом пути

Proc Natl Acad Sci USA

70

2046

2050

Jenny

A

Hachet

O

Závorszky

P

Cyrklaff

A

Weston

MDJ

2006

Независимая от трансляции роль РНК oskar в раннем оогенезе Drosophila

Развитие

133

2827

2833

Канке

M

Jambor

H

Reich

J

Марки

B

Gstir

R

2015

oskar РНК играет несколько некодирующих ролей, поддерживая оогенез и поддерживая целостность различия зародышевой линии / сомы

РНК

21

1096

1109

Кенни

A

Морган

МБ

Макдональд

PM.

2021

Различные роли соседних и структурно подобных A-богатых и поли (A) доменов мРНК oskar : только A-богатый домен необходим для функции некодирующей РНК oskar, которая включает позиционирование MTOC

Дев Биол

476

117

127

Kim-Ha

J

Smith

JL

Macdonald

PM.

1991

мРНК oskar локализована на заднем полюсе ооцита дрозофилы

Ячейка

66

23

35

Kim-Ha

J

Kerr

K

Macdonald

PM.

1995

Регулирование трансляции мРНК oskar с помощью Bruno, белка, связывающего РНК яичников, имеет важное значение

Ячейка

81

403

412

King

RC.

1970

Развитие яичников у Drosophila Melanogaster

Нью-Йорк, Нью-Йорк

Academic Press

Кумар

D

An

CI

Yokobayashi

Y.

2009

Условная интерференция РНК, опосредованная аллостерическим рибозимом

Дж. Ам Хем Соц

131

13906

13907

Larkin

A

Marygold

SJ

Antonazzo

G

Attrill

H

Dos Santos

G

2021

FlyBase: обновления базы знаний Drosophila melanogaster

Nucleic Acids Res

49

D899

D907

Лю

N

Ласко

P.

2015

Анализ интерференционных линий РНК позволяет идентифицировать новые функции материнских генов, участвующих в формировании эмбрионального паттерна у Drosophila melanogaster

G3 (Bethesda)

5

1025

1034

Mohr

S

Kenny

A

Lam

STY

Morgan

MB

Smibert

CA

2021

Противоположные роли Egalitar и Staufen в транспорте, закреплении и локализации мРНК oskar в ооците Drosophila

PLoS Genet

17

e1009500

Parisi

MJ

Deng

W

Wang

Z

Lin

H.

2001

Арест гена необходим для образования цист зародышевой линии во время оогенеза Drosophila

Бытие

29

196

209

Reveal

B

Yan

N

Snee

MJ

Pai

C-I

Gim

Y

2010

BRE опосредуют как репрессию, так и активацию трансляции мРНК oskar и действуют в транс

Dev Cell

18

496

502

Ryu

YH

Macdonald

PM.

2015

РНК, необходимые для некодирующей функции РНК oskar , также опосредуют регуляцию экспрессии белка Oskar с помощью фактора стабильности Bicoid

Дев Биол

407

211

223

Theurkauf

WE

Smiley

S

Wong

ML

Alberts

BM.

1992

Реорганизация цитоскелета во время оогенеза Drosophila : влияние на спецификацию оси и межклеточный транспорт

Развитие

115

923

936

Vazquez-Pianzola

P

Urlaub

H

Suter

B.

2011

Pabp связывается с 3’UTR osk и специфически способствует стабильности мРНК osk и накоплению ооцитов

Дев Биол

357

404

418

Webster

PJ

Liang

L

Berg

CA

Lasko

P

Macdonald

PM.

1997

Трансляционный репрессор bruno играет несколько ролей в разработке и широко сохраняется

Genes Dev

11

2510

2521

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Американского генетического общества.

Исследование эффективности, специфичности и эффективности лентивирусной библиотеки shРНК

Введение

Введение малых интерферирующих РНК (миРНК) в культивируемые клетки обеспечивает быстрое и эффективное средство подавления экспрессии генов и позволило миРНК быстро стать повсеместным инструментом в молекулярной биологии.Хотя было показано, что миРНК эффективна для кратковременного ингибирования генов в некоторых трансформированных линиях клеток млекопитающих, существует явная проблема ее использования в первичных культурах клеток или для стабильного нокдауна транскрипта. Недавно библиотеки shRNA в лентивирусных векторах были описаны и использованы для модуляции экспрессии генов в эмбриональных стволовых клетках человека (Zaehres, et al., Stem Cells , 2005), а также у трансгенных мышей (Ventura et al., PNAS , 2004). Мы протестировали лентивирусную библиотеку shRNA (The TRC Library) на ее способность преодолевать ограничения siRNA.Мы трансдуцировали первичную культуру астроцитов человека с помощью 16 вирусов, нацеленных на четыре различных гена, каждый из которых, как было ранее продемонстрировано, важен для функции астроцитов (p38a, p38d, MAP3K4 и JNK2). Во всех 16 случаях нам удалось стабильное инфицирование клеток и нокдаун целевого гена. Уровни ингибирования гена варьировались от 40% до 99% по сравнению с контрольной вирусной инфекцией. Затем мы исследовали специфичность нокдауна каждой изоформы AKT (AKT1, AKT2 и AKT3). Мы обнаружили для каждого гена shРНК, которые ингибируют одну изоформу-мишень, сохраняя при этом две другие изоформы. Наконец, мы протестировали панель клеточных линий, чтобы определить диапазон инфекционности этого вируса. В дополнение к первичной культуре астроцитов, вирус оказался эффективным в подавлении экспрессии генов в опухолевых клетках A549 (легкое человека), Panc1 (поджелудочная железа человека), HCT116 (толстая кишка человека) и HepG2 (печень человека). Это исследование демонстрирует, что кшРНК в лентивирусном векторе могут быть эффективным средством ингибирования РНК в широком спектре клеток, позволяя специфические и эффективные изменения генов и преодолевая общие ограничения миРНК.

Обзор

Молчание и нокдаун генов с использованием РНК-интерференции становится обычным делом. Конструкции короткой шпильки в некоторых случаях имеют преимущества перед siRNA, поскольку эффекты этих конструкций могут привести к более стабильному и долгосрочному результату. Конструкции лентивируса кшРНК MISSION ™ TRC обладают еще одним преимуществом, поскольку их можно использовать для легкой трансдукции типично сложных клеточных линий, таких как первичные астроциты, а также неделящихся клеток. Эту библиотеку коротких шпилечных конструкций можно использовать в широком спектре исследований, включая анализ отдельных генов, выяснение путей или даже функциональный скрининг в масштабе всего генома.

Мы исследовали вариабельный нокдаун, возникающий после инфицирования линии клеток опухоли легкого человека A549 четырьмя клонами, предназначенными для нацеливания на JAK1. Затем клон, обеспечивающий лучший нокдаун, был выбран для дальнейшего исследования на четырех других линиях клеток человека.

Специфичность ингибирования shРНК мишени также очень важна. Предыдущие исследования с использованием миРНК показали значительные нецелевые эффекты (Jackson, et al., Nat Biotechnol 2003). Линия клеток опухоли легкого человека A549 экспрессирует все три известные изоформы AKT (AKT1, AKT2 и AKT3).Считается, что ингибирование каждой отдельной изоформы приводит к фенотипическим различиям. Были исследованы конструкции, разработанные для всех трех изоформ, и проанализировано результирующее влияние на оставшиеся две изоформы.

Результаты

Были затронуты четыре разных гена. Минимально четыре различных конструкции shRNA были исследованы для каждого гена. Выбранные гены представляли гены, идентифицированные как релевантные для нормальных клеточных путей астроцитов: JNK2, p38a, p38d и MAP3K4 (Hasselblatt, et al., Нейрорепорт 2006; Yoo et al., Arch Pharm Res 2005). Препараты вируса, содержащие shРНК, успешно трансдуцировали 100% первичных обработанных культур астроцитов. После отбора с помощью пуромицина наблюдались различные уровни нокдауна (, фиг. 1, ).