Чем кормить мейн куна — правильное питание мейн куна

Мейн-куны — это самые большие домашние кошки в мире. Вес самца мейн-куна может достигать более 10 кг. Чтобы сохранить здоровье опорно-двигательного аппарата при таком весе, мейн-куну нужен специальный рацион. От природы это здоровые коты, но есть ряд анатомических особенностей, которые нужно учитывать, выбирая корм для мейн-куна.

Как выбрать корм для котят мейн-куна

Мейн-куны, по кошачьим меркам, очень долго растут. До 15 месяцев формируется их опорно-двигательный аппарат, которому предстоит носить на себе большую массу.

Трехмесячный мейн-кун весит около 2 кг — это вдвое больше, чем вес котят других пород в этом возрасте. ROYAL CANIN^® Maine Coon Kitten содержит кальций, фосфор и витамин D для того, чтобы поддерживать длительный рост котенка мейн-куна.

Кроме веса и темпа роста, котят этой породы с самого детства отличают от других пород более массивные челюсти. Поэтому крокеты корма ROYAL CANIN^® для мейн-кунов кубической формы.

Котенку придется тщательно разгрызать их, что не только даст нужную нагрузку на растущие зубы, но и сохранит гигиену ротовой полости. Сухой корм при разгрызании хорошо очищает налет и не дает ему превращаться в зубной камень.

Как выбрать корм для взрослых мейн-кунов

В естественных условиях кошки ловят добычу маленького размера, поэтому исторически употребляют пищу маленькими порциями (10–20 раз в день). За один раз взрослая кошка съедает примерно 5–6 грамм еды и тратит на это 1–2 минуты. За день кошка проводит у миски около получаса.

Исследования показали, что сиамская кошка и мейн-кун едят быстрее, чем другие породы: около 4 г в минуту, тогда как, например, персидская кошка съедает 1,7 г в минуту. Это значит, что корм для мейн-куна обязательно должен содержать крокеты такой формы, чтобы животнное разгрызало их, а не быстро проглатывало.

Начиная с 15 месяцев можно постепенно переводить мейн-куна с корма для котят на корм для взрослых кошек — с такими же кубическими крокетами, как и у котенка.

Коту будет привычно их есть, а размер и плотность будет уже чуть больше — под сформировавшиеся челюсти.

Однако стоит иметь в виду, что ни один корм не заменяет необходимую профилактическую процедуру чистки зубов для кошек любого возраста. Животные, которым не чистят зубы (это нужно делать один раз в день) чаще всего страдают гингивитом, пародонтозом и в итоге раньше изнашивают зубы, что для кошки — серьезная физическая травма.

Котятам можно начинать чистить зубы мягкой тканью, постепенно переходя на специальную зубную щетку и пасту. Паста для человека не совсем подходит, так как животные не любят ароматизаторы, содержащиеся в ней.

Влажный корм для мейн-кунов

Вода должна быть у котят и взрослых кошек круглосуточно. Можно также ввести в рацион влажный корм, который разнообразит питание мейн-куна. Кошки гораздо более привередливы в еде, чем собаки, — им нравятся разные текстуры корма. Поэтому вы можете чередовать влажный и сухой корм или давать и то, и другое, соблюдая дозировку на упаковке.

Если даете и сухой и влажный, продукты то суточное количество сухого нужно уменьшить на 1/3.

Особенности питания мейн-куна

Согласно данным OFA (Ассоциации ортопедии животных), 22,5% кошек породы мейн-кун страдают дисплазией тазобедренных суставов (исследовано 831 животное). Как и у крупных собак, у крупных котов из-за большой массы повышен риск заболеваний опорно-двигательного аппарата. Поэтому в составе корма ROYAL CANIN^® есть специальные профилактические комплексы (омега-3 и минералы, витамины для здоровья суставов и костей).

Кроме дисплазии мейн-куны также в группе риска сердечных патологий (гипертрофическая кардиомиопатия) — объем сердца увеличивается слишком сильно, особенно левый желудочек. У мейн-кунов была обнаружена мутация гена протеина С, связывающего сердечный миозин. Добросовестные заводчики делают анализы родителям котенка, чтобы исключить такую патологию. Однако иногда она проявляется спустя годы. Животным старше одного года ежегодно рекомендовано прохождение УЗИ сердца.

Поэтому при малейшем подозрении на сердечную патологию (слабость, одышка, обмороки) покажите кота ветеринарному врачу. А для профилактики сердечных заболеваний выбирайте корм, содержащий таурин, EPA и DHA — они поддерживают функцию крупного сердца мейн-куна. Купить корм для мейн-куна можно здесь.

Также обязательны серосодержащие аминокислоты, витамины, жирные кислоты омега-3 и омега-6 для здоровья кожи и роскошной шерсти мейн-куна.

Быстрый протеин в продуктах. Быстрые белки после тренировки

Белок еще называют протеином. Он является строительным материалом, все клетки нашего организма состоят именно из него. Он принимает активное участие в росте мышц, кожи, волос, ногтей. Самым прямым образом от еды, которая содержит белок, зависит то, как выглядит наша фигура. И это подтвердят люди, которые сидели на диетах, исключающих любое мясо: да, стройность приходила быстро, но унылый внешний вид и обвисшие мышцы радость не дарили.

Еще одной немаловажной ролью белка является то, что он способен формировать иммуноглобулин. Именно от того, достаточно ли мы получаем протеина, зависит, насколько крепкий наш .

Наше настроение, трудоспособность также напрямую зависит от количества употребляемого белка. Если организм испытывает его дефицит, то он начинает самостоятельно его воспроизводить, затрачивая на это собственные ресурсы. Недостаток белка покрывается, в первую очередь, протеином из мышц.

Безусловно, нельзя не учитывать, что из протеина состоят ферменты и гормоны, от которых самым прямым образом зависит состояние нашего здоровья. Белок оказывает прямое воздействие на регулировку нашего .

Какой белок выбрать?

Белок содержится во многих продуктах животного и растительного происхождения. Но врачи рекомендуют все же обращать внимание на первую категорию. Связано это как раз с составом самого белка.

Дело в том, что в белок состоит из аминокислот, их в нем содержится больше 20 видов. Аминокислоты, в свою очередь, подразделяются на заменимые и незаменимые. Заменимые как раз может «воспроизводить» сам организм в случае дефицита. К ним относятся аланин, аспарагиновая кислота, аспарагин, пролин, глицин, глютамин, серин, цистеин, тирозин.

А вот незаменимые аминокислоты, к которым относятся аргинин, валин, лизин, лейцин, гистидин, метионин, триптофан, фенилаланин, можно получить исключительно из пищевых продуктов. И именно ими не особенно богата растительная пища.

Быстрые и медленные белки

Еще одним преимуществом белковой пищи является то, что на ее переваривание организм затрачивает очень много энергии. Чтобы количество этой энергии увеличить, следует употреблять в пищу белки, которые называют «медленными». Они полностью усваиваются организмом лишь через 6-8 часов, на что затрачивается очень много энергии.

Обычно медленный белок построен на основе казеина. Как известно, его очень много в твороге. Также к медленному белку можно отнести овсяные хлопья, сою, растительные белки.

К быстрым белкам относится молоко, сыворотка, и т. п. с низким процентом жирности. Такие продукты быстро усваиваются организмом, их рекомендуют употреблять в пищу людям, занимающимся спортом, непосредственно перед тренировками.

Самый полезный белок

Жир значительно затрудняет усвоение белка организмом. Именно поэтому очень важно обращать внимание на то, насколько продукт жирный и на то, как он приготовлен. Жареным блюдам очень важно предпочитать пропаренные или максимум, печеные в духовке.

То же касается и жирности самого продукта. Нежирные вырезки мяса, обезжиренные молочные продукты – только такие блюда насытят ваш организм белком и будут полезны для вашей фигуры.

Одним из самых полезных и легкоусвояемых белковых продуктов является куриное яйцо. Связано это с низким содержанием в нем жиров. Лучше всего его употреблять в пищу в вареном виде. А что касается желтка, то он содержит очень много холестерина и обладает сильным желчегонным действием, потому от него или лучше совсем отказаться, или кушать не больше 1-2 шт. в день.

Сколько необходимо употреблять белка

Конечно, всему должна быть мера. Основная «беда» – это полный отказ от углеводов, чего делать, конечно, нельзя.

Врачи считают, что количество съедаемого белка должно составлять около 20 % вашего дневного рациона.

Другими словами, получается, что в сутки необходимо съедать по 0,5-1 г на каждый килограмм веса. Правда, при интенсивных занятиях спортом врачи рекомендуют увеличить количество употребляемого белка. А для детей эта норма составляет от 1,5 до 4 г на каждый килограмм веса.

Продукты, содержащие белок

МирСовeтов предлагает ознакомиться со списком самых популярных продуктов, в которых содержится белок. Помните о том, что только их правильное приготовление обеспечит вас и вашу семью полезным и правильным питанием.

1. . Соя – это растение пришло к нам из семейства бобовых. Как это ни странно, но она обладает самым высоким показателем содержания белка на 100 г: в самой сое 35 г, а в соевом мясе 52 г. Она является любимым продуктом и является «заменителем» мяса. Правда, некоторые ученые все же утверждают, что соя не содержит в себе достаточно аминокислот, необходимых организму, а потому рекомендуют ее чередовать с белками животного происхождения.
2. На втором месте по количеству протеина находится икра. В первую очередь, это осетровая или так называемая черная икра. В ней содержится почти 30 г белка на 100 г продукта. Немало протеина и в .
3. Арахис, пожалуй, самый белковый среди орехов. Содержание в нем протеина составляет 26 г. Но очень важно учитывать, что употребление жареного арахиса не принесет фактически никакой пользы. Его лучше всего употреблять исключительно в сыром или сушеном виде.
4. Как уже говорилось выше, сыр также является полезной белковой пищей. В нем содержится до 24 г этого питательного вещества. Но помните основное правило – покупать сыры нужно с невысоким содержанием жиров.
5. является одним из любимых продуктов вегетарианцев как раз из-за высокого содержания в нем белка. Но при этом он отлично усваивается организмом и повышает работоспособность. Также он обладает очень богатым составом микроэлементов, включая довольно редкие витамины и минералы. Протеина в нем содержится 23 г на 100 г продукта.
6. В фасоли белка немного меньше, 22 г. Но она также полезна для нашего организма, улучшает работу мозга, потому врачи очень рекомендуют чаще употреблять ее в пищу.
7. В любимой диетологами и врачами куриной грудке содержится 21 г протеина на 100 г продукта. Очень важно употреблять ее в печеном или вареном виде, тогда ваша фигура и ваше здоровье скажут вам «спасибо».
8. Семена подсолнуха или просто обычные семечки также являются отличным источником белка, а по содержанию этого питательного вещества их можно сравнить с куриной грудкой – 21 г на 100 г семечек. Но не стоит ими слишком увлекаться, так как они очень калорийны и содержат довольно много жиров.
9. Телятину диетологи рекомендуют обязательно включать в свой рацион. Помимо высокого содержания белка – чуть больше 20 г, в ней содержится богатый состав витаминов и микроэлементов. Она очень полезна для нервной, пищеварительной системы и для нашей кожи.
10. В говядине белка чуть меньше – 20 г, но она мало чем уступает телятине и является отличным диетическим мясом.
11. и морепродукты являются незаменимым кладезем протеина. Но еще одно ее преимущество заключается в том, что все питательные вещества, которые в ней содержатся, в том числе и жиры, отлично усваиваются организмом. Лидерами по содержанию белка являются белуга, горбуша, сардина, семга. Самое низкое содержание этого питательного вещества – в устрицах и составляет 14 г на 100 г продуктов.
12. В твороге содержится 18 г белка, но всегда помните, что выбирать нужно исключительно нежирный продукт.
13. Свинина тоже отличный источник протеина (16 г на 100 г), но из-за высокого содержания в ней жира ее не очень «любят» диетологи. Но если вам свинина по душе, то можно кушать вырезку, в ней содержится меньше всего жиров.
14. Крупы тоже являются отличным источником белка, особенно если речь идет о гречневой и овсяной каше. Содержание в них протеина приблизительно одинаково и составляет 12-13 г.
15. Белок куриного яйца полностью усваивается человеческим организмом. Протеина в нем содержится приблизительно 6 г из расчета на одно яйцо.

Является строительным материалом нашего организма, а кроме того — еще и источником энергии. Вот почему так важно включать в свой рацион данную разновидность органических веществ. Подобно , белки бывают медленными и быстрыми. Познакомимся с этими понятиями подробнее.

Что такое быстрые белки

Данная разновидность протеинов отличается повышенной степенью усвояемости и переваривания. Их переработка при попадании в организм человека происходит всего за несколько часов, а сам факт нахождения во внутренней среде тела не вызывает ни малейшего дискомфорта.

Быстрые белки идеальны для спортсменов и тех людей, что регулярно испытывают тяжелые физические нагрузки. Кроме того, быстрые белки незаменимы для лиц, часто подвергающихся , так как в короткие сроки восполняют количество калорий, сгоревших в результате повышения в крови уровня гормона стресса кортизона. Согласно мнению диетологов, употреблять этот вид протеинов следует незадолго до начала тренировки, а также через 30-60 минут после окончания спортивного занятия. Это поможет организму спортсмена быстрее прийти в норму после нагрузки. Прием быстрых белков рекомендуется осуществлять небольшими порциями. Показатель их усвоения равен единице или максимально приближен к этому значению.

Что такое медленные белки

Медленными называют протеины, которые, в противовес быстрым белкам, усваиваются организмом человека достаточно длительно. Средняя продолжительность переработки этого вида белков варьируется от пяти до восьми часов. Медленные протеины весьма полезны людям, поставившим перед собой цель сбросить вес. Они превосходно и надолго утоляют чувство голода, восстанавливают мышцы, обогащают их и предохраняют мускулатуру от разрушения во время соблюдения строгих . Наилучшим образом медленные белки работают в указанном направлении, если их употреблять перед сном. За ночь они успевают без проблем перевариться и усвоиться организмом на 100%. К тому же, такой подход избавляет человека от вероятности возникновения среди ночи необузданного желания полакомиться чем-нибудь вкусненьким и калорийным. Показатель усвоения медленных белков не дотягивает до 1, причем существенно.

Примеры быстрых и медленных белков

Если прислушаться к точке зрения врачей, то выходит, что самыми полезными для организма человека являются протеины животного происхождения. Они содержат наиболее полный набор аминокислот — как заменимых, так и незаменимых — потому их называют полноценными белками.

Быстрые животные белки

Фото: быстрые и медленные белки

• (филе), в идеале — белое мясо куриной грудки. Оно содержит 25 г чистого белка в пересчете на 100 г продукта. Показатель усвоения курятины — 0,92.
• — источник быстрого белка, по количеству протеинов и скорости переработки организмом подобна куриному филе.

• Постная и — в этих видах мясных лакомств присутствует около 30 г быстрого протеина. Коэффициент переваримости составляет 0,92.
• и кисломолочные напитки. В состав первого входит 3 г белка, обогащен медленным протеином на 5 г, — на 4,5 г. Сюда же можно отнести . Главное, чтобы все эти продукты обладали низким процентом жирности. Они имеют стопроцентное усвоение. Из сывороточного протеина организмом поглощается в час до 10 г аминокислот.
• (окунь, щука) и ( , ). Количество белка в них приравнено к 17-21 г. данные деликатесы усваиваются организмом человека на 90%.
• — считается наиболее быстрым из всех существующих. Он усваивается полностью и содержит 15 г протеинов, из которых в час организм человека забирает себе до 1,5 г аминокислот.

Источники медленных белков

Фото: быстрые и медленные белки

Медленный белок животного происхождения — это , на усвоение которого требуется 6-8 часов. К указанному типу данный продукт относят благодаря наличию в нем большого количества казеина. Львиная же доля таких протеинов присутствует в растительной пище. Наилучшими источниками их служат:

• — (23 г белка), (35 г), (26 г), (22 г). Процент усвоения перечисленных продуктов варьируется от 52 до 91%.
• Злаки и крупы, хлопья, произведенные из них — овес и (12 г белка), пшеница (13 г), рожь (11 г), кукуруза (8 г), (7 г), (13 г). Коэффициент усвоения лакомств — 0,54-0,66.

Более низкие показатели характерны для овощей, крахмалосодержащих корнеплодов, грибов, и свежих плодов.

Когда принимать быстрые и медленные белки

Чтобы разные типы протеина оказали на организм максимально положительное воздействие, следует придерживаться следующих правил их употребления.

• Если вы продолжительно заняты напряженной умственной работой, лакомьтесь с утра казеиновым коктейлем вместо завтрака. Как вариант, можно во время утренней трапезы скушать порцию обезжиренного творога.
• Перед тем, как лечь спать, также лучше отдать предпочтение источнику казеина, то есть медленным белкам животного происхождения.
• По окончании спортивных нагрузок осуществите прием аминокислот в составе сывороточного протеина (кружка молока или порция белкового коктейля).
• Регулярное употребление источников сывороточного протеина показано атлетам, занимающимся бодибилдингом. Паузы между приемами быстрого белка не должны быть меньше трех часов.
• Если вам приходится пропускать один или два основных приемов пищи, вас выручат источники казеина, то есть медленные белки. Благодаря им вы надолго забудете о чувстве голода.
• Для получения заряда бодрости и энергии рекомендуется употребить продукты, насыщенные быстрыми протеинами, желательно животного происхождения.
• Белковую пищу необходимо подвергать умеренной тепловой обработке (приготовление на пару, гриле, запекание в духовке, варка), а для облегчения переваривания и усвоения хорошенько ее измельчать. Если решите приготовить домашний протеиновый коктейль, используйте для смешивания компонентов блендер.

Фото: быстрые и медленные белки

Важно также уметь сочетать разные виды белков для получения максимального усвоения поступающей в желудок пищи. Хорошие результаты в этом плане дает совместное употребление яичного белка и блюд из кукурузной крупы, вареного , пшеничной муки или фасоли. Отлично усваиваются комбинации «соя и пшено», «рожь и молоко».

Быстрые и медленные белки одинаково нужны как организму худеющего человека, так и тому, кто мечтает набрать вес. Однако благотворное свое влияние они окажут на здоровье представителей обеих групп лишь в случае соблюдения рекомендуемой нормы употребления протеинов и сбалансированного по основным питательным компонентам рациона. В день человек должен получать от 0,5 до 1,5 г чистого белка на 1 кг массы тела. При ведении активного образа жизни, частых стрессах, серьезных физических нагрузках и занятиях спортом это количество следует увеличить до 5-7 г.

В научной терминологии протеин определяется как вещество, в состав которого входит цепочка аминокислот, создающая полипептид. Анализируя белок при попадании в организм, можно выделить 20 аминокислот, собранных путем соединения различными способами, в результате чего создается множество соединений, разнообразных по составу и своим функциям.
При желании набрать мышечную массу, необходимо иметь достаточный уровень азота, который достигается путем добавления белков в пищу. Из всех представленных, ферментативные функции белка считаются наиболее значимыми. Именно они являются катализатором в реакциях биохимического процесса, и обменного. За формирование цитоскелета клеток несут ответственность структурно-механические задачи. Стоит отметить значимость белков в цикле клеток, иммунной и сигнальной системах.

История изучения белка

Известный химик из Франции Антуан де Фукруа с группой ученых исследовали весь класс белковых, вследствие чего выявили возможность белков к коагулированию (денатурированию) при действии нагревания,или кислот. Значительное внимание было уделено изучению альбумина, фибрина, глютена.

Состав белков продолжили исследовать, в результате чего выяснили, что аминокислоты образуются при реакции гидролиза белков. Такие аминокислоты как глицин и лейцин получили свою характеристику. Гипотеза о существовании сходной эмпирической формулы для белков была выдвинута Герритом Мульдером. Через небольшой период времени он уже представил свою модель химического строения белка. Опираясь на теорию радикалов, Мульдер вывел состав минимальной структурной единицы белка C40H62N10O12, получившую название «протеин»(Pr), а теория — «теорией протеина». Ученый полагал, что составляющими каждого белка считаются фосфор, единицы протеина, и сера. Именно он записал формулу фибрина следующим образом:10PrSP. Занимаясь исследованиями аминокислот, Мульдер определил молекулярную массу (131 дальтон), допустив небольшую погрешность. Поступило много новой информации о белках, но несмотря на критику, теория протеина считалась общепризнанной до конца 1850-х.

Много исследовательских проектов в тот период посвятили аминокислотам, входящих в состав белков в конце XIX века. К примеру, А.Я. Данилевский, ученый из России выделил наличие пептидных групп (CO-NH) в молекуле белка. Чуть позже, в 1894г. Альбрехт Коссель, немецкий профессор физиологии утверждал в своей теории, что аминокислоты – главные структурные элементы белков. В начале XX века Эмиль Фишер путем эксперимента привел доказательство, что составляющая белков – это аминокислотные остатки, находящиеся в пептидной связи. Проанализировав аминокислотную последовательность белка, он пояснил явление протеолиза.

В 1926г. Джеймс Самнер, американский химик, выявил, что фермент уреаза — это и есть белок.

Следующие легкоочищаемые полипептиды применялись для исследований: белки крови, куриных яиц, разнообразных токсинов, метаболических, пищеварительных ферментов, которые выделялись после забоя скота, так как извлечение чистых белков было нелегкой задачей.

В 1950-х одна из американских компаний «ArmourHotDogCo» получила возможность очистить килограмм бычьей рибонуклеазы А, впоследствии ставшей объектом экспериментов во многих исследованиях.

Учильям Астбери полагал, что вторичная структура белков считается итогом образования водородных связей между аминокислотными остатками, но Лайносу Полингу первому удалось доказать вторичную структуру белков.

Взяв за основы работы Кая Линдерстрема-Ланга, Уолтер Краузман сделал большие успехи в области законов образования третичной структуры белков и гидрофобных взаимодействий.

Над методом секвенирования белков работал Фредрик Сенгер. В своих трудах он дал дифиницию аминокислотной последовательности двух цепей инсулина, убеждая всех, что белки считаются не разветвленными цепями, а линейными полимерами аминокислот. Первой аминокислотной последовательностью белка, постановленной учеными СССР принято считать аспартатаминотрансфераза.

С 1950-го с помощью дифракции рентгеновских лучей были получены результаты изначальных пространственных структур белков. Позже исследовались структуры открытия посредством ядерного магнитного резонанса. Известно, что в 2012 году в Банке данных о белках находилось приблизительно 87000 различных структур белков.

Сейчас исследование белков находится на абсолютно другом уровне, включая в изучаемые объекты очищенные белки, посттрансляционные модификации белков отдельных клеток, тканей и целых организмов в целом. Этот раздел биохимии имеет название протеомика. Биоинформатика дает нам шанс обработать информацию рентгеноструктурного анализа, предположить структуру белка, взяв за основу его аминокислотную последовательность. Криоэлектронная микроскопия крупных белковых комплексов приближена до атомарной точности, впрочем, как и использование компьютерных программ в предсказании пространственных структур белковых доменов.

Белковые продукты и их биологическая ценность

Аминокислотный состав и перевариваемость, безусловно, влияют на биологическую ценность белка. При воздействии ферментов желудка, кишечника, и поджелудочной железы белок пищевых продуктов попросту распадается на то, из чего он состоит: аминокислоты, поступающие в кровь для образования белков.

Существует две функциональные группы: отвечающая за кислотные свойства молекул — карбоксильная, и придающая фундаментальные свойства этим соединением – аминогруппа. 8 из 20 аминокислот не образуются естественным путем, ввести в организм их можно только с помощью пищи.

• Аминокислоты
• Заменимые
• Незаменимые
• Аланин
• Валин
• Аргинин
• Гистидин
• Аспарагин
• Изолейцин
• Аспарагиновая кислота
• Лейцин
• Глицин (гликокол)
• Лизин
• Глутамин
• Метионин
• Глутаминовая кислота
• Треонин
• Пролин
• Триптофан
• Серин
• Фенилаланин
• Тирозин
• Цистин

Каждая аминокислота имеет свои исключительные функции. Метионин оказывает вспомогательное действие для образования холина, регуляции обмена жиров, но также имеет отрицательные показания. По завершении физических нагрузок нежелательно принимать желатиносодержащие продукты, потому что метионин не позволяет удалить жир из печени,будучи подавленным гликоколом и регулируя обмен жиров.

Белок будет легко усвоен организмом при полном балансе в нем аминокислот. В случае отсутствия одной аминокислоты, построение белков не будет столь функциональным. Белки с биологической ценностью высокого уровня имеют отличие быстро усваиваться, поддерживать в аминокислотах баланс, и с легкостью перевариваться. Сюда можно отнести белки из молочной продукции, яиц, рыбы и мяса, удаляя соединительную ткань.

Растительные белки не имеют таких качеств из-за отсутствия баланса в составе аминокислот. К примеру, при недостаточном количестве лизина, ценность белков хлебных изделий будет весьма занижена. При рассмотрении круп и их содержания, только гречневая имеет достаточное количество лизина и треонина. Большинство продуктов растительного происхождения перевариваются с трудом. Происходит это из-за наличия на них оболочки из клетчатки и прочих веществ, которые блокируют действие расщепления. Элементы, находящиеся в составе бобовых препятствуют положительному действию пищеварительных ферментов. Высокий процент всасывания аминокислот – более,чем 90% – можно получить из белков животных продуктов, до 80% из растительных. Самая высокая скорость переваривания у белков молочной продукции, хлебобулочных изделий и различных круп, рыбы и мяса, причем на переваривание последних уходит больше времени из-за соединительной ткани.

Коэффициент усвоения белка

Коэффициент усвоения пищевых белков оказывает большую помощь в определении их качества. В его расчет включается аминокислотный состав и полнота переваривания белков. Продукты с коэффициентом 1.0 можно считать самыми насыщенными источниками в получении белка.

Белок в вашем питании

В нашем организме постоянно и расходуется, и обновляется белок, что в очередной раз доказывает всю необходимость и важность данного вещества. Протеолиз и замена белков в цитоплазме клеток происходят безостановочно. Если на сутки отказаться от принятия пищи, 23г белка будет разрушено и при этом выделится 3.7г азота. В случае получения белка путем принятия пищи, будет выделено гораздо большее число азота. Для поддержания правильного уровня белков, необходимо помнить закономерность: чем больше количество вводимых белков, тем больше их будет разрушено. Отличительной чертой белков от углеводов и жиров считается свойственность не откладываться в резервах. Белки- незаменимая часть пищи, поскольку не могут образоваться за счет иных пищевых веществ. Белок является второстепенным в качестве источника энергии, и может быть заменен углеводами и жирами. 1г белка дает 16.7 кДж при окислительном процессе.

Соматотропный гормон, вырабатываемый гипофизом, гормон щитовидной железы тироксин и слюкокорткоид коркового вещества надпочечников оказывают влияние на белковый обмен.
Белки являются основой нашего организма, составляя около 17% от общей массы тела, 50% из них уходит на расход мышц, 20% на хрящи, кости, а 10% на кожу.

Белки и Виды протеина по происхождению

Животные белки наиболее рекомендуются к употреблению, поскольку они легкоусвояемые, и содержат много чистого белка. Но при этом не стоит забывать, что не следует зацикливаться на одном белковом продукте, ваш ежедневный рацион должен быть разнообразен.

«Быстрые» и «медленные» белки

Заострим свое внимание на второй категории, так как именно она позволяет достичь результатов в двух самых распространенных действиях: наращивании мышечной массы и похудении.
Вторая категория белков пользуется большой популярностью, потому что именно «медленные белки» помогут избавиться от лишнего веса и нарастить мышечную массу. Содержание калорий в «медленных» белках меньше, энергии они требуют больше, и на усвоение затрачивается больше времени. Творог — один из представителей продуктов, относящихся к этой группе. У организма занимает до 8 часов на его усвоение. При употреблении «медленных» белков большое внимание уделите времени приема. При цели набрать мышечную массу рекомендуется употреблять его перед сном, что поможет без неудобств переварить пищу, обогатив аминокислотами ваши мышцы. Благодаря своему свойству перевариваться медленно, данный продукт также подойдет при отсутствии возможности продолжительное время принимать пищу, не давая вам ощутить чувство голода.

«Быстрый» белок же в свою очередь усваивается организмом в разы быстрее. Он прекрасно подойдет для людей, занимающихся спортом. Употреблять его лучше перед началом тренировки или непосредственно после. В это время организм как никогда нуждается в восстановлении.

Список предпочитаемых белковых продуков : нежирные сыры, обезжиренный творог, яичный белок, большинство свежей рыбы и морепродукты, нежирная телятина, молодой барашек, куры, индейка, предпочтительно белое мясо без кожицы, соевое мясо, соевое молоко или соевые сыры.

Менее предпочтительные продукты: темное мясо кур и индеек, домашний творог, нежирная нарезка холодного копчения, красное мясо (вырезка), переработанное мясо: бекон, салями, ветчина, молоко и йогурты с добавлением сахара.

Подвергаемые тепловой обработке, белки имеют лучшую усвояемость, и станут более доступными для ферментов желудочно-кишечного тракта. Но опять же, нельзя забывать, что биологическая ценность белка из-за этого будет понижена.

Термическая обработка поможет в более быстром переваривании белков, можно убедиться в этом на примере вареных или сырых яиц. Для увеличения скорости переваривания и усвоения белков, продукты необходимо более тщательно разваривать, измельчать блендером, или протирать через сито. Помните, перегревание имеет отрицательное влияние на аминокислоты. Для примера, с температурой 200 ° С,биологическая ценность казеинового молочного белка упадет на 50%. Чтобы при высокой температуре и долгом нагреве, уровень лизина не уменьшался, предварительно замачивайте крупы, что позволит сохранить все полезные свойства.

Комбинируйте животные и растительные продукты, это непременно окажет положительное действие на баланс аминокислот в вашем организме. Включите в свое меню: молочные продукты с крупами, макаронными, хлебобулочными изделиями, творог, мясо, рыбу, картофель, овощи с мясом и не забудьте про бобовые.

Доминирование белков с низкой биологической ценностью, недостаточное содержание аминокислот и белка в рационе – все это неизбежно ведет к белковой недостаточности. Калорийность должна быть в норме, чтоб не допустить недостачу белков в употребляемом рационе и не ухудшить усвоение уже поступившего белка.

Преимущества в избытке белка отсутствуют, это ведет к повышенной нагрузке на почки и печень, возможному усилению напряжения секреторной функции пищеварения, азотистого обмена со сдвигом кислотно-основного состояния в кислую сторону, это естественно замедляет процесс восстановления.

Суточная потребность в белке. Исходя из данных многих источников, организм человека не способен синтезировать более 18 г белка в сутки, поэтому прибавление чистой мышечной массы более 500 г в течение месяца невозможно, а общей массы на 2-2,5 кг. Соблюдайте общие правила и не переступайте допустимых норм. На 1 кг веса спортсмена необходимо в 2-3г. белка в сутки, а в дни без тренировок 1-2, 5 г на 1 кг веса тела. Если ваша основная задача – прибавка мышечной массы, вам понадобится 2, 0-2, 4 г на 1 кг веса тела; для рельефности — 1, 4 — 2, 4 г на 1 кг; в переходном периоде 1, 0-1, 2 г белка на 1 кг; в период соревновательного цикла — 1, 4-1, 8 г на кг вашего веса.

Но есть и сторонники теории «пресыщения», утверждающие, что дополнительное количество белка могут принести положительный результат. При пересыщении для организма никакая сложная реакция не обернется стрессом, поэтому именно для достижения максимально быстрой прибавки мышечной массы некоторые врачи-диетологи берут вышеуказанную теорию за основу.

Таблица потребностей в белке спортсменов — культуристов из расчета

2, 5 — 3 г на 1 кг собственного веса.

Корал Протеин Бар

Рады приветствовать Вас на нашем проекте!   Наше движение «Я ЗДОРОВ» активно развивается в Санкт-Петербурге и Ленинградской Области. Движение было основано в 2014 году. К большой общей радости, наша команда растёт с геометрической прогрессией. Мы обучаем на собственном примере, как изменить себя в лучшую сторону, используя натуральные продукты экомаркета CORAL CLUB.   В нашем движении десятки тысяч личных историй здоровья. Каждая история здоровья — это судьба, каждая инвестиция в здоровье имеет результат! Мы делаем всё, чтобы соответствовать девизу CORAL CLUB : «Делать Мир Красивым»! Это учит нас любить этот мир, начиная с самих себя, инвестировать в своё здоровье, получая высокие результаты. Проходя наши программы, мы сами становимся живым примером для близких и всех окружающих. Наше движение — это помощь людям, открывать для себя комплексный подход к своему здоровью. Применяя простую концепцию здоровья, вы сэкономите своё время и деньги.   Научим, как пить правильную воду, очищаться, кормить организм полезными продуктами, минералами, витаминами, защищаться и, конечно же, активно двигаться на свежем воздухе. Девиз и уникальность проекта: «ИЗМЕНИ СЕБЯ ЗА 21-45-90 ДНЕЙ» уже стал визитной карточкой нашей команды и эти изменения касаются различных сторон жизни, здоровья и успеха. Coral Club также знают в России и за рубежом как “Коралловый клуб”, “Коралловый мир”, “Коралловую страну”. Но для нас наш клуб – это большая, многонациональная и очень дружная «Коралловая семья». Мы одними из первых в мире занялись вопросами улучшения качественного состава воды и предложили всему миру продукт Coral-Mine. Сегодня он популярен и продается в 38 странах мира. В нашем продуктовом портфеле более 200 продуктов для здорового образа жизни – все то, что составляет ваш Lifestyle – Здоровье, Красота, Дом. Lifestyle – это культура нового качества жизни, и для того чтобы она прижилась, она должна долго и постоянно присутствовать в обществе. Это особый стиль жизни, которым хочется делиться со своими близкими. Мы хотим, чтобы люди сами ставили себе цели и делали свой собственный выбор в пользу интересного занятия, чистого дома, долгих лет красоты и здоровой жизни. У нас есть для этого готовые решения: для поддержки организма, полноценного клеточного питания, укрепления иммунитета, здоровья сердца и сосудов, костей и суставов, для комплексной детоксикации организма и снижения веса с В концепции Lifestyle Coral Club вы найдете ответы на многие вопросы. Приглашаем всех желающих изменить себя и свою жизнь к лучшему!

Способы прокачивания EVs. — Pixelmon.PRO Пиксельмон ПРО

EVs — это скрытая статистика покемона, которая показывает в какую из сторон был прокачан покемон.

[ВСЕ ВИДЫ EVs]:
• HP EVs — Здоровье.
• Attack EVs — Атака.
• Defense EVs. — Защита.
• Sp. Attack. — Специальная Атака.
• Sp. Defense — Специальная Защита.
• Speed — Скорость.

=

[ИНФОРМАЦИЯ О EVs]:
• Общее количество EVs — 510.
• Одну из статистик можно прокачать не более чем до — 252.
• Можно прокачивать EVs в виде ПВП битв и битв с покемонами.
• EVs можно повысить/снизить с помощью — витаминов и ягод.
• Удвоенный EVs может получать покемон, имеющий «Покевирус». Подробнее о покевирусе можно узнать — тут.

▞▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▚
ЯГОДЫ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ EVs
▚▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▞
Ягода Помег — понижает EVs ОЗ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.
Ягода Келпси — понижает EVs АТАКУ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.
Ягода Ходью — понижает EVs СПЕЦ.АТАКИ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.
Ягода Квалот — понижает EVs ЗАЩИТЫ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.
Ягода Грепа — понижает EVs СПЕЦ.ЗАЩИТЫ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.
Ягода Тамат — Понижает EVs СКОРОСТИ покемона — на 10 единиц. Добавляет: 2; 5; 10 счастья покемону, в зависимости от изначального.

▞▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▚
ВИТАМИНЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ EVs
▚▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▞

HP увеличение — (+10HP EVs)
Протеин — (+10 Attack EVs)
Железо — (+10 Defence EVs).
Кальций — (+10 Special Attack EVs).
Цинк — (+10 Special Defence EVs).
Углеводы — (+10 Speed EVs).

▞▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▔▚
БРАСЛЕТЫ ДЛЯ УСКОРЕНИЯ ПРОКАЧИВАНИЯ EVs
▚▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▁▞

НОЖНОЙ БРАСЛЕТ МОЩИ — +4, к EVs скорости.
ЛЕНТА МОЩИ — +4, к EVs специальной защиты.
ПОЯС МОЩИ — +4, к EVs защиты.
БРАСЛЕТ МОЩИ — +4, к EVs атаки.
ГИРЯ МОЩИ — +4, к EVs здоровья.
ЛИНЗА МОЩИ — +4, к EVs специальной атаки.

[!] Чтобы посмотреть какой покемон выдает определенную статистику EVs при убийстве, прошу перейти на официальный сайт мода — тут.[!]

​

[Информация по данной теме]:
◘ Вся информация для полной точности была взята с официального сайта мода и игровой информации проекта PIXELMON.PRO.
◘ Дальнейшее копирование запрещено.
◘ Автор: ZeeM. ​

ты чо сделал ты серому фотоаппарат прострелил

Теги: стрим, реакция, приколы, стрим майнкрафт, юмор, minecraft, stream, among us, бравл старс, сервер майнкрафт, among us гайд, among us забавные моменты, among us взлом на скины, among us взлом на скины ios, among us взлом на айфон, among us в роблокс, among us взлом мод меню, minecraft выживание, among us взлом, стримы, юлик, видео майнкрафт, майнкрафт выживание, майнкрафт стрим, моды, стрим по майнкрафту, стрим оценка каналов, among us в чем смысл, минекрафт, в майн, стример, among us бустер предатель, игры, among us без интернета, маинкрафт, летсплей, эдисон, стрим minecraft, among us баги, among us бесплатные скины, among us читы, among us в реальной жизни, among us обзор, among us приколы, among us анимация, аид, компот, чатрулетка, неркин, чат рулетка, в майнкрафт, among us баг на скины, троллинг, майнкрафт мифы, стрим по майну, лололошка, мистика, майнкрафт с подписчиками, игра, among us в майнкрафте, майн, рулетка чат, реакция в чат рулетке, выживание, лучшие приколы, девушка в чат рулетке, яна солнцева, yana shine, приколы в чат рулетке, жесть в чат рулетке, девушка с мужским голосом, стеб, мейк, грим, розыгрыш, голос, стримерша, пранк, транс-девушка, видео чат, транс-женщина, трансгеднерная девушка, трансгендер, чат рулетка стрим, рулетка, among us как играть, майнкрафт, #майнкрафт #minecraft #стрим #майн, transgender, чат рулетка голос, трансгендер в чат рулетке, chat roulette, чат-рулетка, транссексуалка, реакция людей, ламповый стрим майнкрафт, майнкравт, стрим хайпиксель скайварс, максим го лайв, стрим бедварс, пати на хайпикселе, стрим хайпиксель бедварс, играем на хайпикселе, хайпиксель, ip камера, майнфлекси, hd, прохождение, задонатили қққ говно как сделать дом, wolf, амонг ас, camera (invention), вап, кпфукп, зывапотап, ывп, вфапв, фкп, бедварс, столица, смешно, новости, м24, iphone 12, смотреть приколы, смех, прикол, москва, гонки, m24, новости столицы, последние новости, москвичи, московские новости, москва 24, протеин для похудения, протеин как принимать, как работает протеин, дневник похудения, 8/16 диета, протеин какой выбрать, сывороточный протеин это, польза и вред протеина, русский рок, субару, meme, #gachalife #meme #undertale, country_humans, re:zero, смерть луны, russia, countryhumans, asper x, протеиновый коктейль, зож, камера для слежения, каменра через wi fi, камера уличная ptz, уличная поворотная мобильная камера, сальто, ip wifi камера, камера слежения за объектом, ip camera, ptz, видеонаблюдение, поворотная камера, тренировка, про спорт, питание для пресса, мотивация спорт, фитнес, darkrussia, питание, питание для набора мышечной массы, спортивные тренировки, спорт мотивация, протеин, протеин для набора мышечной массы, шок для мышц, #undertale #errorsans #ausans #sans, саи баба новости, sri sai baba, фильм саи баба, слушать саи баба, саи баба, аренда, номер в отеле, аренда номеров, коронавирус, удаленка, отель, материализация саи баба, саи баба индия, баба видео, саи баба мантры, шри сатья саи баба, sathya sai baba (saint), сатья саи баба, ширди саи баба, свами, ашрам саи бабы, медитация саи баба, саи баба гаятри, очередь, продажа, в омут с головой, asper x — смерть луны, эмилия, #animation, русская рок-музыка, советский рок, рок-музыка в россии, история русского рока неформат, рок в ссср, видеонаблюдение своими руками, рок, country humans, глеб самойлов, #кровь, новости москвы, iphone, #country_humans #рейх3, #анимация, альтернативный рок, агата кристи, #crazypainters, countryhumans au, аниме, обзор фильма исход, едісон, бомж аид, стрим холдик, аид бед варс, холдик стрим, эдисон новое видео, стрим с вебкой, майнкрафт обновление 1. 17, стрим эдисон, skyblock rpg, lololoshka, стрим лололошка, stream minecraft, аид бомж, вайм, анархия, компот майнкрафт, майнкрафт компот, аид майкрафт, julius speak, майнкрафт лайв на русском, необычный торт, торт с юмором, фото тортов, torte (food), торт, телвидение, interspire, maborak, стенд-ап, необычные торты, unusual cakes, стрим майнкрафт на сервере, руся майнкрафт, juliusspeak, нуб в майнкрафт, джулиус спик, cakes, cake, торты, строения, творения, #путешествие, #автомобили, #топгирнарусском, #топгирпародия, #топгир, #авто, таллин, #эстония, #topgear, #ричардхаммонд, #суперкары, гир, land rover defender, ричард хаммонд, #топ, австралии, #топгирсуперкары, #топгиравстралия, по, #магазин aist, власть портит, контекст в фотографии, эстетика кадра, эстетика фотографии, школа фотографии, политач, механизмы, постройки, туториалы, композиция в фотографии, композиция, контекст, фотограф виктория иванова, лукашенко, как развиваться, черный квадрат, annie leibovitz, peter lindbergh, steven meisel, шелест, массовые рассылки, unity 3d, csharp, programming, кисаме, boobs, slender, unity3d, tutorial, mmorpg, kisame, гайд, among us как начать играть, амонг, как начать играть в амонг ас, among гайд для новичка, among us обучение, обучение, советы, обучение для начинающих, unity (software), #hoa, видеонаблюдение за домом, видеонаблюдение за квартирой,

Категория

Обзоры Фильмов

цены, отзывы, все виды протеинового спортивного питания MyProtein

Абрикосовый Персик 1

Ананас 3

Апельсин шоколад 5

Апельсиновый крем 3

Арахисовое масло 1

Банан 9

Банан Стевиа 2

Банофе 4

Без вкуса 12

Белый шоколад 6

Ваниль 15

Ваниль Стевия 2

ванильный делюкс 1

Вишневый йогурт 1

Гладкий шоколад 10

Домашний шоколад 5

Заварной крем из ревеня волнистого 1

Ирис пудинг 3

Карамель 1

Кленовый сироп 3

Клубника 14

Клубника банан 1

Клубника со сливками 6

Кокос 3

Корица 3

Кофе и орех 3

Кофе карамель 4

Куркума Латте 3

Латте макиато 4

Летние фрукты 3

Лимонное пирожное 3

Малина 4

Малина ваниль 3

Малиново черничный со стевией 3

Манго 1

Матча Латте 1

Мокко 4

Мороженое с шоколадом 3

Неаполитанский 1

Персиковый чай 2

Печенье со сливками 3

Пирог с орехами 2

Рулет с вареньем 3

Сахарный сироп 1

Солёная карамель 3

Тирамису десерт 3

Хоккайдо Молоко 1

Чай с молоком 2

Черника 5

Черника малина 1

Черничный чизкейк 3

Шоколад 12

Шоколад банан 5

Шоколад карамель 2

Шоколад кокос 3

Шоколад орех 5

Шоколад с мятой 4

Шоколад с мятой стевиа 1

Шоколад Стевия 3

Шоколадно — арахисовое масло 3

Шоколадный делюкс 1

Шоколадный зефир 2

Яблоко 1

Яблочная крошка и заварной крем 2

Японский чай Матча 2

Aрахисовая паста

Cолёный Шоколад

Абрикосовый йогурт

Ананас ваниль

Ананас Малина

Ананас манго

Апельсин

Апельсин маракуйя

Апельсин с творогом

Арахис шоколад

Арахисовое печенье

Арбуз

Банан кокос

Банан манго

Банан орехи

Банан персик

Банан со сливками

Банановая помадка

Банановое мороженое

Банановый крем

Баунти

Белый шоколад ананас

Белый шоколад дыня

Белый шоколад клюква

Белый шоколад кокос

Белый шоколад малина

Белый шоколад маракуйя

Белый шоколад с вишней

Бельгийский шоколад

Бельгийский шоколадный брауни

Бисквит

Бисквитная мечта

Бразильский манго

Бразильское кофе

Булочка с корицей

Ваниль с мёдом

Ваниль — Карамель

Ваниль апельсин

Ваниль банан

Ваниль бурбон

Ваниль кокос

Ваниль Корица

Ваниль Латте

Ваниль мёд

Ваниль пудинг

Ванильное мороженое

Ванильное печенье

Ванильные вафли

Ванильный кекс

Ванильный крем

Ванильный молочный коктейль

Ванильный рай

Ванильный торт

Ванильный чизкейк

Вишня

Вишня банан

Вишня в шоколаде

Вишня кокос

Голландский шоколад

Гранат

Грейпфрут

Грецкий орех

Груша с ванилью

груша с шоколадом

Двойное чёрное печенье

Двойной шоколад

Дольче де лече

Дыня

Жевательная резинка

Зеленое яблоко

Земляника

Изысканная ваниль

Имбирный пряник

Ирисовый сливочный крем

Йогурт лесные фрукты

Йогурт манго

Йогурт творог

Какао

Капучино

Карамель капучино

Карамель шоколад

Карамельное мороженое

Карибский кулер

Кафе латте шоколат

каштан

Киви Банан

Клубника белый шоколад

Клубника ваниль

Клубника Киви

Клубника тирамису

Клубнично-банановый крем

Клубничное мороженое

Клубничное пирожное

Клубничный коктейль

Клубничный милкшейк

Клубничный мусс

Клубничный чизкейк

Кокос белый шоколад

Кокос шоколад

Кокосовое молоко

Кокосовое печенье

корица сливовая

Кофе

Кофе и сливки

Кофе Латте с Орехом

Кофе с ванилью

Кофе с малиной

Кофе со льдом

Кофе фраппе

Красная конфета

Красная ягода

Красный бархат

Крекер Грэхема

Крем-брюле

Кремовая ваниль

Кремовое печенье

Лаймовый пирог

Латте

Лесная ягода

Лесные Фрукты

Лесные ягоды

Лимон творог

Лимонное безе

Лимонный йогурт

Малиновый белый шоколад

Малиновый дессерт

Малиновый йогурт

Малиновый чизкейк

Манго маракуйя

Маракуйя

Марципан

Ментоловое печенье

Миндаль — мороженое

Мока капучино

Мокачино

Мокко шоколад

Молочная ваниль

Молочно-шоколадное наслаждение

Молочный шоколад

Морозная Ваниль

Мята перечная мокко

Насыщенный ванильный

Насыщенный шоколадный

Нежный Бисквит

Немецкий шоколадный торт

Нуга

Персик

Персик Манго

Персиковый йогурт

Персиковый холодный чай

Песочное печенье

Песочное тесто

печенье

Печенье Белое Кремовое

Пина колада

Плюшка с корицей

Поджаренные хлопья с корицей

Пончик

Попкорн

Праздничный торт

Радужный Щербет

Рисовый пудинг

Розовый лимонад

Ром с изюмом

Роскошная ваниль

Сахарное печенье

Синий виноград

Синяя малина

Сливки

Сливочный торт

Сникерс

соленый карамельный миндаль

Топленый шоколад

Тройная ягода

Тропик

Тропическая ягода

Тропический

Тропический пунш

Тропический фрукт

Тыквенный пирог

Фисташка ваниль

Фисташки

Фисташки белый шоколад

Фисташки кокос

Фисташковый миндаль

Французская ваниль

Фруктовые хлопья

Фруктовый пунш

Фудж

Фундук

Хлопья с корицей

Чай Матча

черная смородина- Йогурт

Черника йогурт

Черничный маффин

Черный бисквит

Чёрный шоколад

чизкейк

Швейцарский шоколад

Шоколад — Вафли

Шоколад капучино

Шоколад клубника

Шоколад Корица

Шоколад малина

Шоколад нуга карамель

Шоколад Оранж

Шоколад печенье крем

Шоколад слива

Шоколад со сливками

Шоколад трюфель

Шоколад фундук

Шоколадная карамель Арахис

Шоколадная крошка с мятой

Шоколадная помадка

Шоколадное арахисовое масло

Шоколадное блаженство

Шоколадное мороженное

Шоколадное мороженое

Шоколадное печенье

Шоколадное печенье

Шоколадные макаруны

Шоколадный ирис

Шоколадный Кекс

Шоколадный коктейль

Шоколадный крекер

Шоколадный крем

Шоколадный милкшейк

Яблоко карамель

Яблочный пирог

Ягодный

Ягодный брауни

Ягодный йогурт

Ягоды с ванилью

яичный ликёр

Показать еще

Присвоение мотива взаимодействия с белками MinD димерным интерфейсом регулятора деления бактериальных клеток MinE

Abstract

MinE требуется для динамических колебаний белков Min, которые ограничивают образование цитокинетической перегородки до середины клетки в граммах. отрицательные бактерии. Критическим для этого колебания является связывание MinD с помощью MinE для стимуляции гидролиза MinD АТФ, функция, которая была приписана первым ∼30 остаткам в MinE. Предыдущие модели, основанные на структуре автономно свернутого димерного C-концевого фрагмента, предполагали, что N-концевой домен свободно доступен для взаимодействий с MinD.Мы сообщаем здесь структуру ЯМР раствора полноразмерного димера MinE из Neisseria gonorrhoeae , с двумя частями N-концевого домена, составляющими неотъемлемую часть интерфейса димеризации. Неожиданно доступность растворителя сильно ограничена для остатков, которые, как предполагалось ранее, напрямую взаимодействуют с MinD. Чтобы очертить истинную область связывания MinD, были выполнены анализы in vitro на MinE-стимулированную активность MinD. Относительная аффинность связывания MinD, полученная для полноразмерных и N-концевых пептидов из MinE, продемонстрировала, что остатки, которые скрыты в димерной границе раздела, тем не менее, участвуют в прямых взаимодействиях с MinD. Согласно результатам экспериментов по спиновой релаксации ЯМР доступ к этим скрытым остаткам может быть облегчен наличием конформационного обмена. Мы предполагаем, что это сокрытие MinD-связывающих остатков димерным интерфейсом MinE обеспечивает механизм предотвращения неспецифических взаимодействий, особенно с липидной мембраной, чтобы позволить свободную диффузию MinE, которая является критической для осцилляции белка Min.

Динамическая трехмерная субклеточная организация белков у бактерий становится важным механизмом регуляции многих критических процессов.Бактериальные белки MinD и MinE являются хорошо охарактеризованным примером системы этого типа, колеблющимся контролируемым образом от полюса к полюсу, чтобы локализовать MinC, так что деление клеток в непродуктивных полярных сайтах предотвращается (1-4). В основе этого колебания лежит динамическая полимерная надстройка, образованная MinD, которая выходит из полюса ячейки в виде спиральной катушки (5, 6). MinE предпочтительно располагается на передней кромке этой катушки, образуя концентрированное кольцевое пространство MinE (рис. 1 A ).Эта структура, известная как E-кольцо, приводит в действие упорядоченную разборку полимерной структуры от средней ячейки обратно к полюсу (7, 8). Сопутствующее образование нового полимера Min на противоположном полюсе клетки инициирует другой цикл роста и разборки.

Рис. 1.

( A ) Модель колебаний белка Min у палочковидных бактерий. MinD образует спиральный массив (красный), который простирается от полюса ячейки и ограничен областью, богатой MinE, известной как кольцо E (синее). Разборка массива по направлению к полюсу ячейки (в направлении синей стрелки) сопровождается сборкой новой катушки MinD на противоположном полюсе (красная стрелка).( B ) Принципиальная схема цикла Мин. (1) MinD (пурпурный), связанный с АДФ (голубой), подвергается нуклеотидному обмену с АТФ (желтый), вызывая состояние, связанное с мембраной, которое может связывать MinC (красный), ингибитор образования перегородки клеточного деления. (2) Связывание MinE (синий) с MinD замещает MinC и (3) стимулирует гидролиз АТФ с помощью MinD с высвобождением неорганического фосфата (зеленый). MinE высвобождается из комплекса, в то время как связанный с ADP MinD также диссоциирует от мембраны, позволяя циклу снова начаться.( C ) Функциональная доменная структура MinE. Остатки 1-30 составляют домен анти-MinCD (ACD), тогда как оставшиеся C-концевые остатки содержат TSD.

Энергия для осцилляции белка Min обеспечивается катализируемым MinD гидролизом АТФ (9) в реакционном цикле, который стимулируется MinE (рис. 1 B ). Область MinE, которая, как считается, ответственна за эту стимуляцию активности MinD-АТФазы, известна как домен анти-MinCD и включает первые ∼30 остатков его аминокислотной последовательности (10).Усеченный образец MinE, содержащий оставшиеся C-концевые остатки [31–88 в белке Escherichia coli (Ec)], также известный как домен топологической специфичности (TSD), как было показано, принимает автономную складку как димерный αβ. -сэндвич (11, 12). Ec-TSD может мешать топологически специфической активности полноразмерного белка, потому что его избыточная экспрессия на фоне WT дает продукты полярного деления клеток, известные как миниклетки (13-15).

Современные модели активности MinE основаны на структуре Ec-TSD и наблюдении, что пептид, состоящий из первых 22 остатков MinE, в значительной степени неструктурирован (12, 16).Согласно этой модели, домен анти-MinCD разворачивается и подвергается воздействию растворителя, что позволяет свободно взаимодействовать с мембраносвязанным MinD. Однако мы показали, что в полноразмерном белке MinE из Neisseria gonorrhoeae (Ng) домен анти-MinCD стабильно свернут, причем взаимодействия включают домен топологической специфичности (17).

Поскольку наличие структуры в этой части белка может значительно изменить существующие модели взаимодействий MinD-MinE, мы решили определить структуру полноразмерного белка MinE с помощью ЯМР в растворе.Эта структура показывает, что неотъемлемая часть димерного интерфейса в полноразмерном MinE образована двумя областями домена анти-MinCD. Мы показываем с помощью анализов, основанных на стимуляции активности MinD in vitro, что остатки, расположенные в недоступных для растворителя сайтах в димерной границе этой структуры, тем не менее, играют прямую роль в связывании с MinD. Эта секвестрация белка-связывающего мотива вдали от водной среды помогает объяснить, как MinE может минимизировать неспецифические взаимодействия, событие, которое может существенно повлиять на колебания Min белка.

Результаты

Структура Ng-MinE.

Используя стандартные методы ЯМР в гетероядерном растворе, ансамбль структур был определен для полноразмерного образца Ng-MinE. Это было сделано с использованием мутанта E46A, потому что он проявлял более благоприятные характеристики растворимости, чем белок дикого типа, и он сохранял структурные характеристики, которые были очень похожи на характеристики WT, что было определено с помощью кругового дихроизма и вторичных химических сдвигов ЯМР основной цепи (17, 18 ). Как показано на рис.2, E46A Ng-MinE образует гомодимер, каждая субъединица которого состоит из трехцепочечного β-листа, упакованного против α-спирали (αB, остатки с 39 по 54) в приблизительно параллельной ориентации. С другой стороны β-листа расположена более короткая N-концевая α-спираль от другой субъединицы в димере (αA, остатки с 3 по 8), которая примерно перпендикулярна листу.

Рис. 2.

( A ) Ленточная диаграмма структуры Ng-MinE, определенной методом ЯМР в растворе, с двумя видами, связанными поворотом на 180 °.Каждая субъединица показана либо синим, либо фиолетовым цветом, а остатки 1–30 анти-MinCD, которые охватывают αA и β1, имеют более темные оттенки этих цветов. Боковые цепи для остатков, соответствующих тем, которые ранее были идентифицированы как важные для функции топологической специфичности (Glu ⁴⁶ , который мутирован в Ala в этой структуре, и Val ⁵⁰ ), показаны в виде шариков. ( B ) Подробный вид димерного интерфейса αB, выделяющий остатки, участвующие в межспиральных взаимодействиях. ( C ) Изображение электростатической поверхности остатков 20–84 в той же ориентации, что и на правой стороне A .N-концевые α-спирали (ленты) упаковываются против небольших гидрофобных участков, которые фланкируются отрицательно заряженными остатками (красный цвет), которые могут притягивать положительно заряженный N-конец. ( D ) Схематическая диаграмма, подчеркивающая интегральную роль остатков анти-MinCD 19–31 в димерном β-листе Ng-MinE. Ориентация и цветовая схема такие же, как на правой стороне A . Аминокислоты, образующие водородные связи между нитями основной цепи, соединены сплошной линией, при этом оранжевые линии указывают на водородные связи, которые также наблюдались для гомологичных остатков в структуре Ec-TSD (12).Остатки, гомологичные тем, которые участвуют в межсубъединичных водородных связях в структуре Ec-TSD, показаны оранжевым (Asp ⁷³ водородная связь с Leu ⁸¹ , Leu ⁷⁵ с Ile ⁷⁹ и Leu ⁷⁷ с Leu ⁷⁷ ). ( E ) Структура остатков Ec-MinE 32-83 (код PDB ID 1EV0) с элементами вторичной структуры, гомологичными элементам в структуре Ng-MinE, обозначенным метками. Попарное среднеквадратичное значение Cα для одной субъединицы Ec-TSD и Ng-MinE равно 2.9 Å (только обычные элементы вторичной структуры). ( F ) Амидные протоны, которые можно было наблюдать в ¹ H- ¹⁵ N HSQC-спектры WT Ng-MinE, записанные при pH 9,5 (17), выделены синим цветом, что указывает на остатки, которые защищены от катализируемого основанием растворителя. обмен за счет водородной связи. Область, соответствующая той части структуры Hp, которая участвует в межмолекулярных взаимодействиях водородных связей основной цепи, показана зеленым для сравнения.

Обширный гомодимерный интерфейс, поддерживаемый межмолекулярными NOE, образован водородными связями межсубъединичной основной цепи между цепями β1 и взаимодействиями с участием гидрофобных боковых цепей этих цепей (Leu ²² , Ile ²⁴ и Ile ²⁶ ), тогда как боковые цепи от двух спиралей αB (Tyr ³⁹ , Thr ⁴² , Leu ⁴³ , Ala ⁴⁶ , Val ⁵⁰ , Tyr ⁵⁴ и Val ⁵⁵ ) также вносят вклад в димерный интерфейс (рис. .2 В ). Эта часть интерфейса скрывает в общей сложности 1,200 Å ² площади поверхности на субъединицу. Кроме того, межмолекулярные NOE, включающие N-концевую спираль αA, также были приписаны, показывая взаимодействия с β-листом (Fig. S1). Полученная структура показывает, что ∼300 Å ² на субъединицу β-слоя скрыто этой частью межмолекулярного взаимодействия, при этом Ile ⁴ , Leu ⁷ и Phe ⁸ из αA создают специфические межсубъединичные контакты с консервативным гидрофобным участком, образованным остатками Ile ²⁵ , Ala ²⁷ , Met ⁷² и Val ⁷⁴ (рис.2 С ). Эта димерная структура могла быть независимо подтверждена усилением парамагнитной спиновой релаксации амидных резонансов, которое показало уширение пиков, которое согласуется с межсубъединичными взаимодействиями с участием β1 и αA (рис. S2).

Интегральная роль N-концевых остатков домена анти-MinCD на димерном интерфейсе была неожиданной, потому что C-концевой фрагмент, содержащий остатки 31-88 Ec-MinE (Ec-TSD), образует димер, который не включает ни один из эти остатки (12). Хотя структура Ec-TSD содержит спираль αB и нити β2 и β3, с такими же межцепочечными водородными связями и взаимодействиями боковых цепей, обнаруженными в полноразмерной структуре Ng-MinE, димерный интерфейс образован межсубъединичными водородными связями между двумя антипараллельными β3 пряди (рис.2 D и E ). Тем не менее, наблюдается замечательная консервация пар аминокислот, связывающих водородные связи между двумя структурами [то есть, для последовательности Ng-MinE Leu ⁷⁵ связывается с Ile ⁷⁹ (полноразмерная структура) или Ile ²⁶ (структура TSD). ), Leu ⁷⁷ — Leu ⁷⁷ / Ile ²⁴ , Ile ⁷⁹ — Leu ⁷⁵ / Leu ²² и Leu ⁸¹ — Asp ⁷³ / Asp ²⁰ ].Между тем, спираль αB также участвует в обширных межсубъединичных взаимодействиях, которые аналогичны взаимодействиям в нашей полноразмерной структуре Ng-MinE, при этом остатки Ala ⁴⁶ и Val ⁵⁰ образуют участок на димерной границе, аналогичный тому, который ранее был идентифицирован как важно для функции топологической специфичности (Asp ⁴⁵ / Val ⁴⁹ в Ec-MinE) (12). В целом эти структурные сходства показывают, как стабильный димер может формироваться с помощью TSD в отсутствие домена анти-MinCD, и поднимают интересные вопросы относительно функциональной значимости структуры TSD.

Во время подготовки этой рукописи были опубликованы координаты рентгеновской кристаллической структуры MinE с разрешением 2,8 Å из Helicobacter pylori (Hp) (19), показывающие такую ​​же складку для основной части Ng-MinE. структура со среднеквадратичным отклонением Cα 1,7 Å для регулярных вторичных структурных элементов (рис. S3 и S4). Подобно структуре Ng-MinE, часть домена анти-MinCD в структуре Hp-MinE образует β-цепь на димерном интерфейсе. Однако первые 12-15 остатков Hp-MinE не были видны, что препятствовало наблюдению межмолекулярного взаимодействия с участием N-концевой α-спирали.Кроме того, граница раздела β1, по-видимому, менее обширна в кристаллической структуре по сравнению с таковой в структуре ЯМР раствора. В частности, сеть межмолекулярных водородных связей, идентифицированная в кристаллической структуре для β1, короче, чем предполагаемая для Ng-MinE из данных NOE и обмена растворителем (фиг. 2 F и фиг. S5). Эти структурные различия могут быть следствием более коротких петель, которые характерны для белков экстремофилов, таких как H. pylori , хотя потенциальное влияние взаимодействий упаковки кристаллов на структуру MinE не может быть исключено как способствующий фактор.

Идентификация остатков, важных для стимуляции активности MinD.

Одним из неожиданных аспектов полноразмерной структуры Ng-MinE была локализация остатков, ранее идентифицированных как важные для функции анти-MinCD (остатки от 20 до 30) на димерном интерфейсе (рис. 2 A ). Несмотря на то, что они совсем не доступны для растворителя, мутации, сделанные в Leu ²² и Ile ²⁵ , как было показано, отменяют способность MinE взаимодействовать с MinD и разрушать комплекс MinCD (10).Как было предположено на основании структуры Hp-MinE (19), разумным объяснением этого является то, что эти остатки не взаимодействуют напрямую с MinD, а вместо этого являются критическими для поддержания димерного свернутого состояния. Наши исследования ЯМР и КД L22D Ng-MinE (17), показывающие значительную потерю структуры, согласуются с этой гипотезой. Следовательно, если эти остатки не участвуют напрямую во взаимодействиях MinD, то активность анти-MinCD должна находиться в более доступных для растворителя областях домена анти-MinCD.

Чтобы идентифицировать истинные MinD-связывающие остатки в Ng-MinE, мы проверили способность серии мутантов стимулировать активность Ng-MinD АТФазы в присутствии фосфолипидных везикул. Как показано на фиг. 3 A , для большинства мутантов в N-концевой области Ng-MinE не было обнаружено различий в стимуляции скоростей гидролиза MinD-АТФ от уровней WT. Кроме того, мутант, используемый для определения структуры (E46A), также стимулировал активность MinD до уровней, которые были неотличимы от активности Ng-MinE дикого типа.Однако два мутанта, ранее идентифицированные как дефицитные по активности против MinCD, а именно A18D и структурно нарушенный L22D (20), показали полную потерю стимуляции MinD-АТФазы. R21A и K19A также показали более низкую активность, что позволяет предположить, что взаимодействие MinD в основном включает гибкую петлю и часть центральной β-цепи.

Рис. 3.

Специфическая активность Ng-MinD, стимулированная Ng-MinE, определена in vitro. ( A ) Сравнение активности, стимулированной либо WT Ng-MinE, либо указанным мутантом.Для большинства мутантов наблюдалось ~ 10-кратное увеличение активности MinD-АТФазы по сравнению с базовыми уровнями, измеренными в отсутствие MinE, аналогично предыдущим наблюдениям (9, 20). ( B ) Концентрационная зависимость удельной активности Ng-MinD in vitro для полноразмерного Ng-MinE (белые квадраты), Ng-MinE _1-22 (серые треугольники) и MinE _1-27 (закрашенные кружки) ). ( C ) То же, что и B для мутантных пептидов Ng-MinE _1-27 I25R (темные кружки) или I24R (белые кружки).Линии представляют собой кривые, наиболее подходящие для уравнения Хилла.

Чтобы определить, участвует ли какая-либо часть MinE за пределами этой области также во взаимодействиях MinD, пептид, состоящий из остатков 1-22 Ng-MinE (Ng-MinE _1-22 ), был протестирован на стимуляцию активности Ng-MinD АТФазы. в диапазоне концентраций пептида. Предполагая, что скорость гидролиза АТФ прямо пропорциональна количеству связанного MinE, тогда изменение активности в зависимости от концентрации MinE может соответствовать уравнению Хилла.В этом анализе концентрация Ng-MinE, необходимая для достижения полумаксимальной стимуляции ( K _0,5 ), может считаться мерой относительного сродства взаимодействия между Ng-MinE и Ng-MinD (21). Как показано на фиг. 3 B , как полноразмерные, так и N-концевые образцы Ng-MinE _1-22 были способны стимулировать активность Ng-MinD АТФазы до одного и того же максимального уровня; однако значения K _0,5 значительно различались между двумя образцами.Как суммировано в таблице 1, K _0,5 для полноразмерного Ng-MinE составляло 0,11 мкМ, тогда как для достижения того же уровня активации требовалось примерно в пять раз больше пептида Ng-MinE _1-22 . Кроме того, мутант R21A этого пептида, а также его усеченная версия (Ng-MinE _1-17 ) не проявляли никакой стимуляции активности АТФазы даже при концентрациях 20 мкМ (фиг. S6). Взятые вместе, эти результаты показывают, что остатки, необходимые для максимальной стимуляции активности MinD, присутствуют в остатках 18–22, но что остатки за пределами этой N-концевой области также вносят вклад во взаимодействия с MinD.

Таблица 1.

Кинетические параметры для Ng-MinE-стимулированного гидролиза АТФ под действием Ng-MinD, как определено путем аппроксимации уравнению Хилла *

Исследование роли β1-остатков в стимуляции активности MinD-АТФазы.

Возможность использовать пептиды для тестирования стимуляции активности MinD-АТФазы позволила нам рассмотреть специфическую роль Leu ²² , а также дополнительных областей анти-MinCD домена во взаимодействии MinD. Хотя мутант L22D полноразмерного белка не был активен, это могло быть связано со значительным структурным возмущением, которое возникает в результате введения отрицательного заряда в гидрофобное ядро ​​(17).Однако, если Leu ²² играет непосредственную роль во взаимодействиях MinD, то можно ожидать, что версия L22D Ng-MinE _1-22 будет демонстрировать пониженную активность по сравнению с пептидом WT, поскольку активность пептида не проявляется. требуется шаровидное ядро. Фактически это то, что наблюдалось, потому что L22D Ng-MinE _1-22 не смог стимулировать активность MinD-АТФазы в широком диапазоне концентраций. Чтобы оценить, был ли этот эффект специфичным для мутанта аспарагиновой кислоты, мы также выполнили этот анализ с более консервативным мутантом L22A Ng-MinE _1-22 .В этом случае, хотя максимальная активность MinD могла быть достигнута при очень высоких концентрациях пептида, K _0,5 было почти в 10 раз больше, чем у пептида WT (таблица 1), что дает убедительные доказательства того, что Leu ²² непосредственно участвует во взаимодействии с МинД.

Идентификация прямой роли взаимодействий MinD с участием Leu ²² , остатка, который находится в недоступном для растворителя положении межсубъединичного интерфейса димера Ng-MinE, повысило вероятность того, что другие остатки в этой области структуры может также играть аналогичную роль.По этой причине более длинный N-концевой пептид, MinE _1-27 , тестировали в том же анализе стимуляции АТФазы. Как показано на фиг.3 C , этот пептид был более активен, чем Ng-MinE _1-22 , с профилем, который был почти таким же, как у полноразмерного белка, включая K _0,5 0,08 мкМ (таблица 1). Чтобы определить, является ли это очевидное увеличение аффинности, обеспечиваемое остатками 23–27, специфическим, мы повторили эксперимент с использованием мутанта, который ранее был идентифицирован как дефектный по активности против MinCD, а именно I25R (10).Хотя мутант I25R этого пептида был способен полностью стимулировать активность MinD, для достижения полумаксимальных уровней требовалось примерно в 30 раз больше пептида по сравнению с пептидом WT (фиг. 3 C и таблица 1). Напротив, когда I24R Ng-MinE _1-27 тестировали в том же анализе, профили скорости были очень похожи на профили для пептида WT. Меньший эффект наблюдался для более консервативного мутанта I25A Ng-MinE _1-27 , хотя его кажущееся сродство все еще было слабее, чем у пептида WT. В целом эти данные предоставляют убедительные доказательства того, что Ile ²⁵ является одним из остатков, непосредственно участвующих во взаимодействии между полноразмерным MinE и MinD.

Доказательства конформационной динамики в МинЭ.

Когда остатки, идентифицированные как важные для стимуляции активности Ng-MinD, картируются в структуре Ng-MinE, становится очевидным, что многие из них находятся в областях, к которым нелегко получить доступ макромолекулярному партнеру по связыванию (рис. 4 A ). ). Например, хотя боковые цепи Arg ²¹ и Ile ²⁵ находятся на одной стороне от β1, доступ к этим остаткам будет затруднен присутствием N-концевой спирали и соседней петли.Однако, если MinE подвергается динамическому обмену с более открытой конформацией, это может обеспечить механизм для MinD доступа к этим остаткам. Для изучения внутренней динамики MinE было проведено ¹⁵ экспериментов по спиновой релаксации N. Они продемонстрировали, что петля, соединяющая αA и β1, действительно претерпевает значительную динамику основной цепи в масштабе времени от наносекунды до пикосекунды (рис. S7).

Рис. 4.

( A ) Остатки, важные для стимуляции гидролиза, катализируемого MinD, либо частично доступны для растворителя (желтые боковые цепи), либо полностью недоступны (красный цвет) в димерной структуре полноразмерного Ng-MinE.( B ) Типичные кривые дисперсии релаксации для амидных групп основной цепи при 800 МГц (красный) и 500 МГц (черный) показаны для трех указанных остатков. ( C ) Амиды основной цепи, претерпевающие статистически значимый обмен (достоверность> 99% по F-тесту), показаны в виде шариков, диаметр которых линейно масштабируется в соответствии с измеренной скоростью обмена (300 с ^-1 –3100 с ^-1 ). Большинство сайтов обмена группируются в непрерывную область на каждом конце димера (желтый).Структурно отличный сайт обмена был также обнаружен для αC (белый). Обмен амидов в спиралях αB не обнаружен.

Серия измерений дисперсии релаксации амида основной цепи, разработанная для исследования наличия движения в масштабе времени от микросекунд до миллисекунд, также выявила движения, распространяющиеся на другие области белка. Вклад в поперечную релаксацию от обменных процессов проявляется в виде увеличенного уширения линий, которое может быть компенсировано последовательностью импульсов спинового эха Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG) (см.22). Вариации кажущейся скорости поперечной релаксации ( R _{2, eff} ) в зависимости от частоты импульсов CPMG ( v _CPMG ) указывают на конформационный обмен. Наши результаты (рис. 4 B и C ) показывают обмен в масштабе времени от микросекунды до миллисекунды в остатках из N-концевой спирали, которые взаимодействуют с β-листом, и в соответствующих остатках внутри этого слоя, проксимальных к этому взаимодействию. . Локализация этих остатков предполагает движение, которое может включать диссоциацию N-концевой α-спирали от центрального β-листа, изменение, которое значительно улучшит доступ к Ile ²⁵ и Arg ²¹ для взаимодействий с MinD.Эта модель также согласуется с небольшой площадью поверхности, связанной с этим взаимодействием, которое предсказывает относительно слабую ассоциацию для спирали αA, и с отсутствием электронной плотности для этой части кристаллической структуры Hp-MinE (19).

В дополнение к спирали αA и соседним петлям ряд остатков в β1 (Asp ²⁰ , Leu ²² и Ile ²⁴ ) также продемонстрировали свидетельства динамики в этой временной шкале. Этот обмен может отражать изменение локальной химической среды, которое произойдет при диссоциации N-концевой спирали.Однако также возможно, что структурные изменения в этих областях сопровождают эту диссоциацию. Наиболее важно то, что конформационная гибкость на концах β1 может обеспечивать механизм для MinD доступа к таким остаткам, как Leu ²² , чья боковая цепь полностью скрыта в гидрофобном ядре димерного интерфейса. Некоторое понимание природы этого конформационного изменения дает структура Hp-MinE (19), которая показывает концы β1, расходящиеся от границы раздела (рис.S3). Хотя боковая цепь, соответствующая Leu ²² , все еще полностью скрыта в структуре Hp-MinE, это более открытое состояние может представлять собой промежуточное звено на пути к более крупным структурным возмущениям, которые могут быть вызваны связыванием MinD.

Обсуждение

Давняя модель взаимодействия MinE-MinD, включающая экспонированный растворителем, формирующий спираль домен анти-MinCD (10), подверглась сомнению путем обнаружения β-структуры в домене анти-MinCD (17 ), частичная структура Hp-MinE (19), а теперь по нашему решению ЯМР-структура полноразмерного Ng-MinE.В частности, структуры показывают, что остатки, ранее идентифицированные как важные для функции анти-MinCD, скрыты в димерном интерфейсе β1. Учитывая центральную роль этой области в димеризации, вполне вероятно, что мутация не доступных для растворителя остатков в этой области, которые, как было показано ранее, отменяют функцию анти-MinCD (например, L22D, I25R), будет значительно нарушать эту димерную структуру. Однако активность АТФазы MinD in vitro, полученная с пептидами домена анти-MinCD, позволяет предположить, что потеря аффинности связывания для MinD, проявляемая этими мутантами, не является следствием этого структурного изменения, а вместо этого в первую очередь связано с устранением больших гидрофобных боковых цепей. которые непосредственно участвуют во взаимодействии.Следовательно, для того, чтобы MinD мог связать эти остатки в полноразмерном белке, должен произойти некоторый тип конформационного изменения, чтобы увеличить их доступность. Конформационный обмен, который мы обнаружили в домене анти-MinCD, действительно обеспечивает механизм для увеличения доступа к некоторым из этих связывающих остатков MinD. Однако до сих пор неясно, как MinD может одновременно связывать все эти остатки в структуре димера.

Один из сценариев, который может улучшить доступность растворителя для MinD-связывающих остатков, который еще предстоит изучить, — это тот, где димер MinE диссоциирует на мономер до его ассоциации с MinD.Диссоциация димера приведет к значительному увеличению доступности растворителя для домена анти-MinCD, что может сделать мономер лигандом с более высокой аффинностью для MinD. Фактически, демонстрация того, что фрагмент MinE _1-27 воссоздает in vitro активацию MinD со свойствами, которые практически неотличимы от свойств полноразмерного белка, согласуется с этой возможностью (фиг. 3 B ). Предыдущие данные о двухгибридных дрожжах и гель-фильтрации с Ec-MinE _1-31 показали, что этот фрагмент не самоассоцируется (13), что позволяет предположить, что димеризация не является необходимой для стимуляции активности MinD.

Константа диссоциации 0,6 мкМ была ранее определена для димеризации Ec-MinE (14), предполагая, что значительная популяция MinE должна быть мономерной при низких концентрациях мкМ. Однако это может быть не так для Ng-MinE, потому что эксперименты по скорости седиментации не показали никаких отдельных видов мономера или какого-либо значительного сдвига в молекулярной массе димера (рис. S8). Это имело место, даже когда использовались концентрации образца на пределе обнаружения (3 мкМ), условия, которые должны содержать ~ 25% мономера, если константа диссоциации находилась в этом диапазоне.Факторы защиты амида основной цепи, полученные в экспериментах по замене растворителя, также согласуются с сильно ассоциированным димером Ng-MinE (рис. S5), с самой высокой защитой, наблюдаемой для центральных остатков β1. Тем не менее, высокая константа димеризации сродства не исключает потенциального присутствия низких концентраций мономера, которые могут быть достаточными для максимальной стимуляции гидролиза АТФ с помощью MinD. Сложность усложняется тем фактом, что фактические свойства ассоциации MinE in vivo и в условиях анализа in vitro, вероятно, будут многогранными.В частности, структуры более высокого порядка, сформированные MinD, вызывают повышенные локальные концентрации MinE, которые, как ожидается, будут способствовать его самоассоциации. Этот эффект также должен действовать in vitro, потому что динамические мезоструктуры были продемонстрированы для MinD на поверхности плоских липидных бислоев с неоднородной колокализацией MinE (23, 24). В нашем анализе мы получили коэффициенты Хилла больше двух (таблица 1), предполагая, что полимерная структура, функционально связывающая несколько сайтов связывания MinE, также была восстановлена ​​в этих условиях.Однако в отсутствие структурных деталей полимера MinD невозможно предсказать, будет ли димер или мономер MinE взаимодействовать более благоприятно. По этим соображениям, в дополнение к другим общим эффектам, которые могут изменять ассоциативные свойства MinE (например, исключение объема / молекулярное скопление, взаимодействия липидных белков и т. Д.), Состояние олигомеризации MinE, которое наиболее важно для связывания MinD, и E Образование колец остается интересным вопросом, требующим исследования.

Хотя роль димерного состояния MinE во взаимодействии с MinD все еще не ясна, существует одно существенное преимущество, которое должно быть обеспечено за счет сокрытия MinD-связывающих остатков. В частности, беспорядочные взаимодействия между MinE и другими предполагаемыми партнерами по связыванию должны быть значительно уменьшены за счет секвестрации домена анти-MinCD от растворителя. Особое значение имеют неспецифические взаимодействия, которые можно ожидать между гидрофобными частями домена анти-MinCD и мембраной.Было показано, что, в отличие от полноразмерного MinE, изолированный домен анти-MinCD (Ec-MinE _1-31 ) локализуется на мембране in vivo даже в отсутствие MinD (10). Сходным образом, мутации, внесенные в полноразмерный Ec-MinE, которые должны нарушать структуру на интерфейсе β1, а именно L22R, L22S и I25R, также приводят к тому же самому паттерну MinD-независимой мембранной локализации. Эти результаты показывают, что свободное воздействие растворителя на полный домен анти-MinCD приводит к локализованному на мембране MinE, и что нет топологической специфичности для этой локализации.Это может иметь важные функциональные последствия, потому что сильные взаимодействия с мембраной могут ингибировать динамическую локализацию Min белков, предотвращая свободную диффузию несвязанного MinE через цитоплазму, что, как предполагают вычислительные модели, является фундаментальным требованием для осцилляции (рассмотрено в ссылке 25). Вдобавок предполагается, что суперсемейство белков MinD / Par имеет консервативный механизм стимуляции активности АТФазы (26), что повышает вероятность того, что свободно экспонируемый домен анти-MinCD может взаимодействовать с другими членами этого семейства.Независимо от потенциального партнера по связыванию, локализация ключевых MinD-связывающих остатков на димерном интерфейсе MinE сводит к минимуму возможность неспецифических взаимодействий. Секвестрация этих остатков вдали от растворителя, таким образом, обеспечивает механизм, позволяющий беспрепятственную диффузию MinE через цитоплазму в областях, где концентрации связанного с мембраной MinD низкие, что позволяет происходить нормальным колебаниям белка Min.

Материалы и методы

Экспрессия, очистка и мутагенез белков.

Плазмиды, используемые для экспрессии WT, E46A, L22D и A18D Ng-MinE и WT Ng-MinD, были такими, как описано ранее (17, 20). Все другие мутанты полноразмерного Ng-MinE были получены путем сайт-направленного мутагенеза плазмиды WT с использованием протокола сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Все конструкции белков Min экспрессировали белки Ng-Min, присоединенные на С-конце к последовательности из восьми дополнительных остатков (LEHHHHHH). Экспрессию и очистку проводили, как описано ранее (17, 20).Эксперименты по скорости седиментации подтвердили димерное состояние этих образцов (рис. S8).

Анализ АТФазы In Vitro MinD.

Стимуляция гидролиза Ng-MinD АТФ с помощью Ng-MinE контролировалась с использованием метода малахитового зеленого (27), и MinE-зависимая активация соответствовала уравнению Хилла для извлечения V _max , K _0,5 , и h . Подробности анализа и анализа приведены в SI Text .

ЯМР-спектроскопия.Спектры ЯМР

регистрировали при 298 К на спектрометре Varian Unity Inova с полосой пропускания 500 или 800 МГц, оборудованном криозондом. Отнесения резонансов ¹ H, ¹⁵ N и ¹³ C были получены для E46A Ng-MinE, как описано в другом месте (18). Образцы ЯМР обычно представляли собой 0,7–1,0 мМ однородно меченного ¹⁵ N- или ¹³ C, ¹⁵ N-меченного E46A Ng-MinE в буфере, содержащем 22,5 мМ трис-HCl при pH 7,2, 45 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,2 мМ бензамидин, 0.02% NaN ₃ и 1 мМ 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоновая кислота. Образец гетеродимерного белка также получали смешиванием эквимолярных количеств ¹⁵ N- и ¹³ C, ¹⁵ N-меченного E46A Ng-MinE в 6 M гидрохлориде гуанидиния. Этот образец повторно укладывали на колонке Ni-NTA путем поэтапной замены буфера на буфер, свободный от денатурирующего агента, и повторно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии.

Измерение одинарной связи ¹ H- ¹⁵ N остаточных диполярных связей (RDC) амидов основной цепи было выполнено с использованием растянутого 3% (мас. / Об.) Полиакриламидного геля (28) с ¹⁵ N в синфазе. / Спектры одноквантовой когерентности в противофазе (IPAP-HSQC) (29).Спектры обрабатывали и анализировали с использованием NMRPipe (30), NMRView (31) и SPARKY (Т. Д. Годдард и Д. Г. Кнеллер, SPARKY 3, Калифорнийский университет, Сан-Франциско).

Расчет конструкции.

Ограничения расстояния NOE были выведены из 3D ¹⁵ N-отредактированный NOESY-HSQC () (32–34), алифатический ¹³ C-отредактированный NOESY-HSQC () (35) и 3D ¹³ C-отредактированный метил-метил NOESY ( τ _смесь = 75 мс) (36) спектры и использовались в программе молекулярного моделирования XPLOR-NIH (37) для создания начальной модели E46A Ng-MinE.Затем эта модель была использована в качестве стартовой структуры для программы динамики торсионных углов CYANA 2.1 (38) и автоматического назначения NOE для расчета 200 конформеров. На основании данных водородного обмена и наличия характерных вторичных структурных NOE (17), 26 водородных связей на субъединицу также были добавлены к набору ограничения. Всего 1849 уникальных и неизбыточных ограничений расстояния NOE / субъединицы были сгенерированы из спектров NOESY. Кроме того, 68 межмолекулярных ограничений верхней границы на субъединицу, полученные из 3D F1- ¹³ C, ¹⁵ N-фильтрация / F3- ¹³ C отредактированный спектр NOESY ( τ _mix = 80 мс) (39 ) были добавлены в качестве ограничений ввода.

XPLOR-NIH был впоследствии использован для уточнения конструкции с наименьшим значением целевой функции из CYANA 2.1 по результатам измерений ¹ H- ¹⁵ N RDC. Двугранные углы Phi / Psi, полученные из программы TALOS (40), также были включены в набор ограничений. 10 структур с наименьшей энергией из расчета 200 структур были использованы для представления ансамбля ЯМР (статистика в таблице S1).

¹⁵ N Эксперименты по релаксационной дисперсии.

Для оценки химического обмена была использована улучшенная версия (41) импульсной последовательности ¹⁵ N CPMG (42, 43) при 303 К и двух магнитных полях (500 и 800 МГц) с использованием задержки релаксации CPMG. время 30 мс. Эффективные скорости релаксации определялись по пиковой интенсивности, как описано ранее (44). Неопределенность эффективных скоростей релаксации оценивалась по дубликатам. Предполагая модель обмена с двумя состояниями, скорости релаксации были подогнаны для каждого остатка с использованием CATIA (доступно по адресу http: // pound.med.utoronto.ca/software.html). Не было получено скорости релаксации для остатков пролина (37, 41 и 82) или перекрывающихся и слабых резонансов (Met ¹ , Ser ² , Leu ³ , Lys ¹³ , Thr ¹⁴ , Ala ¹⁵ , Thr ¹⁶ , Gln ²³ , Ile ²⁶ , Tyr ³⁹ , Leu ⁴⁰ , Tyr ⁵⁴ , Gln ⁶⁶ , Lys ⁶⁸ , Asp ⁷⁰ , Asp ⁷³ , Лей ⁷⁷ и Иль ⁷⁹ ).

Выражение признательности

За квалифицированную техническую помощь мы благодарим Тару Спрулс из лаборатории высокопольного ЯМР в Квебеке / Восточном Онтарио в Монреале, Квебек, и Кима Манро из лаборатории Protein Function Discovery. Мы благодарны Энтони Миттермайеру за полезные обсуждения и Льюису Кею за критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана канадским институтом исследований в области здравоохранения, действующим грантом MOP-160206 (для N.K.G. и J.R.D.), и премией Early Researcher Award (для N.КГ.). H.G. был поддержан Фондом Швеция-Америка и Фондом Кнута и Алисы Валленберг, а также C.T.H. получил стипендию для выпускников Онтарио. N.C. и A.A.B. оба являются получателями стипендий Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям для бакалавриата.

Сноски

• ¹ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: ngoto {at} uottawa.ca.

• Вклад авторов: H.G., T.D., C.T.H., N.C., A.A.-B., J.-A.Р.Д., Н.К.Г. спланированное исследование; H.G., T.D., C.T.H., F.H., N.C., A.A.-B. и S.H.A. проведенное исследование; H.G., T.D., C.T.H., F.H., N.C., P.L. и N.K.G. проанализированные данные; и Х.Г. и Н.К.Г. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Размещение данных: атомные координаты и файлы ограничения ЯМР были депонированы в Protein Data Bank, www.pdb.org (код PDB ID 2KXO).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1007141107/-/DCSupplemental.

Минимальные белковые паттерны возникают в результате быстрого повторного связывания и мембранного взаимодействия MinE

1

Lutkenhaus, J. Динамика сборки бактериальной системы MinCDE и пространственная регуляция Z-кольца. Annu. Rev. Biochem. 76 , 539–562 (2007).

CAS Статья Google ученый

2

Ху, З., Мукерджи, А., Pichoff, S. & Lutkenhaus, J. Компонент MinC системы выбора сайта деления в Escherichia coli взаимодействует с FtsZ для предотвращения полимеризации. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96 , 14819–14824 (1999).

CAS Статья Google ученый

3

Hu, Z. & Lutkenhaus, J. Топологическая регуляция клеточного деления у Escherichia coli включает быстрые колебания от полюса к полюсу ингибитора деления MinC под контролем MinD и MinE. Мол. Microbiol. 34 , 82–90 (1999).

CAS Статья Google ученый

4

Раскин Д.М. и де Бур, П.А. Быстрые межполюсные колебания белка, необходимые для направления деления к середине Escherichia coli . Proc. Natl. Акад. Sci. США 96 , 4971–4976 (1999).

CAS Статья Google ученый

5

Раскин Д.М. и де Бур, П.А. MinDE-зависимые межполюсные колебания ингибитора деления MinC в Escherichia coli . J. Bacteriol. 181 , 6419–6424 (1999).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

6

Hale, C.A., Meinhardt, H. & de Boer, P.A. Цикл динамической локализации регулятора деления клеток MinE в Escherichia coli . EMBO J. 20 , 1563–1572 (2001).

CAS Статья Google ученый

7

Hu, Z. & Lutkenhaus, J. Топологическая регуляция деления клеток в E. coli . пространственно-временные колебания MinD требуют стимуляции его АТФазы с помощью MinE и фосфолипида. Мол. Ячейка 7 , 1337–1343 (2001).

CAS Статья Google ученый

8

Hu, Z. & Lutkenhaus, J.Анализ MinC выявляет два независимых домена, участвующих во взаимодействии с MinD и FtsZ. J. Bacteriol. 182 , 3965–3971 (2000).

CAS Статья Google ученый

9

de Boer, P.A., Crossley, R.E. И Ротфилд, Л. Центральная роль продукта гена Escherichia coli minC в двух различных системах ингибирования клеточного деления. Proc. Natl. Акад. Sci. США 87 , 1129–1133 (1990).

CAS Статья Google ученый

10

de Boer, P.A., Crossley, R.E. И Ротфилд, Л. Роли MinC и MinD в блокаде сайт-специфической септации, опосредованном системой MinCDE из Escherichia coli . J. Bacteriol. 174 , 63–70 (1992).

CAS Статья Google ученый

11

Лакнер, Л.Л., Раскин, Д.М.И Бур, П.А.Дж. АТФ-зависимые взаимодействия между белков Escherichia coli Min и фосфолипидной мембраной in vitro . J. Bacteriol. 185 , 735–749 (2003).

CAS Статья Google ученый

12

Hu, Z., Saez, C. & Lutkenhaus, J. Рекрутирование MinC, ингибитора образования Z-кольца, на мембрану в Escherichia coli : роль MinD и MinE. J. Bacteriol. 185 , 196–203 (2003).

CAS Статья Google ученый

13

Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K. & Schwille, P. Пространственные регуляторы для деления бактериальных клеток самоорганизуются в поверхностные волны in vitro . Наука 320 , 789–792 (2008).

CAS Статья Google ученый

14

Крузе, К.& Юлихер, Ф. Колебания в клеточной биологии. Curr. Opin. Cell Biol. 17 , 20–26 (2005).

CAS Статья Google ученый

15

Новак Б. и Тайсон Дж. Дж. Принципы построения биохимических осцилляторов. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 9 , 981–991 (2008).

Артикул Google ученый

16

Милейковская, Е.и другие. Влияние состава фосфолипидов на взаимодействия MinD-мембраны in vitro и in vivo . J. Biol. Chem. 278 , 22193–22198 (2003).

CAS Статья Google ученый

17

Lackner, L.L. Изучение механизма динамики Min белков Escherichia coli . Кандидатская диссертация, Case Western Reserve Univ. (2006).

Google ученый

18

Мейнхардт, Х.и де Бур, П.А. Формирование паттерна в Escherichia coli : модель межполюсных колебаний белков Min и локализации сайта деления. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98 , 14202–14207 (2001).

CAS Статья Google ученый

19

Хуанг, К.С., Меир, Ю. и Вингрин, Н.С. Динамические структуры в Escherichia coli : спонтанное образование колец MinE и полярных зон MinD. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 12724–12728 (2003).

CAS Статья Google ученый

20

Meacci, G. & Kruse, K. Мин-осцилляции в Escherichia coli , индуцированные взаимодействиями мембраносвязанных белков. Phys. Биол. 2 , 89–97 (2005).

CAS Статья Google ученый

21

Дерр, Дж., Хоппер, Дж. Т., Сайн, А., Рутенберг, А. Д. Самоорганизация белкового кольца MinE в субклеточных колебаниях Min. Phys. Ред. E 80 , 011922 (2009).

Артикул Google ученый

22

Arjunan, S.N.V. И Томита, М. Новый метод многокомпонентного реакционно-диффузионного моделирования связывает временное прикрепление к мембране E. coli MinE с образованием E-кольца. Syst. Synth. Биол. 4 , 35–53 (2010).

Артикул Google ученый

23

Szeto, T.H., Rowland, S.L. И Кинг, Г.Ф. Функция димеризации MinC находится в структурно автономном С-концевом домене. J. Bacteriol. 183 , 6684–6687 (2001).

CAS Статья Google ученый

24

de Boer, P.A., Crossley, R.E., Hand, A.R. И Ротфилд, Л. Белок MinD представляет собой мембранную АТФазу, необходимую для правильного размещения сайта деления Escherichia coli . EMBO J. 10 , 4371–4380 (1991).

CAS Статья Google ученый

25

Галуш, У.Дж., Най, Дж. А. И Гровс, Дж. Количественная флуоресцентная микроскопия с использованием поддерживаемых стандартов липидного бислоя. Biophys. J. 95 , 2512–2519 (2008).

CAS Статья Google ученый

26

Вервир, П.Дж., Рокс, О., Harpur, A.G., Bastiaens, P.I.H. Измерение FRET методом фотообесцвечивания акцептора. in Взаимодействия белок-белок: Руководство по молекулярному клонированию , Vol. 2 (ред. Големис, Э. и Адамс, П. Д.) 4598–4601 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2005).

27

Hsieh, C.-W. и другие. Прямое взаимодействие MinE-мембраны способствует правильной локализации MinDE в E. coli . Мол. Microbiol. 75 , 499–512 (2010).

CAS Статья Google ученый

28

Феррелл, Дж.E. & Xiong, W. Бистабильность в клеточной передаче сигналов: как сделать непрерывные процессы прерывистыми, а обратимые процессы необратимыми. Хаос 11 , 227–236 (2001).

CAS Статья Google ученый

29

Круз, К., Ховард, М. и Марголин, В. Руководство экспериментатора по компьютерному моделированию системы Мин. Мол. Microbiol. 63 , 1279–1284 (2007).

CAS Статья Google ученый

30

Тайсон, Дж.Дж., Чен, К. И Новак, Б. Нюхают, зуммеры, переключатели и шоры: динамика регуляторных и сигнальных путей в клетке. Curr. Opin. Cell Biol. 15 , 221–231 (2003).

CAS Статья Google ученый

31

Howard, J. & Hyman, A.A. Рост, колебание и переключение на плюс-концах микротрубочек. Nat Rev. Mol. Клетка. Биол. 10 , 569–574 (2009).

CAS Статья Google ученый

32

Птацин, Дж.L. et al. Аппарат, похожий на веретено, управляет сегрегацией бактериальных хромосом. Нац. Cell Biol. 12 , 791–798 (2010).

CAS Статья Google ученый

33

Ринггаард С., Ван Зон Дж., Ховард М. и Гердес К. Перемещение и выравнивание плазмид путем разборки филаментов ParA. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106 , 19369–19374 (2009).

CAS Статья Google ученый

34

Крокер, Дж.И Гриер, Д. Методы цифровой видеомикроскопии для коллоидных исследований. J. Colloid Interface Sci. 179 , 298–310 (1996).

CAS Статья Google ученый

Мембранное связывание MinE позволяет всесторонне описать формирование паттерна Min-белка

Abstract

Палочковидная бактерия Escherichia coli выбирает центр клетки как место деления с помощью белков MinC, MinD и MinE.Эта белковая система коллективно колеблется между двумя полюсами клетки, поочередно связываясь с мембраной в одной из двух половин клетки. Это динамическое поведение, которое возникает в результате взаимодействия АТФазы MinD и ее активатора MinE на клеточной мембране, стало парадигмой самоорганизации белков. Недавно было обнаружено, что не только связывание MinD с мембраной, но также взаимодействия MinE с мембраной вносят вклад в самоорганизацию Min-белка. Здесь мы показываем, что, учитывая это открытие в вычислительной модели, мы можем всесторонне описать все наблюдаемые паттерны Min-белков in vivo и in vitro .Кроме того, изменяя геометрию системы, наши вычисления предсказывают закономерности, о которых еще не сообщалось. Мы подтверждаем эти прогнозы экспериментально.

Сведения об авторе

Уже давно предполагается, что клеточные белковые структуры образуются путем самоорганизации белков. Особенно ярким примером являются белки MinC, MinD и MinE, выбирающие центр в качестве места деления клеток у палочковидной бактерии Escherichia coli . Основываясь на связывании MinD с цитоплазматической мембраной и антагонистическом действии MinE, которое индуцирует высвобождение MinD в цитоплазму, эти белки колеблются от полюса к полюсу, где они ингибируют деление клеток.В поддержку идеи о самоорганизации, являющейся причиной осцилляций Min, было обнаружено, что очищенные белки Min спонтанно образуют бегущие волны на поддерживаемых липидных бислоях. Исчерпывающее понимание паттернов Мин, сформированных в различных условиях, остается труднодостижимым. Мы выполнили вычислительный анализ динамики Min-белка с учетом недавно обнаруженного стойкого действия MinE. Мы показываем, что это свойство позволяет воспроизвести все наблюдаемые паттерны Min-белков в единой структуре.Кроме того, наш анализ предсказывает новые структуры, которые мы наблюдали экспериментально. Наше исследование подчеркивает, что механизмы, лежащие в основе спонтанного формирования белковых паттернов в условиях очищенного in vitro , также могут генерировать паттерны внутри сложных внутриклеточных сред.

Образец цитирования: Bonny M, Fischer-Friedrich E, Loose M, Schwille P, Kruse K (2013) Мембранное связывание MinE позволяет всесторонне описать формирование паттерна Min-белка.PLoS Comput Biol 9 (12): e1003347. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347

Редактор: Лоуренс Ротфилд, Университет Коннектикута, Соединенные Штаты Америки

Поступило: 5 июня 2013 г .; Дата принятия: 3 октября 2013 г .; Опубликовано: 5 декабря 2013 г.

Авторские права: © 2013 Bonny et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: MB и KK подтверждают получение финансирования со стороны DFG в виде гранта № KK 3430 / 1-1 и SFB 1027. PS выражает признательность за финансирование через Премию Готфрида Вильгельма Лейбница от DFG. ML поддерживается стипендиями EMBO (ALTF 394-2011) и HFSP (LT000466 / 2012). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Природа представляет огромное разнообразие форм и узоров. Хотя системные специфические условия могут играть важную роль в их формировании, в прошлом были предложены также несколько общих принципов, лежащих в основе формирования биологического паттерна. Особенно привлекательной концепцией является спонтанное образование паттернов в реакционно-диффузионных системах, предложенное Аланом Тьюрингом [1]. В этом случае (небольшое) количество различных составляющих вместе образуют крупномасштабные модели.Однако пока известно лишь несколько биологических примеров истинных паттернов Тьюринга [2].

Пример формирования субклеточного паттерна из-за реакций и диффузии всего двух различных компонентов обеспечивается системой Min у палочковидной бактерии Escherichia coli [3]. Эта белковая система формирует пространственно-временные колебания в клетке, то есть стоячую волну с узлом в центре клетки [4], [5], см. Рис. 1A, которая играет важную роль в выборе места деления в E.coli . В то время как колебания возникают исключительно из-за взаимодействий между MinD, MinE и мембраной, ингибитор клеточного деления MinC связывается с MinD и, таким образом, распределяется аналогично: он периодически появляется на полюсах клетки, но практически отсутствует в центре клетки. Таким образом, в центре клетки происходит деление, в результате чего образуются две дочерние клетки одинакового размера.

Рисунок 1. Различные паттерны, сформированные MinD в живых E. coli .

А) Стоячая волна с одним узлом; Б) стоячая волна с двумя узлами.Вверху: изображение DIC, за которым следуют снимки из покадровой записи MinD-GFP; внизу: соответствующий кимограф. Шкала шкалы:.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347.g001

Хотя некоторые модели предполагают, что определенные свойства полюсов клетки могут играть важную роль в формировании паттерна Min-белков [6], ряд наблюдений подтверждает представление о том, что система Мин может самоорганизовываться без каких-либо дополнительных пространственных сигналов. Прежде всего, в зависимости от геометрии клетки и уровня экспрессии Min-белка, белковый паттерн может измениться: в более длинных клетках образуются стоячие волны с несколькими узлами [4], см. Рис. 1B, тогда как в более коротких клетках и для немного избыточных экспрессируются белки Min, колебания заменяются стохастическим переключением белков между двумя половинами клетки [7], [8].В Y-образных клетках белки посещают разные руки способом, который зависит от длины плеч [9].

Более того, исследования очищенных белков in vitro показали, что MinD и MinE спонтанно организуются в коллективные бегущие волны [10]. Вместе эти наблюдения предполагают, что паттерны Min-белков возникают из внутренней динамики этих белков, в частности, обмена белками между мембранами, обусловленного высоким сродством MinD к мембране, когда АТФ связан, и низким сродством к Граница ADP [11].Кроме того, связанный с мембраной MinD рекрутирует MinE, который, в свою очередь, вызывает гидролиз связанного нуклеотида с помощью MinD и, следовательно, отсоединение MinD от мембраны. Эти хорошо отработанные процессы лежат в основе ряда вычислительных моделей, воспроизводящих колебания Min-белка, наблюдаемые в E. coli [12].

Самый популярный механизм, изучаемый с помощью таких моделей, предполагает, что кооперативное прикрепление MinD к мембране лежит в основе формирования паттерна. В простейшем варианте скорость прикрепления MinD к мембране увеличивается в присутствии связанного с мембраной MinD [13].Несколько работ по моделям, реализующим кооперативное прикрепление мембраны различными способами и дополняя его различными побочными процессами, показали, что он может надежно генерировать колебания между полюсами, наблюдаемые у E. coli [14] — [16] даже во время закрытия перегородки. [17]. В других работах делается упор на кооперативные эффекты между уже связанными с мембранами MinD [18], [19]. Однако, несмотря на более чем десятилетний теоретический анализ, на сегодняшний день не существует полного описания всех паттернов Min-белков, наблюдаемых in vivo и in vitro .

Некоторые доказательства указывают на то, что N-концевая спираль позволяет MinE также взаимодействовать с мембраной [20], [21], однако остается неясным, было ли это свойство важным для самоорганизации системы Min. Данные по отдельной молекуле , полученные in vitro [22], а также генетический, физиологический и структурный анализ [23], наконец, предоставили доказательства того, что способность MinE взаимодействовать с фосфолипидами позволяет ему оставаться связанным с мембраной после отделения MinD, что может привести к последующему удалению нескольких димеров MinD одним димером MinE.По аналогии с молекулярными моторами, которые могут выполнять несколько последующих шагов на филаменте цитоскелета, мы называем это свойство «процессивностью MinE». Эта возможность была предложена ранее на теоретических основаниях, поскольку она предлагает механизм образования MinE-колец [19], [24], [25] и имеет решающее значение для описания направления волн Min-белка на структурированных субстратах [26]. . В настоящей работе мы выполняем вычислительное исследование, чтобы изучить последствия этого молекулярного свойства для формирования крупномасштабных структур.С этой целью мы используем детерминированные и стохастические вычисления в трех измерениях. Мы показываем, что процессивность MinE обеспечивает ключ для получения единого описания всех ранее описанных паттернов Min-белков in vivo и in vitro . Кроме того, наш анализ предсказывает неизвестные ранее закономерности, а именно бегущие волны в длинных и движущихся участках в аномально больших клетках. Мы подтверждаем существование этих состояний с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток E. coli .Помимо системы Min, наши открытия подчеркивают важность связывания с мембраной для формирования субклеточного паттерна.

Результаты

Мин-протеиновая динамика

Молекулярные взаимодействия.

Мы начнем с подробного описания молекулярных взаимодействий, которые мы считаем важными для понимания формирования паттерна Min-белков in vivo и in vitro , см. Также [27]. Начнем с АТФазы MinD. После связывания АТФ и в присутствии липидного бислоя на С-конце цитоплазматического MinD образуется амфипатическая спираль, придающая белку повышенное сродство к связыванию липидных бислоев [28] — [32].Кроме того, связывание АТФ приводит к димеризации MinD. Только в виде димера MinD обладает достаточно высоким сродством для связывания с цитоплазматической мембраной. Кинетика связывания MinD обнаруживает отклонения от кинетики Ленгмюра, указывая на то, что связывание MinD с мембраной является кооперативным [30], [33], [34]. Однако молекулярный механизм, лежащий в основе кооперативного связывания MinD, плохо изучен.

Отметим, что связанный с мембраной MinD может взаимодействовать с образованием структур более высокого порядка, однако их точное время жизни и архитектура неизвестны [35] — [37].Эксперименты in vitro на везикулах, инкубированных в буфере, содержащем MinD, предполагают двухэтапный процесс связывания MinD сначала с мембраной, а затем формирования кластеров [35]. Сообщалось, что белки MinD располагаются спирально [37]. Однако неясно, играют ли агрегаты связанного с мембраной MinD функциональную роль в формировании Min-паттерна. Отметим также, что недавние работы предоставили доказательства того, что образование спиралей MreB или фокусов протеазы Clp в E. coli индуцировалось прикрепленными флуоресцентными метками [38], [39].Еще неизвестно, отвечает ли подобный эффект за образование спиралей MinD.

MinE и MinC привлекаются к цитоплазматической мембране с помощью связанных с мембраной димеров MinD. Они связываются с перекрывающимися сайтами, расположенными на интерфейсе MinD-димер [32], [40], [41]. В то же время MinE напрямую взаимодействует с мембраной через амфипатическую α -спираль [23]. Связывание MinE стимулирует АТФазную активность MinD и, таким образом, запускает отсоединение MinD от мембраны [29], [30].Благодаря своему прямому взаимодействию с мембраной MinE может находиться на мембране в течение короткого периода, в течение которого он может ассоциироваться с др. Мембраносвязанным димером MinD [22], [23]. Благодаря взаимодействию амфипатической N-концевой спирали с мембраной, MinE может оставаться прикрепленным после активации и смещения MinD, чтобы активировать другой димер MinD, связанный с мембраной. Поскольку образование этой спирали MinE зависит от образования комплекса с его субстратом MinD, это поведение сравнимо с процессивными ферментами, которые способны оставаться прикрепленными к своим субстратам и выполнять большое количество циклов катализа перед диссоциацией [42 ].

Молекулярные процессы и динамические уравнения.

Из молекулярных взаимодействий, описанных выше, мы сделали вывод о доминирующих реакционных путях, управляющих макроскопической динамикой распределений Min-белков. Для простоты описания мы рассматривали только димеры MinD.

Процессы, захваченные в нашем анализе, были следующими: MinD в непосредственной близости от мембраны ассоциируется со скоростью липидного бислоя, см. Рис. 2. Кооперативные эффекты в процессе связывания приводят к увеличению скорости связывания, если MinD связан с мембраной. присутствуют рядом.Мы фиксируем этот эффект, увеличивая скорость связывания в разы по сравнению с локальной плотностью мембраносвязанного MinD.

Рис. 2. Схематическое изображение молекулярных процессов с участием MinD, MinE и мембраны.

Цитозольные димеры MinD связываются с мембраной с повышенной скоростью вблизи мембраносвязанного MinD (1). Отметим, что молекулярный механизм, лежащий в основе кооперативного связывания MinD с мембраной, еще не охарактеризован, и все еще неясно, образуют ли связанные с мембраной MinD кластеры.Цитозольный MinE связывается с мембранным MinD и образует комплексы MinDE (2). Комплексы MinDE диссоциируют одним из двух разных способов: MinD и MinE отделяются одновременно от мембраны (3) или MinD отделяется, тогда как MinE остается на мембране (4). Там он может повторно связываться с другим белком MinD (5) или отсоединяться (6).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347.g002

MinE связывается с мембранно-связанным MinD и образует комплекс MinDE [43]. Этот процесс происходит со скоростью, где — локальная плотность мембраносвязанного MinD.Комплекс MinDE может диссоциировать двумя способами: либо оба, MinD и MinE, отделяются от мембраны, либо только MinD покидает мембрану, тогда как MinE остается на липидном бислое. Эти два процесса происходят со скоростью и соответственно. Отдельные димеры MinE на мембране со скоростью связываются с близлежащим мембраносвязанным MinD или со скоростью диссоциируют с мембраной.

Наконец, все молекулы могут диффундировать в цитоплазме или на мембране. Подчеркнем, что мы игнорируем любые пространственные неоднородности из-за вариаций липидного состава мембраны, скопления цитоплазмы в области нуклеоида или возможного образования кластеров MinD на мембране.Мы ожидаем, что эти эффекты будут иметь меньшее значение по сравнению с процессами, которые мы рассматриваем [44].

Для теоретического изучения закономерностей, возникающих в результате этих процессов, мы использовали два разных подхода. С одной стороны, мы использовали подход среднего поля, который приводит к системе уравнений в частных производных. С другой стороны, мы использовали стохастическую модель на основе частиц. В этой модели каждый димер представлен частицей, которая беспорядочно перемещается в пространстве, а упомянутые выше процессы происходят стохастически.Соответствующие схемы реакций: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Кроме того, мы включаем тот факт, что плотность мембраносвязанного MinD ограничена таким образом, что скорость присоединения MinD к некоторая площадь мембраны пропорциональна количеству свободных участков связывания в этой области.

В подходе среднего поля состояние системы задается плотностями для различных состояний белка. Объемные плотности и обозначают цитозольные концентрации димеров MinD и димеров MinE, соответственно. Поверхностные плотности мембраносвязанных комплексов MinD, MinE и MinDE обозначены, и, соответственно.Временная эволюция этих плотностей определяется следующими динамическими уравнениями (8) (9) (10) (11) (12) Плотности, и определяются только на поверхностях, представляющих мембрану. В уравнениях (10) — (12) обозначает оператор Лапласа на поверхности и,, и являются соответствующими константами диффузии мембраносвязанных MinD, MinE и MinDE. Кроме того, это максимальная плотность MinD на мембране. В уравнениях (10) и (11) плотности и оцениваются в тех же точках, что и поверхностные плотности.В уравнениях (8) и (9) Δ обозначает оператор Лапласа в трех измерениях и и являются константами диффузии для цитозольных MinD и MinE, соответственно. Динамические уравнения для цитозольного MinD и MinE дополняются граничными условиями на диффузионные токи, которые учитывают связывание белка с мембраной и отрыв от нее: компоненты этих потоков, ортогональные мембране, равны чистой скорости прикрепления. Формально имеем (13) (14) Здесь обозначает внешний градиент нормали к границе.Обратите внимание, что эти уравнения сохраняют общее количество белка.

Мин-белковые паттерны в клеточной геометрии

Мы сначала изучили поведение паттернов белка Min в клеточной геометрии. Для этого решались стохастические и детерминированные уравнения динамики в цилиндрической области с полусферическими крышками. Параметры, используемые в этом разделе, приведены в таблице 1. Значения констант цитозольной диффузии были измерены в работе [5]. [45]. Хотя нет прямого измерения констант диффузии для мембраносвязанных MinD, MinE и MinDE, диффузия на мембранах обычно на два-три порядка меньше, чем в объеме [46].При больших значениях этих констант результирующие закономерности становятся шире и менее четко определены. Уменьшение их значений не оказывает существенного влияния на паттерны. Чтобы определить значение максимальной плотности мембраносвязанных белков, мы используем ту плотную упаковку MinD на мембране, которая дает плотность примерно 1 / (латеральное удлинение димера MinD), причем последнее составляет приблизительно. Чтобы учесть заполнение мембраны другими молекулами, мы используем значение, примерно в 10 раз меньшее,. Значения различных скоростей прикрепления и отсоединения были выбраны так, чтобы соответствовать экспериментально наблюдаемым моделям.Обратите внимание, что для значений параметров, приведенных в таблице 1, доминирующий путь для MinE-индуцированного отсоединения MinD включает в себя MinE, остающуюся на мембране. Это соответствует высокой процессивности MinE. Наконец, мы в основном рассматривали шаблоны Min в геометриях фиксированного размера. Даже в оптимальных условиях роста E. coli набирает только около 100 нм за период колебаний. Как мы покажем ниже, шаблоны устойчивы к таким изменениям.

Колебания между полюсами. Стоячие волны.

Колебания от полюса к полюсу, описанные во введении, являются физиологически наиболее важными паттернами, формируемыми белками Min.На рисунке 3A и Movie S1 мы показываем, что для общих концентраций белка, аналогичных таковым в E. coli дикого типа , и для длины клетки, наши динамические уравнения воспроизводят эту закономерность. Период колебаний составляет около 50 с, что сопоставимо с экспериментальными значениями. Качественно картина не меняется, пока соблюдается длина системы L . В соответствии с предыдущими работами [47], [48], стохастическое моделирование процессов, описанных в уравнениях. (1) — (7) показывают, что молекулярный шум не разрушает эту картину.

Если длина ячейки увеличивается сверх, то образец изменяется. В этом случае белки Min по-прежнему образуют стоячую волну, но количество узлов больше одного, см. Рисунок 3B и видеоролики S2, S3. Этот результат согласуется с экспериментально наблюдаемыми паттернами Min-белков в длинных клетках. Появление множественных узлов происходит из характерной шкалы длины паттернов Min-белков, что также очевидно из паттернов in vitro , описанных в Ref. [10], которые мы обсудим ниже.

На рис. 3C и D мы представляем период колебаний как функцию общей концентрации MinE и длины системы соответственно. Он уменьшается примерно линейно с увеличением, отражая возрастающую активность MinE по удалению MinD с мембраны. Зависимость от длины ячейки немонотонна. В целом зависимость периода от длины системы менее выражена, чем его зависимость от. Комбинируя данные с рис. 3C, D, мы заключаем, что период колебаний не является надежной характеристикой системы Min.Этот вывод согласуется с экспериментальными измерениями периода колебаний как функции длины клетки in vivo , которые показали значительные различия между разными клетками [4], [19].

Бегущие волны.

Изменения в структуре самоорганизующихся Min-белков также могут быть вызваны изменением общих концентраций MinD и / или MinE. Как показано на Рисунке 4 и в Movie S4, для общих концентраций, равных и по сравнению с использованными выше, мы находим бегущие волны в ячейках длины.В этих состояниях белки Min собираются на одном полюсе клетки и затем перемещаются по мембране к противоположному полюсу. Там белки отделяются от мембраны и перемещаются через цитоплазму обратно к исходному полюсу, где они снова собираются на мембране и перезапускают процесс. В более длинных системах бегущая волна разбивается на пакеты, движущиеся в одном направлении, отражающее длину волны, присущую динамической системе. Как и ожидалось, исходя из симметрии системы, мы иногда наблюдали в стохастическом моделировании изменение направления движения бегущих волн, см. Рис. 4A.

Ранее неофициальные сообщения о перемещающихся волнах белка Min были предоставлены Shih et al. [49], которые упомянули случайный дрейф полосы Min-белка от одного полюса к другому для minE ^{D45A / V49A} E. coli , а также Тостевином и Ховардом [50], которые наблюдали перемещающиеся полосы в нерегулярном порядке. генерируется стохастическим моделированием. Мы использовали флуоресцентную микроскопию для изучения распределения MinD в клетках, экспрессирующих MinD-GFP, см. Материалы и методы. В ячейках с длиной выше, мы действительно могли наблюдать бегущие волны, как предсказано динамическими уравнениями, см. Рисунок 4B.Кроме того, в ячейках примерно длиной мы наблюдали два волновых пакета, см. Фильмы S5, S6. Мы можем сравнить бегущие волны, наблюдаемые in vivo , с обнаруженными in vitro . Экспериментально измеренная скорость волны in vivo примерно по сравнению с примерно in vitro , тогда как длина волны in vivo составляет примерно in vivo и in vitro [10], [22]. Таким образом, отношения скоростей и длин волн сопоставимы.

Наши расчеты указали на другую ситуацию, в которой должны наблюдаться бегущие волны.В системах с растущей длиной бегущие волны обычно появлялись около критической длины, где стоячая волна с n узлов превращалась в одну с n +1 узлами, см. Рисунок 4C. Также это предсказание подтверждается экспериментами: в длинных записях распределения Min в живых E. coli , где мы могли наблюдать изменение между различными моделями стоячих волн, мы наблюдали кратковременные бегущие волны, см. Рисунок 4D. Для расчетов мы решали динамические уравнения в одном пространственном измерении.Соответствующие динамические уравнения представлены в тексте S1.

Фазовая диаграмма.

Чтобы получить исчерпывающую картину различных состояний, которые может генерировать система Min, мы представляем на рисунке 5 разрезы на фазовой диаграмме системы, полученной из численных решений динамических уравнений (8) — (12). Давайте сначала обсудим влияние общих концентраций MinD и MinE на картину в ячейке фиксированной длины, см. Рисунок 5A. Для общих концентраций MinE ниже критического значения распределения были однородными.При более высоких концентрациях возникали стоячие волны. Они превратились в бегущие волны для еще более высоких концентраций МинЭ. При стоячие волны с двумя узлами возникают в конечном интервале суммарных концентраций MinE.

Рисунок 5. Фазовая диаграмма.

Белковые структуры Min в клеточной геометрии с длиной 4,8 для различных общих концентраций MinD и MinE (A) и для варьирования общей концентрации и длины MinD с (B). Символы представляют колебания от полюса к полюсу (красные треугольники), бегущие волны (зеленые кружки), стоячие волны с двумя узлами (голубые квадраты), пространственно неоднородные установившиеся состояния (желтые пятиугольники) и стоячие волны с тремя узлами (синие ромбы). и четыре узла (фиолетовые треугольники).Параметры см. В таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347.g005

На рисунке 5B мы представляем фазовую диаграмму как функцию общей концентрации MinD и длины системы, но для фиксированного отношения общего MinD / MinE концентрации,. При достаточно низких значениях стоячие волны с увеличением количества узлов появляются по мере увеличения длины системы. Модели стоячих волн с разным количеством узлов разделены бегущими волнами.При увеличении значений стоячие волны с несколькими узлами перестают существовать. Вместо этого новое состояние появляется в достаточно коротких системах для. Здесь распределения стационарны, но не однородны. В этом случае система самопроизвольно нарушает зеркальную симметрию относительно центра ячейки. Они соответствуют ситуациям, в которых большинство белков находится в одной половине клетки и сосуществуют два зеркальных раствора, см. Рис. 6А.

Стохастическое переключение.

В примерах, рассмотренных до сих пор, влияние молекулярного шума на шаблоны Min было незначительным.Это согласуется с предыдущими работами [47], [48]. Однако есть некоторые ситуации, в которых шум необходим для понимания возникающего паттерна Min-белков. В клетках, в которых отсутствует отрицательно заряженный липид фосфатидилэтаноламин (PE), межполюсные колебания подавляются [33]. Вместо этого на цитоплазматической мембране стохастически образуются небольшие пятна мембраносвязанного MinD. Кроме того, наш анализ уравнений среднего поля (8) — (12) показал существование зеркально-симметричных стационарных состояний в коротких ячейках.В стохастической системе можно ожидать, что белки будут стохастически переключаться между этими двумя состояниями. В самом деле, существует критическая длина клетки, ниже которой белки Min не осциллируют, а переключаются стохастически между двумя полюсами клетки в случае, если MinD и MinE сверхэкспрессируются [7], [8], см. Рисунок 6B и Movie S7.

Как и в экспериментах, время переключения очень короткое по сравнению с временем, которое белки проводят в одной половине клетки. На рисунке 6C мы представляем распределение соответствующих времен пребывания.Распределение алгебраически затухает с наклоном -2,06 ± 0,27. Это значение очень похоже на экспериментальное значение −2,1. На рисунке 6D мы показываем зависимость среднего времени пребывания от длины ячейки. Можно выделить два режима. Для систем с длинами между и среднее время пребывания экспоненциально убывает с характерной длиной. Затем она резко переходит в экспоненциальную зависимость с характерной длиной. До перехода стандартные отклонения распределений времени пребывания сопоставимы с соответствующими средними значениями.После перехода стандартное отклонение уменьшается быстрее, чем среднее время пребывания, что указывает на возрастающую регулярность колебаний от полюса к полюсу. Это качественно аналогично наблюдениям in vivo [7]. Характерные длины согласуются с экспериментальными значениями с точностью до трех раз.

Минимальные узоры в аномально толстых ячейках.

Все узоры в геометрии бактерий, обсуждаемые до сих пор, были инвариантными при поворотах относительно длинной оси системы.Можно было ожидать, что паттерны Min-белков нарушат эту симметрию, если диаметр клетки будет достаточно большим. Увеличить диаметр клетки можно за счет разрушения филаментов MreB, регулирующих рост клеточной стенки, путем нанесения A22 на живые E. coli [51]. После обработки A22 мы наблюдаем локальное скопление MinD, перемещающееся на цитоплазматической мембране, см. Рисунок 7A. Обратите внимание, что при этом изменяется направление движения пятна, см. Фильм S8.В предыдущих работах влияние размера клеток на паттерны Min-белков изучали на раундах мутантов rodA [52] и Δ mreB клеток [53]. В первом случае наблюдались нерегулярные колебания, тогда как во втором случае были зарегистрированы в основном регулярные колебания, а также пятна MinD, движущиеся по окружности клетки.

Решая динамические уравнения (8) — (12) в геометрии, соответствующей ячейкам после обработки A22, мы также наблюдаем, что вращательная симметрия рисунков относительно длинной оси системы самопроизвольно нарушается, см. Рисунок 7B, C и Movie S9. .В этом случае пятно образуется на одном полюсе клетки. Затем он движется с постоянной скоростью по плоскому пути через два полюса ячейки. Эти паттерны отличаются от спиральных волн, генерируемых в толстых клетках, о которых сообщается в модели динамики Min белков с током агрегации [54]. Поведение аналогично наблюдаемому экспериментально. Однако в детерминированных расчетах пятно движется по четко определенной замкнутой траектории, не меняя своего направления движения. Это отличается от стохастического решения, см. Рис. 7C, где пятно часто меняет направление после прохождения полюса ячейки.

Минимальные белковые паттерны в открытой геометрии

Главный прорыв в понимании формирования паттернов Min-белков был достигнут при изучении Min-динамики в открытых геометриях [10], [22], [26], [54]. Экспериментально исследований in vitro с использованием поддерживаемых липидных бислоев позволили нам четко установить склонность белков Min к самоорганизации [10]. Структурный анализ показал, что связывание с мембраной может также происходить для MinE, не связанного с MinD [23], обеспечивая естественное объяснение направления волн Min-белка на структурированных поверхностях [26].

На рисунке 8 мы представляем результат численного решения динамических уравнений (8) — (12), где мы использовали периодические граничные условия в направлениях x и y . Значения параметров приведены в таблице 1. Различия между этими значениями и значениями, использованными для in vivo геометрии , отражают различия в условиях окружающей среды, в частности, присутствие или отсутствие других макромолекул. Подобно экспериментальным наблюдениям, белки Min самоорганизуются в бегущие волны.Расчетный профиль волны имеет те же особенности, что и в эксперименте: профиль MinD увеличивается на фронте волны, а затем насыщается, пока не резко спадает. Плотность MinE увеличивается медленнее, чем у MinD. Ближе к задней кромке волны она резко увеличивается, а затем быстро спадает. Параметр увеличен по сравнению со значением, определенным в разделе «Паттерны Min-белков в геометрии клеток». Представление z-зависимости распределения на Фигуре 8C показывает, что образец ограничен слоем примерно над мембраной.Этот результат апостериори оправдывает использование эффективных 2d-описаний для динамики Min-белка [10], [26], хотя не совсем очевидно, как формально получить 2d-уравнения из 3d-системы.

Рис. 8. Решения детерминированных динамических уравнений в геометрии in vitro .

A) Мембранные плотности MinD и MinE на плоской поверхности с периодическими граничными условиями. B) Профили плотности MinD и MinE, полученные из белого прямоугольника, указанного в (A).В) z-зависимость цитозольных плотностей MinD и MinE. Вверху: концентрации буфера вдоль среза в системе, внизу: крупный план концентраций буфера в этом срезе. Периодические граничные условия применялись вдоль осей x и y , граничные условия отсутствия потока для диффузионного тока в направлении z при. Суммарные концентрации MinD и MinE составляют m ⁻³ и. Значения параметров приведены в таблице 1.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1003347.g008

Интуитивное изображение паттернов Min-белков

Распространение волновых фронтов можно понять, интерпретируя пространственную координату на рисунке 8B как время: первый цитозольный MinD связывается с пустой мембраной. Нелинейность в члене связывания MinD затем приводит к увеличению скорости связывания и, таким образом, к ускоренному увеличению плотности MinD на мембране. Как только присутствует связанный с мембраной MinD, он начинает прикрепляться. Поскольку сайтов связывания MinE много, увеличение плотности MinE является примерно линейным.С увеличением плотности MinE чистая скорость присоединения MinD уменьшается. В конце концов, скорость отрыва, индуцированного MinE, превышает скорость прикрепления, и плотность связанного с мембраной MinD уменьшается. Это уменьшение является резким на заднем фронте волн, поскольку процессивность MinE приводит к накоплению MinE в этой области.

Последовательность паттернов белка Min in vivo при изменении длины системы может быть интуитивно понятна из механизма, лежащего в основе бегущих волн in vitro .С этой целью мы вводим длину диффузии, которая представляет собой длину, которую молекула обычно диффундирует перед присоединением к мембране. Для постоянной диффузии D и скорости присоединения ω она определяется выражением. Теперь рассмотрим волну в ячейке, распространяющуюся в направлении длинной оси. Волна поддерживается молекулами, связывающимися с передним фронтом волны после того, как они были выпущены из заднего фронта. Когда волна достигает полюса, димеры MinD, высвобождаемые из мембраны на задней кромке, больше не могут связываться на ее передней кромке.Вместо этого они диффундируют от полюса клетки. Если длина клетки порядка, белки будут связываться преимущественно на противоположном полюсе [55], см. Рис. 9А. Точно так же, с некоторой задержкой, MinE, выпущенная из исходной волны, также свяжется с этим полюсом, и будет сгенерирована новая волна, движущаяся в том же направлении, что и исходная.

Рисунок 9. Снимки распределений MinD и MinE в одномерной системе и соответствующие иллюстрации.

A) Если диффузионная длина MinD того же порядка, что и размер ячейки, плотность MinD будет увеличиваться по направлению к правому полюсу.То же самое верно и для MinE, и начинается волна, идущая влево. Б) Если диффузионная длина больше ячейки, образуется второй максимум в распределении MinD рядом с левым полюсом. Он поглощает большую часть свободного MinE, и волна начнется от центра к левому полюсу. C) Для длин диффузии MinD, которые очень велики по сравнению с размером ячейки, MinD восстанавливается только в левой половине ячейки, и получается стационарное состояние. Параметры как на рисунке 4C.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1003347.g009

Если размер системы короче, связывание MinD будет происходить в зоне, простирающейся дальше от нового полюса к центру клетки, потому что отношение длины диффузии к длине клетки увеличилось. Поскольку сродство к связыванию MinE с MinD на мембране велико, MinE будет предпочтительно связываться с частью зоны MinD, проксимальной к центру клетки, и волна будет двигаться в противоположном направлении по сравнению с исходной волной, см. Рисунок 9B, таким образом вызывая межполюсные колебания.Для даже более коротких клеток распределение цитозольных MinD и MinE по существу однородно, поскольку длина диффузии значительно превышает длину клетки. Таким образом, MinD, а также MinE предпочтительно связываются с зонами наивысших концентраций MinD на мембране, и возникает стационарный профиль, см. Фиг. 9C.

Таким образом, представленная здесь картина несколько отличается от механизма, лежащего в основе межполюсных колебаний, предложенного в [9]. [15], как мы обсудим ниже. В заключение отметим, что сложнее получить интуитивное представление о зависимости паттернов Min-белков от общей концентрации белка, и мы воздерживаемся от дальнейшего обсуждения этой темы.

Обсуждение

В этой работе мы представили вычислительное исследование формирования самоорганизованного паттерна с помощью MinD и MinE из E. coli . Уравнения, которые, в частности, учитывают связывание MinE с мембраной, генерируют паттерны, ранее наблюдавшиеся в живых клетках, а также белковые волны Min на плоских поверхностях, наблюдаемые в экспериментах по восстановлению. Кроме того, наш анализ выявил две закономерности, о которых раньше не сообщалось: в достаточно длинных клетках и при повышенных уровнях белка должны возникать бегущие волны, исходящие от одного полюса клетки и распространяющиеся на противоположный полюс.Во-вторых, в аномально больших ячейках должна быть потеряна вращательная симметрия рисунка и вместо этого должно образоваться движущееся пятно. Оба прогноза подтвердились экспериментально. Мы пришли к выводу, что связывание MinE с мембраной является важной молекулярной особенностью для всестороннего описания крупномасштабного формирования паттерна белков Min.

Эксперименты in vitro на мембранах с микропроцессором подтверждают важную роль процессивности MinE для формирования паттерна Min-белков [26], но еще неизвестно, так ли это в случае in vivo .Фактически, сравнивая нашу систему с предложенной Хуангом и др. [15] показывает, что процессивность MinE может, по крайней мере, частично быть заменена высокой скоростью связывания MinE с мембранно-связанным MinD (они выбрали скорость на порядки выше, чем мы). Это приводит к другому механизму, лежащему в основе межполюсных колебаний, и требует конечной скорости обмена MinD-ADP на MinD-ATP для стабилизации стоячих волн с несколькими узлами. Будет интересно проверить экспериментально, какая из двух возможностей реализуется в живом E.coli .

Наше описание не учитывает многие молекулярные детали. Например, мы не рассматривали явно стадию димеризации MinD или конечную скорость обмена АДФ на АТФ для цитозольного MinD. Также могут быть использованы различные выражения, объясняющие связывание цитозольного MinE с мембранно-связанным MinD. Мы проанализировали несколько различных выражений, описывающих эффект того, что один димер MinE может вызывать отщепление нескольких димеров MinD от мембраны. Хотя эти модификации привели к количественным различиям, их анализ также показал, что детали соответствующих выражений довольно не важны для общего поведения системы.

Вследствие относительно простых условий реакции, используемых в нашем описании, наша модель обнаруживает некоторые количественные расхождения по сравнению с экспериментальными наблюдениями. Например, флуктуации, присутствующие в кимографах на рис. 3A и B, по-видимому, больше, чем в экспериментальных кимографах на рис. 1. Кроме того, профиль волны, показанный на рис. 8, отличается от экспериментально определенного [22]. Однако полное количественное согласие, вероятно, требует знания более подробных молекулярных деталей участвующих реакций.Однако обратите внимание, что количественное сравнение на уровне отдельной ячейки также требует точных измерений соответствующего количества MinD и MinE, которые в настоящее время недоступны. Однако на более грубом уровне наше описание, кажется, соответствует топологии фазового пространства. То есть мы представляем один набор параметров, который правильно воспроизводит последовательность паттернов по мере роста клеток, а также правильно описывает появление стохастических переключений и бегущих волн в живых клетках с увеличением уровня белка.Напротив, точные точки перехода в целом отличаются от наблюдаемых в эксперименте, и любое совпадение будет случайным. Также подчеркнем, что сейчас очень нужны эксперименты, чтобы ограничить возможные значения параметров. Только с такими данными мы можем ожидать дальнейшего значительного прогресса в понимании паттернов белков Min.

В согласии с предыдущей работой, наш анализ также показал, что молекулярный шум имеет лишь незначительное влияние на паттерны Min-белков. Макроскопические признаки молекулярного шума были обнаружены только в особых условиях, а именно в коротких клетках, представляющих стохастическое переключение, и в больших клетках, где белки Min образовывали вращающийся участок со стохастически переключающимся направлением вращения.Наше описание динамики Min-белка теперь может быть использовано для разработки новых экспериментов, например, для проверки взаимодействия между Min-колебаниями и сборкой Z-кольца in vivo или для определения условий для создания паттернов Min-белков внутри везикул. in vitro . Такие эксперименты могут представить важные шаги на пути к синтезу системы, способной к автономному делению, то есть минимальной синтетической клетки.

Материалы и методы

Эксперименты

Мы использовали клетки E.coli , штамм JS964, содержащий плазмиду pAM238, кодирующую MinE и GFP-MinD, под контролем lac-промотора [5]. Бактерии выращивали в течение ночи в 3 мл среды LB при 37 ° C. Клетки индуцировали изопропил — β — D-тиогалактопиранозидом (IPTG) в концентрации и инкубировали в течение 3–4 часов перед измерениями. В течение 1-2 часов до измерения клетки выдерживали при 30 ° C для лучшей флуоресценции. Оптическая плотность менее 0,6. Во время измерений клетки находились в фазе экспоненциального роста.Образцы выдерживали при температуре 30 ° C в камере Баххоффера. Чтобы бактерии не двигались под покровным стеклом, мы помещаем их на подушку из агара (1% раствор агара в среде LB с уменьшенной фракцией дрожжевого экстракта 10% для снижения фоновой флуоресценции). Записи флуоресценции были сделаны с помощью конфокального микроскопа Olympus FV 1000 при длине волны возбуждения 488 нм от гелиевого лазера малой мощности. Мы использовали масляный иммерсионный объектив Olympus UPLSAPO 60 ×, NA 1.35 и записывали кадр каждые 3 секунды.Измерение длилось 40 мин. В течение этого периода фокусировка менялась вручную через нерегулярные промежутки времени. A22 (S- (3,4-дихлорбензил) изотиомочевина, HCl) был приобретен у Merck Millipore. Клетки были визуализированы через 2-3 часа после добавления A22.

Дополнительная информация

Видео S9.

(Теория) Формирование паттерна Min-белков в аномально большой клетке. Система имеет длину 2,7 мкм и диаметр 2 мкм. В детерминированном моделировании общие концентрации белка равны и, а в стохастическом моделировании и.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347.s010

(AVI)

Видео S10.

(Теория) Моделирование формирования паттерна Min-белков в 3D in vitro геометрии . (A) z-зависимость цитозольных плотностей MinD и MinE. (B) Плотности мембраносвязанных MinD и MinE на плоской мембране с периодическими граничными условиями.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003347.s011

(AVI)

Благодарности

Благодарим Р.D. Mullins за то, что познакомил нас с A22 для создания больших ячеек.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MB EFF ML PS KK. Проведены эксперименты: ЭФФ. Проанализированы данные: МБ ЭФФ МЛ ПС КК. Написал статью: MB EFF ML PS KK. Реализованный код для моделирования: MB.

Ссылки

1. 1. Тьюринг AM (1952) Химические основы морфогенеза. Филос Т Рой Soc B 237: 37–72.
2. 2. Кондо С., Миура Т. (2010) Модель реакции-диффузии как основа для понимания формирования биологического паттерна.Наука (Нью-Йорк, Нью-Йорк) 329: 1616–1620.
3. 3. Loose M, Kruse K, Schwille P (2011) Самоорганизация белка: уроки системы min. Анну Рев Биофиз 40: 315–336.
4. 4. Раскин Д.М., де Бур PAJ (1999) Быстрые межполюсные колебания белка, необходимые для направления деления к середине Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 96: 4971–4976.
5. 5. Hu Z, Lutkenhaus J (1999) Топологическая регуляция клеточного деления у Escherichia coli включает быстрые колебания от полюса к полюсу ингибитора деления MinC под контролем MinD и MinE.Mol Microbiol 34: 82–90.
6. 6. Дрю Д.А., Осборн М.Дж., Ротфилд Л.И. (2005) Модель полимеризации-деполимеризации, которая точно генерирует самоподдерживающуюся колебательную систему, участвующую в размещении сайта бактериального деления. Proc Natl Acad Sci USA 102: 6114–6118.
7. 7. Fischer-Friedrich E, Meacci G, Lutkenhaus J, Chaté H, Kruse K (2010) Внутри- и межклеточные колебания в динамике Min-белка уменьшаются с увеличением длины клетки. Proc Natl Acad Sci USA 107: 6134–6139.
8. 8. Слюсаренко О., Хейнриц Дж., Эмонет Т., Якобс-Вагнер С. (2011) Высокопроизводительный анализ субпиксельной точности бактериального морфогенеза и внутриклеточной пространственно-временной динамики. Мол микробиол 80: 612–627.
9. 9. Varma A, Huang KC, Young KD (2008) Система Min как общий механизм определения геометрии клетки: длины ветвей в Y-образных клетках Escherichia coli влияют на паттерны колебаний Min и динамику деления. J Bacteriol 190: 2106–2117.
10. 10.Loose M, Fischer-Friedrich E, Ries J, Kruse K, Schwille P (2008) Пространственные регуляторы для деления бактериальных клеток самоорганизуются в поверхностные волны in vitro. Science 320: 789–792.
11. 11. Lutkenhaus J (2007) Динамика сборки бактериальной системы MinCDE и пространственная регуляция Z-кольца. Анну Рев Биохим 76: 539–562.
12. 12. Ховард М., Круз К. (2005) Клеточная организация путем самоорганизации: механизмы и модели динамики белка Min.J Cell Biol 168: 533–536.
13. 13. Meinhardt H, de Boer PAJ (2001) Формирование паттерна в Escherichia coli: модель межполюсных колебаний белков Min и локализации сайта деления. Proc Natl Acad Sci USA 98: 14202–14207.
14. 14. Ховард М., Рутенберг А.Д., де Вет С. (2001) Динамическая компартментализация бактерий: точное деление в E. coli. Physical Review Letters 87: 278102.
15. 15. Хуанг К., Меир Й., Вингрин Н.С. (2003) Динамические структуры в Escherichia coli: спонтанное образование колец MinE и полярных зон MinD.Proc Natl Acad Sci USA 100: 12724–12728.
16. 16. Павин Н., Палетак Х.С., Крстич В. (2006) Колебания Min-белка в Escherichia coli со спонтанным образованием двухцепочечных нитей в трехмерной стохастической модели реакции-диффузии. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 73: 021904.
17. 17. Ди Вентура Б., Сурджик В. (2011) Самоорганизованное разделение динамически локализованных белков при делении бактериальных клеток. Mol Syst Biol 7: 457.
18. 18.Kruse K (2002) Динамическая модель для определения середины кишечной палочки. Biophys J 82: 618–627.
19. 19. Meacci G, Kruse K (2005) Мин-осцилляции в Escherichia coli, вызванные взаимодействиями мембраносвязанных белков. Физическая биология 2: 89–97.
20. 20. Hsieh CW, Lin TY, Lai HM, Lin CC, Hsieh TS и др. (2010) Прямое взаимодействие MinE-мембраны способствует правильной локализации MinDE в E. coli. Mol Microbiol 75: 499–512.
21. 21.Shih YL, Huang KF, Lai HM, Liao JH, Lee CS и др. (2011) N-концевая амфипатическая спираль фактора топологической специфичности MinE связана с формированием кривизны мембраны. PLoS ONE 6: e21425.
22. 22. Loose M, Fischer-Friedrich E, Herold C, Kruse K, Schwille P (2011) Белковые паттерны Min возникают в результате быстрого повторного связывания и мембранного взаимодействия MinE. Nat Struct Mol Biol 18: 577–583.
23. 23. Park KT, Wu W., Battaile KP, Lovell S, Holyoak T, et al.(2011) Осциллятор Min использует MinD-зависимые конформационные изменения в MinE для пространственной регуляции цитокинеза. Cell 146: 396–407.
24. 24. Derr J, Hopper JT, Sain A, Rutenberg AD (2009) Самоорганизация белкового кольца MinE в субклеточных колебаниях Min. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 80: 011922.
25. 25. Arjunan SNV, Tomita M (2010) Новый метод многокомпонентного реакционно-диффузионного моделирования связывает временное прикрепление к мембране E. coli MinE с образованием E-кольца.Syst Synth Biol 4: 35–53.
26. 26. Schweizer J, Loose M, Bonny M, Kruse K, Mönch I и др. (2012) Определение геометрии с помощью самоорганизующихся белковых паттернов. PNAS 109: 15283–15288.
27. 27. Shih YL, Zheng M (2013) Пространственный контроль сайта деления клеток системой Min в Escherichia coli. Environ Microbiol [epub перед печатью] doi: https: //doi.org/ 10.1111 / 1462-2920.12119.
28. 28. Szeto TH, Rowland SL, Rothfield LI, King GF (2002) Мембранная локализация MinD опосредована С-концевым мотивом, который консервативен в эубактериях, архее и хлоропластах.Proc Natl Acad Sci USA 99: 15693–15698.
29. 29. Hu Z, Lutkenhaus J (2003) Консервативная последовательность на C-конце MinD необходима для связывания с мембраной и нацеливания MinC на перегородку. Мол микробиол 47: 345–355.
30. 30. Lackner LL, Raskin DM, de Boer PAJ (2003) АТФ-зависимые взаимодействия между белками Min Escherichia coli и фосфолипидной мембраной in vitro. J Bacteriol 185: 735–749.
31. 31. Szeto TH, Rowland SL, Habrukowich CL, King GF (2003) Направляющая на мембрану последовательность MinD представляет собой трансплантируемую липид-связывающую спираль.J Biol Chem 278: 40050–40056.
32. 32. Wu W, Park KT, Holyoak T, Lutkenhaus J (2011) Определение структуры комплекса MinD-ATP показывает ориентацию MinD на мембране и относительное расположение сайтов связывания для MinE и MinC. Мол микробиол 79: 1515–1528.
33. 33. Милейковская Е., Фишов И., Фу Х, Корбин Б.Д., Марголин В. и др. (2003) Влияние состава фосфолипидов на взаимодействия MinD-мембраны in vitro и in vivo. J Biol Chem 278: 22193–22198.
34. 34. Renner LD, Weibel DB (2012) MinD и MinE взаимодействуют с анионными фосфолипидами и регулируют образование плоскости деления в Escherichia coli. Журнал биологической химии 287: 38835–38844.
35. 35. Hu Z, Gogol EP, Lutkenhaus J (2002) Динамическая сборка MinD на фосфолипидных везикулах, регулируемых АТФ и MinE. Proc Natl Acad Sci USA 99: 6761–6766.
36. 36. Suefuji K, Valluzzi R, RayChaudhuri D (2002) Динамическая сборка MinD в связки _lament, модулируемые АТФ, фосфолипидами и MinE.Proc Natl Acad Sci USA 99: 16776–16781.
37. 37. Shih YL, Le T, Rothfield LI (2003) Выбор сайта деления в Escherichia coli включает динамическое перераспределение белков Min внутри спиральных структур, которые простираются между двумя полюсами клетки. Proc Natl Acad Sci USA 100: 7865–7870.
38. 38. Swulius MT, Jensen GJ (2012) Спиральный цитоскелет MreB в Escherichia coli MC1000 / pLE7 является артефактом N-концевой желтой флюоресцентной белковой метки. J Bacteriol 194: 6382–6386.
39. 39. Landgraf D, Okumus B, Chien P, Baker TA, Paulsson J (2012) Сегрегация молекул при делении клетки выявляет локализацию нативного белка. Нат Методы 9: 480–482.
40. 40. Ma LY, King G, Rothfield LI (2003) Картирование сайта MinE, участвующего во взаимодействии с белком выбора сайта деления MinD Escherichia coli. J Bacteriol 185: 4948–4955.
41. 41. Ma L, King GF, Rothfield LI (2004) Размещение сайта связывания MinE на поверхности MinD предполагает вероятный механизм активации АТФазы MinD Escherichia coli во время выбора сайта деления.Мол микробиол 54: 99–108.
42. 42. Брейер В.А., Мэтьюз Б.В. (2001) Структурная основа процессивности. Protein Sci 10: 1699–1711.
43. 43. Park KT, Wu W, Lovell S, Lutkenhaus J (2012) Механизм асимметричной активации АТФазы MinD с помощью MinE. Мол микробиол 85: 271–281.
44. 44. Halatek J, Frey E (2012) Высококанальный перенос MinD и секвестрация MinE объясняют происхождение устойчивой динамики MinCDE-белка. Cell Rep 1: 741–752.
45. 45. Meacci G, Ries J, Fischer-Friedrich E, Kahya N, Schwille P и др. (2006) Подвижность Min-белков в Escherichia coli, измеренная с помощью флюоресцентной корреляционной спектроскопии. Физическая биология 3: 255–263.
46. 46. Lippincott-Schwartz J, Snapp E, Kenworthy A (2001) Изучение динамики белка в живых клетках. Nat Rev Mol Cell Bio 2: 444–456.
47. 47. Kerr RA, Levine H, Sejnowski TJ, Rappel WJ (2006) Точность деления в стохастической модели минимальных колебаний в Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA 103: 347–352.
48. 48. Fange D, Elf J (2006) Шум-индуцированные фенотипы Min у E. coli. PLoS Comput Biol 2: e80.
49. 49. Shih Y, Fu X, King G, Le T, Rothfield LI (2002) Размещение сайта деления в E.coli: мутации, которые предотвращают образование кольца MinE, приводят к потере нормальной остановки роста в средней клетке полярных мембранных доменов MinD. Embo J 21: 3347–3357.
50. 50. Тостевин Ф., Ховард М. (2006) Стохастическая модель колебаний Min в Escherichia coli и сегрегации белка Min во время деления клеток.Физическая биология 3: 1–12.
51. 51. Gitai Z, Dye NA, Reisenauer A, Wachi M, Shapiro L (2005) MreB-актин-опосредованная сегрегация определенной области бактериальной хромосомы. Ячейка 120: 329–341.
52. 52. Корбин Б.Д., Ю. Х, Марголин В. (2002) Изучение внутриклеточного пространства: функция системы Min в округлой форме Escherichia coli. Embo J 21: 1998–2008.
53. 53. Shih YL, Kawagishi I, Rothfield LI (2005) Цитоскелетоподобные системы MreB и Min играют независимые роли в полярной дифференцировке прокариот.Mol Microbiol 58: 917–928.
54. 54. Фишер-Фридрих Э., Ван Йен Р.Н., Крузе К. (2007) Поверхностные волны Мин-белков. Физическая биология 4: 38–47.
55. 55. Kulkarni R, Huang K, Kloster M, Wingreen NS (2004) Формирование паттерна внутри Escherichia coli: диффузия, прикрепление к мембране и самовзаимодействие молекул MinD. Письма физического обзора 93: 228103.
56. 56. Хаттне Дж., Фанге Д., Эльф Дж. (2005) Стохастическое моделирование реакции-диффузии с помощью MesoRD.Биоинформатика 21: 2923–2924.
57. 57. Эльф Дж., Эренберг М. (2004) Спонтанное разделение бистабильных биохимических систем на пространственные домены противоположных фаз. Syst Biol 1: 230–236.

Механизм модуляции стабильности MinD с помощью MinE в динамике белка Min

Abstract

Паттерны, сформированные как in vivo , так и in vitro системой белков Min, вызвали большой интерес из-за сложности их динамических взаимодействий с учетом кажущаяся простота составных частей.Несмотря на экспериментальное и теоретическое внимание, уделяемое этой системе, детали биохимических взаимодействий MinD и MinE, белков, ответственных за формирование паттерна, все еще остаются неясными. Напр., Ни одна модель, согласующаяся с известной биохимией, еще не объяснила наблюдаемую двойную роль MinE в стабильности мембраны MinD. До сих пор статистическое сравнение моделей с изменением концентрации белка Min на мембране не проводилось. Такой подход является мощным способом проверки существующих и новых моделей, которые трудно проверить с помощью чисто экспериментального подхода.Здесь мы извлекаем временные ряды из ранее опубликованных покадровых изображений флуоресцентной микроскопии экспериментов in vitro и подгоняем к данным две ранее описанные и одну новую математическую модель. Мы обнаружили, что новая модель, которую мы называем «Асимметричная активация с мостовой моделью стабильности», лучше всего соответствует данным динамики времени. Это также согласуется с известной биохимией и объясняет двойную роль MinE через MinE-зависимую стабильность мембраны, которая под влиянием повышения MinE переходит в нестабильность мембраны с положительной обратной связью.Наши результаты показывают более сложную сеть взаимодействий между MinD и MinE, лежащую в основе динамики Min-системы, чем считалось ранее.

Система Min из Escherichia coli — одна из простейших известных биологических систем, демонстрирующих разнообразное сложное пространственно-временное поведение. Он состоит из трех белков, MinC, MinD и MinE, которые вместе динамически регулируют положение сайта деления клетки. Взаимодействие MinD и MinE на клеточной мембране вызывает связанные колебания трех белков Min от полюса клетки к полюсу клетки [39, 25, 19, 20, 24, 30], в то время как MinC локально ингибирует образование Z-кольца, сократительное кольцо, разделяющее клетку надвое [9, 3, 23, 53, 20, 38].Характер колебаний Min-белка зависит от длины и формы клеток. В стержневых ячейках связанные плотности MinD и MinE стохастически переключаются от полюса ячейки к полюсу ячейки в коротких ячейках [12], регулярно колеблются от полюса ячейки к полюсу ячейки в ячейках среднего размера [39, 14, 12] и колеблются. регулярно от полюса клетки к средней клетке в длинных мутантных клетках [39, 14]. В круглых мутантных клетках плотности MinD и MinE колеблются антиподально [7, 45], а в разветвленных мутантных клетках плотности MinD и MinE колеблются от ветви к ветви к ветви [48].MinD и MinE также формируют динамические паттерны in vitro . В искусственных, палочкообразных, покрытых мембранами компартментах плотности MinD и MinE демонстрируют колебательное поведение, как в клетках [55]. Пожалуй, наиболее поразительно то, что на поддерживаемых липидных бислоях плотности MinD и MinE подвергаются пространственно-однородным колебаниям во времени [28] и формируются в бегущие волны [32, 28, 31, 50, 49], спиральные волны [32, 28, 31, 50 , 49], динамические формы амеб [28, 49], змеевидные выступы [28], грибовидные формы [49] и всплески [49].

Биохимия, кристаллография и исследования мутантов вместе пролили свет на многие детали белковых структур и реакций, лежащих в основе возникающего макроскопического поведения системы MinDE. Они обнаружили, что цитозольные мономеры MinD связываются с АТФ и образуют димеры [24, 54, 52], которые связываются с фосфолипидной мембраной [18, 24, 22, 30, 54, 32] и совместно привлекают другие цитозольные димеры MinD для связывания с мембрана [30]. Кроме того, цитозольные димеры MinE связываются с димерами MinD на мембране [18, 31], связываются с мембраной [36] и стимулируют активность АТФазы в связанных димерах MinD, в результате чего димеры MinD отделяются от мембраны [21, 18, 24, 30], в то время как димеры MinE временно остаются связанными с мембраной [17, 46, 49], прежде чем вернуться в цитозоль.Эта характеристика кинетики MinDE изображена на верхней панели рис. 1 и упоминается здесь как модель асимметричной активации (AAM).

Рисунок 1:

Рассмотрены мультфильмы моделей Min-системы — показаны только концептуально важные реакции. Верхняя панель: димеры AAM и CAAM — MinD связываются с мембраной и привлекают димеры MinE, которые затем вызывают гидролиз АТФ в димерах MinD, вызывая диссоциацию димеров MinD от мембраны. Средняя панель: Симметричная модель активации. При присоединении одного MinE гидролиз АТФ в димерах MinD не индуцируется, и димеры MinD стабилизируются на мембране.При присоединении двух MinE индуцируется гидролиз. Нижняя панель: Асимметричная активация с мостовой моделью устойчивости. Эта модель включает CAAM в свое ядро, но добавляет возможность связывания второго димера MinD с MinE, стабилизируя оба димера MinD на мембране. Мы предполагаем, что штамм, наложенный на димер MinE в результате связывания двух димеров MinD (обратите внимание на измененную конформацию MinE в комплексе ded ), изменяет взаимодействие MinE с MinD, временно нарушая его способность индуцировать гидролиз АТФ в любом димере MinD.Детали реакций для четырех моделей приведены на рис. 6

В преодолении разрыва между взаимодействиями белков и возникающим паттерном математическое моделирование системы Min имеет долгую и богатую историю. Большинство математических моделей динамики MinDE основаны на подмножестве описанных выше реакций, и, как правило, их целью было воспроизвести поведение системы Min in vivo . Они успешно продемонстрировали колебательное поведение, характерное для коротких клеток [12, 4], клеток среднего размера [16, 34, 29, 43, 51], длинных клеток [34, 26, 33, 47, 4, 51], делящихся клеток. [47, 44, 10, 51], аберрантная клеточная геометрия [27, 11, 13, 4, 48, 41] и мутанты MinE [8, 2].Несколько математических моделей воспроизводили поведение системы Min in vitro , включая бегущие волны [32, 37] и спиральные волны [32, 4] на поддерживаемых липидных бислоях и формирование рисунка на геометрически ограниченных мембранах [42] и субстратах с микрорельефами [15]. .

Для проверки различных математических моделей системы Min использовались различные количественные экспериментальные измерения: период межполюсных колебаний in vivo [33, 47, 8, 5, 2, 13, 4, 51], распределения времен пребывания. при стохастическом переключении полюс-полюс [12, 4] и регулярных колебаниях полюс-полюс [12] in vivo , а скорость бегущей волны и длина волны in vitro [32].Однако ни одна модель не сравнивалась количественно с данными о динамике. Количественное сравнение того, насколько хорошо модели соответствуют данным с течением времени, является следующим логическим шагом в выборе и проверке модели.

В экспериментах Иванова и Мизуучи in vitro [28] буфер протекал поверх поддерживаемого липидного бислоя для обеспечения пространственно однородных концентраций компонентов реакции в буфере. На поддерживаемом липидном бислое плотности MinD и MinE почти однородно колебались в пространстве перед формированием бегущих волн.В пространственно однородных условиях системы дифференциальных уравнений в частных производных (PDE), которые моделируют эволюцию концентраций белка Min в пространстве и времени, сводятся к системам обыкновенных дифференциальных уравнений (ODE), которые описывают только локальные реакции. Эта установка значительно упрощает моделирование. Мы находим области пространства, в которых данные о колебаниях из экспериментов Иванова и Мидзуучи имеют наименьшее количество пространственных вариаций, и извлекаем из них один период пространственно почти однородных данных о ходе колебаний, в дальнейшем именуемых данными колебаний .Подгонка моделей ODE к данным о колебаниях позволяет нам сравнивать различные модели механизмов реакции без осложнений из-за пространственных эффектов, но при этом дает представление о формировании паттернов. Данные о колебаниях показаны точками на верхней панели рис. 2, а подробности извлечения данных обсуждаются в разделе «Методы».

Рисунок 2:

Для модели асимметричной активации (AAM) соответствие данным колебаний показано на (а), а соответствие данным диссоциации MinD показано на (b). Посадки сплошные, данные пунктирные.Данные были масштабированы и сдвинуты таким образом, чтобы охватить диапазон от 0 до 1, и модель была изменена с использованием того же преобразования на этом и следующем рисунках, чтобы обеспечить четкое отображение подгонок к временным курсам MinD и MinE.

Vecchiarelli и др. . недавно показали, что, помимо действия как ингибитор связывания MinD с мембраной, время от времени MinE может стабилизировать MinD на мембране [49]. В экспериментах in vitro , подобных экспериментам Иванова и Мидзуучи, они протекали буфер с MinE и без него поверх слоя MinD, связанного с поддерживаемым липидным бислоем.Первоначально MinD диссоциировал с мембраны с MinE в проточном буфере медленнее, чем без MinE в проточном буфере. Позже концентрация связанного с мембраной MinE увеличивалась, и MinD диссоциировал от мембраны быстрее, чем без MinE в проточном буфере. Подгонка моделей ODE к данным о диссоциации MinD Vecchiarelli и др. . С использованием и без MinE в проточном буфере позволяет нам сравнить, насколько хорошо различные модели механизма реакции повторяют двойную роль MinE в связывании с мембраной MinD.Данные диссоциации MinD с и без MinE в проточном буфере, далее называемые данными диссоциации MinD , показаны точками на нижней панели рис. 2. Мы называем данные осцилляций и данные диссоциации MinD вместе как данные временного курса .

Механизм, лежащий в основе двойной роли MinE в связывании MinD с мембраной, неясен, математическая модель не учитывала его, и его биологические последствия остаются неизвестными. Единственная текущая гипотеза предполагает, что один связанный димер MinE закрепляет димер MinD на мембране, тогда как два связанных димера MinE стимулируют активность АТФазы в димере MinD, вызывая его отделение и диссоциацию от мембраны [49].Мы формулируем этот механизм в виде математической модели, которую мы называем Симметричной моделью активации (SAM). Мутационные исследования показали, однако, что одного димера MinE, связанного с димером MinD, достаточно для стимуляции активности АТФазы в димере MinD [35]. Основываясь на этом открытии, мы предлагаем новую модель, модель асимметричной активации с мостовой стабильностью (AABSM), которая учитывает двойную роль MinE в связывании мембраны MinD и требует только одного связанного димера MinE для стимуляции активности АТФазы в димере MinD.Обе эти модели показаны в упрощенной форме на рис. 1 с подробностями, указанными в методах.

Мы подогнали SAM и AABSM к данным колебаний и данным диссоциации MinD, используя метод гомотопической минимизации для оценки параметров в дифференциальных уравнениях [6]. Для сравнения мы также подгоняли математическую версию AAM к данным динамики, а также комплексную асимметричную модель активации (CAAM) и общую модель возбудимости (модель ФитцХью-Нагумо). Изучение того, как модели соответствуют данным с течением времени, позволяет нам различать биохимические допущения в различных моделях.Наша подгонка модели также предоставляет нам временные рамки для скрытых состояний белка, которые было бы трудно или невозможно измерить экспериментально. В конечном счете, наш анализ поддерживает AABSM и предполагает, что через более сложную сеть взаимодействий, активаций и ингибирований между MinD и MinE, чем считалось ранее, формирование паттерна Min-системы управляется MinE-зависимой усиленной стабильностью MinD на мембране. с последующим переключением на нестабильность мембраны с положительной обратной связью, продиктованное Минэкономразвития.

Результаты

Подбор модели асимметричной активации

Среди ранее опубликованных математических моделей модель Бонни et al. [4] (далее модель Бонни) демонстрирует самый разнообразный набор поведений, которые качественно аналогичны экспериментальным наблюдениям системы Min in vivo и in vitro , включая стохастическое переключение полюса на полюс в коротких клетках, регулярные межполюсные колебания в клетках среднего размера, расщепление колебаний в растущих клетках, регулярные колебания от полюса к средней клетке в длинных клетках, сквозные колебания в толстых клетках и спиральные волны на поддерживаемом липидном бислое.В модели Бонни объемные димеры MinD связываются с мембраной ( D → d ), а связанные с мембраной димеры MinD кооперативно привлекают больше объемных димеров MinD для связывания с мембраной или связывания с объемными димерами MinE, образуя мембраносвязанный MinD-MinE. комплексы ( d, E → de ). Затем димеры MinE в комплексе de стимулируют активность АТФазы в связанных димерах MinD, заставляя димеры MinD диссоциировать от мембраны, в то время как димеры MinE либо возвращаются в основную массу ( de → D, E ), либо временно остаются на мембране. мембрана ( de → D, e ).Наконец, связанные с мембраной димеры MinE либо диссоциируют от мембраны ( e → E ), либо связываются с мембраносвязанными димерами MinD, образуя связанные с мембраной комплексы MinD-MinE ( d, e → de ). Помимо вышеупомянутых реакций, объемные частицы диффундируют в объеме, а связанные с мембраной частицы диффундируют на мембране в модели Бонни. Учитывая способность модели Бонни качественно воспроизводить паттерны мин-системы, мы хотели посмотреть, насколько хорошо она может описывать данные о динамике времени.

Мы модифицировали модель Бонни, чтобы она соответствовала экспериментальным условиям и результатам, лежащим в основе данных о зависимости от времени, чтобы получить AAM, названный так, чтобы подчеркнуть, что одного димера MinE достаточно для активации гидролиза в димере MinD.Детали модификаций обсуждаются в Методах. Рисунок, показывающий некоторые из определяющих характеристик AAM, показан на верхней панели рис. 1. Полный набор реакций в AAM изображен на рис. 6, а AAM записан как система ODE в формуле. S2.

Подгоняя AAM к данным динамики времени, как описано в разделе «Материалы и методы», мы обнаружили достаточно хорошее качественное согласие, но некоторые детали различались, как видно на рис. 2. Для данных колебаний после слишком высокого пика соответствие плотности MinD сначала падает слишком быстро, имеет аналогичную максимальную скорость уменьшения по сравнению с данными динамики времени, а затем снова падает слишком быстро в хвосте импульса.Кроме того, AAM также не может повторить почти линейное увеличение плотности MinE примерно с 70 до 190 с. Как и в случае с MinD, окончательное возвращение MinE к устойчивому состоянию также происходит слишком быстро. Для данных о диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, как и ожидалось, учитывая, что AAM рассматривает MinE исключительно как ингибитор связывания MinD с мембраной, AAM не может воспроизвести колено в плотности MinD около 25 с, когда MinE переходит от стабилизации к дестабилизирующий МинД на мембране. Кроме того, AAM не может повторить увеличение скорости чистого присоединения MinE примерно с 5 до 20 секунд.Вместо этого плотность MinE сначала быстро растет, а затем уменьшается, по-видимому, по мере того, как количество MinD, доступное для его связывания на мембране, падает. Кроме того, мы отмечаем, что, хотя AAM, по-видимому, качественно описывает данные динамики времени довольно хорошо, вариант модели ФитцХью-Нагумо (FHNM), упрощенная модель срабатывания нейронов, качественно описывает данные динамики времени почти так же хорошо, как AAM, как показано на рис. S4. Таким образом, мы предупреждаем, что то, что кажется достаточно хорошим качественным согласием с данными, не обязательно квалифицируется как хорошая биохимическая модель.В таблице 1 мы показываем относительную статистику χ ² и оценку информационного критерия Акаике (AIC) для всех рассмотренных моделей. Эти количества проясняют, что ни FHNM, ни AAM не особенно хорошо объясняют данные о времени, но что AAM лучше, чем FHNM.

Таблица 1: Сравнение моделей

. × ² — взвешенная сумма квадратов остатков, AIC — оценка информационного критерия Акаике, минимальное значение × ² среди моделей, AIC _min — минимальное значение AIC среди моделей, и n — количество подгоночных параметров.AIC — это оценка информации, потерянной при использовании модели для представления данных, и учитывает преимущество подгонки от наличия большего количества параметров; он уменьшается по мере улучшения соответствия данным и увеличивается с увеличением количества параметров в модели. Как показывает практика, разница в AIC более 10 между двумя моделями является убедительным доказательством в пользу модели с более низким показателем AIC [1]. Как по показателям χ ² , так и по показателям AIC, AABSM четко описывает оба набора данных динамики времени наилучшим образом.

Подбор модели комплексной асимметричной активации

Основываясь на экспериментальных наблюдениях с момента публикации модели Бонни, мы расширили AAM, включив дополнительные реакции (подробности см. В дополнительном материале), а затем подогнали модель комплексной асимметричной активации (CAAM) до данные о зависимости от времени, чтобы увидеть, заметно ли улучшает подбор данных включение новых реакций. Рисунок, показывающий некоторые из определяющих характеристик СААМ, показан на верхней панели рис.1, полный набор реакций в СААМ изображен на рис. 6, а СААМ записан как система ОДУ в формуле. S3.

Мы обнаружили, что CAAM соответствует данным динамики времени значительно лучше, чем AAM, что качественно можно увидеть на рис. S2 и количественно показано статистикой χ ² и оценками AIC в таблице 1.

реакция позволяет рекрутировать MinD на мембрану на протяжении всего импульса, и его включение в CAAM, по-видимому, смягчило выброс пика с последующим ускоренным падением MinD в соответствии с данными о колебаниях.Включение облегченного рекрутирования (реакций) MinE в CAAM, по-видимому, позволило лучше согласовать наблюдаемую постоянную скорость присоединения чистой MinE-мембраны между 70 с и 190 с в данных колебаний и возрастающей скорости чистой MinE-мембраны. присоединение от примерно 5 с до 20 с в данных о диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, предположительно за счет увеличения облегчения, даже когда связываемое количество MinD на мембране уменьшается. В конечном итоге CAAM, похоже, довольно хорошо соответствует данным о колебаниях.Однако, как и AAM, CAAM неспособен продемонстрировать двойную роль MinE как стабилизатора и дестабилизатора связывания MinD с мембраной.

Подбор модели симметричной активации

Чтобы учесть двойную роль MinE как стабилизатора и дестабилизатора связывания мембраны MinD, Vecchiarelli et al. предположил, что связывания одиночного димера MinE с мембраносвязанным димером MinD недостаточно для стимуляции активности АТФазы в димере MinD [49]. Скорее, они предположили, что связывание одного димера MinE с мембраносвязанным димером MinD стабилизирует димер MinD на мембране за счет взаимодействия MinE с мембраной, а последующее связывание второго димера MinE с мембраносвязанным димером MinD стимулирует Активность АТФазы в димере MinD, вызывающая его диссоциацию от мембраны.Упрощенная версия этого биохимического устройства также была предложена ранее в исследовании моделирования с другой мотивацией, прежде чем стало известно, что MinE играет несколько ролей во взаимодействии MinD с мембраной [37]. Не было предложено никакой другой гипотезы, объясняющей двойную роль MinE в связывании MinD с мембраной.

Мы сформулировали Vecchiarelli et al. Гипотеза в математической модели, которую мы называем Симметричной моделью активации (SAM), потому что она требует двух димеров MinE, по одному присоединенному к каждой субъединице MinD-димера, чтобы вызвать удаление димера MinD с мембраны.При этом мы включили в SAM широкий спектр возможных реакций, потому что у нас не было экспериментальной базы для полного набора реакций, которые должны быть включены в него. Подробности приведены в Методах. Рисунок, показывающий некоторые из определяющих характеристик SAM, показан на средней панели рис. 1, полный набор реакций SAM изображен на рис. 6, а SAM записан как система ODE в формуле. S4.

Мы обнаружили, что выбор оптимального параметра подгонки данных для SAM обеспечивает лучшее соответствие обоим наборам данных о курсе времени, чем CAAM (см.рис.S3 и Таблица 1). Наиболее примечательно, что для данных о диссоциации MinD с MinE в проточном буфере SAM частично воспроизводит колено в плотности MinD около 25 с, когда MinE переходит от стабилизации к дестабилизации связывания MinD с мембраной, тогда как CAAM этого не делает. Однако SAM демонстрирует менее динамический сдвиг, чем это видно в данных.

Подбор модели асимметричной активации с помощью мостиковой модели стабильности

Вопреки предположению, лежащему в основе SAM, эксперименты показали, что один димер MinE, связанный с одной субъединицей димера MinD, стимулирует активность АТФазы в обеих субъединицах димера MinD [35], подтверждая теорию, что димеры MinE стимулируют активность АТФазы в димерах MinD асимметрично, а не симметрично.Нет прямых доказательств структуры мембраностойкого комплекса MinD-MinE, но одна кристаллическая структура показывает димер MinE, соединяющий два димера MinD. В этой структуре один димер MinD повернут на 90 ° по отношению к другому димеру MinD [36], что привело к тому, что структура считается экспериментальным артефактом, а не биологически релевантным состоянием. Несмотря на это, мы предполагаем, что димер MinE, соединяющий два димера MinD ( ded ), может быть мембранно-стабильным комплексом MinD-MinE. Мы предполагаем, что штамм, связанный с поворотом на 90 °, необходимым для обеспечения того, чтобы оба димера MinD могли связываться с мембраной, ингибирует активность АТФазы в обоих димерах MinD до уровня ниже активности в комплексе de , нарушая оба интерфейса MinD-MinE от что в комплексе de .Кроме того, мы предполагаем, что дополнительные мембранные якоря в комплексе ded стабилизируют комплекс по сравнению с димером d . Последнее предположение дает объяснение более медленному наблюдаемому отрыву MinD в присутствии MinE по сравнению с его отсутствием. Эти предположения легли в основу нашей формулировки AABSM.

Как и в SAM, мы включили в AABSM широкий спектр возможных реакций. На нижней панели рис.1. Полный набор реакций AABSM изображен на рис. 6, а модель записана как система ОДУ в формуле. S5.

Мы обнаружили, что AABSM соответствует обоим наборам данных о зависимости от времени лучше, чем SAM (см. Рис. 3 и таблицу 1), и может описывать все особенности данных о зависимости от времени, включая излом в плотности MinD на 25 с в Данные о диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, когда MinE переходит от стабилизации MinD к дестабилизации MinD, что не было хорошо отражено ни в одной из трех других моделей.

Рисунок 3:

Для асимметричной активации с мостовой моделью стабильности (AABSM) соответствие данным осцилляций показано на (a), а соответствие данным диссоциации MinD показано на (b). Данные отображаются в виде точек с цветами для MinD и MinE, соответствующими цветам модели.

Значения состояний из подгонки AABSM к данным зависимости от времени показаны на рис. 4. Когда концентрации мембраносвязанных димеров MinD (зеленая кривая) высоки, MinE преимущественно связывается двумя димерами MinD (синяя кривая). и MinD устойчив на мембране.По мере того как концентрация мембраносвязанных димеров MinD уменьшается, преобладающая форма MinE связывается с одним димером MinD (красная кривая), и, следовательно, MinD нестабилен на мембране. Кроме того, только когда концентрация связанных с мембраной димеров MinD становится незначительной (примерно через 200 с по данным осцилляций и примерно через 24 с по данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере) концентрации мембраносвязанных димеров MinE (черная кривая) ) становятся неотъемлемой частью и сохраняются. Эта прогрессия состояний, связанных с мембраной, описана более подробно в Обсуждении.

Рисунок 4:

Для AABSM, значения состояния из подгонки к данным колебаний показаны на (а), а значения состояний из подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере показаны на (b). c _d — концентрация мембраносвязанных димеров MinD ( d ), мембранно-полустабильное состояние MinD; c _de — концентрация димеров MinE, связанных с одним димером MinD ( de ), мембранно-нестабильное состояние MinD; c _ded — концентрация димеров MinE, соединяющих два димера MinD ( ded ), мембрано-стабильное состояние MinD; и c _e — концентрация мембраносвязанных димеров MinE ( e ).Отметим, что концентрация мембрано-стабильных димеров MinD вдвое превышает значение c _ded . Одной из важных особенностей обоих графиков является переход от зеленого к синему, от красного к черному, что подчеркивает упорядоченную динамику.

Обсуждение

За последние двенадцать лет успех воссоздания взаимодействий белков Min на поддерживаемых мембранах позволил по-новому взглянуть на поведение системы [32, 31, 28, 49]. Некоторые из этих экспериментальных исследований сопровождались математическим моделированием, но ни одно из этих исследований по моделированию, ни другие не делали попыток проверки относительно динамики концентрации белка, вместо этого сосредотачиваясь на качественных характеристиках (например,грамм. тип паттерна, бифуркации и переходы от стохастической к детерминированной динамике) и макроскопическая количественная оценка (например, период колебаний, длина волны и скорость волны) [32, 12, 4, 37]. Мы сформулировали новую биохимически новую модель и использовали выбор модели, воспользовавшись недавними высококачественными количественными данными о динамике [28, 49], чтобы сравнить ее с другими недавними моделями. Наша модель показала себя значительно лучше, чем другие, обеспечивая отличную посадку. Это также согласуется с другими недавними биохимическими наблюдениями, проливает свет на функциональные роли доменов MinE и обеспечивает понимание факторов, которые контролируют лежащую в основе динамику формирования паттернов Min-систем, как обсуждается ниже.

Свободно управляемое динамическое формирование паттернов с переключением стабильности, управляемое MinD

На протяжении всего нижеприведенного описания наши утверждения основаны на комбинации сравнений моделей, динамики значений состояния в AABSM, показанной на рис. 4, и удаленные-реакции приведены в таблице 2.

Биохимия AABSM имеет мембранную стабильность трех форм связи MinD-мембрана в его ядре. Наименее стабильной к мембране формой является комплекс MinD-MinE ( de ).Наиболее стабильным является комплекс MinD-MinE-MinD ( ded ). Промежуточным звеном к этим двум является димер MinD сам по себе ( d ).

Динамика модели начинается с волны прикрепления димера MinD к мембране ([см. Реакции в таблице 2], зеленый ход вверх [см. Цветные кривые на рис. 4a]). Это предшествует и совпадает с рекрутированием MinE и образованием комплекса de ( d + E → de , первый небольшой подъем вверх, отмеченный красным). В то время как концентрация димера MinD высока, комплексы de быстро секвестрируются в стабильный комплекс ded ( d + de → ded , падение красного цвета сопровождается подъемом вверх и последующим плато синим).Это плато комплекса ded очень похоже на короткоживущее квазистабильное состояние, наблюдаемое во многих возбудимых средах. В течение этого квазистабильного периода поток комплекса ded в состояние de , что важно на более поздних этапах цикла, подавляется первоначальной секвестрацией MinE в состоянии ded ( 2d + e → d + de → ded ). Эта усиленная MinE стабильность проиллюстрирована на верхней панели рис. 5.

Рисунок 5:

Цикл мембранных белков Min можно разделить на две фазы.На первом этапе (усиленная стабильность) MinD присоединяется в большем количестве, чем MinE, и все формы MinE переводятся в мембраностойкую форму ded (синяя стрелка на верхней панели). Стабильность усиливается результирующим истощением и , предотвращая дестабилизирующую обратную связь, которая происходит во второй фазе (нестабильность с положительной обратной связью). На второй фазе насыщение мембраны предотвращает дальнейшее прикрепление MinD, позволяя рекрутированию MinE наверстать упущенное. Две формы положительной обратной связи ускоряют удаление MinD — e разбивает мембранно-стабильный ded на два мембранно-нестабильных de , которые впоследствии оставляют больше e на мембране по мере удаления MinD (синяя стрелка на рисунке). нижняя панель), и e привлекает дополнительный MinE из основной массы для связывания с d , образуя de (пунктирная линия), который, опять же, после этого осаждает больше e на мембране по мере диссоциации MinD.На обеих панелях состояние, определяющее поведение фазы, выделено синей аурой, а относительная концентрация d , которая определяет общую стабильность, показана размером.

Следующий важный переход происходит, когда рекрутирование нового d предотвращается за счет мембранного насыщения и рекрутирование MinE догоняет. Это изменение в общем соотношении MinD-to-MinE балансирует от секвестрации ( d + de → ded ) до удаления MinD ( ded → d + de → d + D + e ), оставляя часть димера MinE. позади.Дополнительный e из этапа удаления ускоряет ранее подавленное удаление секвестра ( ded + e → de + de ) до наводнения (обрывистое падение синего цвета в виде красных шипов). Это в сочетании с реакцией переводит мембрано-стабильные состояния MinD в состояние de с последующим удалением MinD. Поток комплексов de возможен только тогда, когда поступление димера MinD низкое, а гидролиз обеспечивает поступление связанного с мембраной MinE. Таким образом, соотношение MinD-to-MinE действует как контрольный параметр, который определяет, является ли мембраностойкий комплекс ded или мембранно-нестабильный комплекс de доминирующей формой MinD.Эта положительная обратная связь MinE, дестабилизирующая MinD, проиллюстрирована на нижней панели рис. 5.

В отличие от предыдущих моделей, здесь мы углубились в неизвестную динамику экспериментально скрытых состояний и использовали выбор модели для определения наиболее вероятного развития событий. через эти состояния. Идея о том, что MinD переходит в метастабильное состояние ( ded ), усиленное ингибированием обратной реакции (секвестирование) с последующей дестабилизацией при положительной обратной связи, является уточнением простой парадигмы «D присоединяет, E удаляет», которая делает сильные опровергнутые прогнозы о лежащей в основе биохимии.

Биохимические наблюдения, подтверждающие AABSM над SAM

Доказательства, подтверждающие предположения о стабильности мембран AABSM, получены из нескольких источников. Давно известно, что MinE может индуцировать гидролиз АТФ димером MinD [18]. AABSM придерживается традиционной интерпретации моделирования, согласно которой именно комплекс MinD-MinE ( de ) отвечает за индукцию гидролиза, учитывая, что единственный димер MinE, связанный с димером MinD, способен индуцировать гидролиз в обеих субъединицах димер MinD [35].Это последнее наблюдение противоречит предположениям о стабильности мембраны SAM, которая имеет комплекс de как стабильный на мембране.

Предположение о пониженном гидролизе в комплексе MinD-MinE-MinD ( ded ) является более умозрительным, но, тем не менее, подтверждается экспериментами. Vecchiarelli et al. показал, что скорость MinD ATPase как функция концентрации MinE является сигмоидальной и что делеция домена димеризации MinE устраняет сигмоидальный характер кривой [49].Сигмоидальная зависимость MinE согласуется как с SAM, так и с AABSM. Утрата этой сигмоидальной зависимости с делецией — это то, что предсказывает AABSM, но SAM потребует некоторых дополнительных предположений о роли второй субъединицы MinE, чтобы соответствовать потере.

В SAM и AABSM высокая концентрация MinE под действием массы оставила бы незначительный MinD на мембране в форме несвязанного димера, d , и подтолкнула бы все MinD к соответствующему мембранно-нестабильному состоянию модели, ede для SAM или de для AABSM.Помимо образования комплексов с MinD на мембране, некоторое количество MinE может также присутствовать в состоянии и в обеих моделях. Таким образом, высокая концентрация MinE должна привести к тому, что отношение MinD к MinE на мембране будет не более 1/2 для SAM и не более 1 для AABSM. В анализе Min-системы с использованием негидролизуемого аналога АТФ именно это соотношение MinD-to-MinE на бицеллах оказалось равным 1 [24], что больше соответствует предсказанию AABSM, чем SAM.

MinE-связывание с мембраной и димеризация

Наши результаты проливают свет на критическую, но неизвестную роль связывания MinE-мембраны.Одна интерпретация состоит в том, что связывание MinE с мембраной позволяет MinE оставаться на мембране более устойчиво, позволяя димеру MinE стимулировать активность АТФазы во множестве димеров MinD перед диссоциацией с мембраны [36, 35]. Наша поддерживаемая модель и подходы с удаленными реакциями предполагают дополнительные роли через связанное с мембраной состояние MinE ( e ) в реакциях и e + ded → 2de . На поддерживаемом липидном бислое in vitro , MinE-мембранно-дефицитный мутант MinE C1 [17] вместе с MinD образовывал стационарную структуру в отличие от бегущей волны, наблюдаемой с MinE дикого типа [31].Бегущие и стационарные волны похожи, за исключением того, что профиль MinE C1 закруглен по сравнению с острым пиком в MinE дикого типа [31]. Основываясь на наших выводах, отсутствие резкого пика в профиле MinE C1 может быть следствием неспособности MinE C1 рекрутировать объемный MinE C1 для связывания с мембраносвязанным MinD (первая реакция, приведенная выше) и образованием стабильного, стационарная структура MinD / MinE C1 на поддерживаемом липидном бислое может быть следствием отсутствия дестабилизирующей второй реакции, которая была бы отключена мутантом MinE C1.

Димеризация MinE необходима для формирования паттерна как in vivo [40], так и in vitro [49], но роль димеризации MinE, насколько нам известно, не постулируется. В нашей поддерживаемой модели димеризация MinE имеет решающее значение для секвестрации MinD в стабильном состоянии ded . Без него (напряженный) димер MinE в центре комплекса не смог бы соединить два димера MinD. Учитывая, что состояние ded лежит в основе нашей поддерживаемой модели, его удаление путем устранения димеризации MinE, по-видимому, нарушит формирование паттерна как in vivo , так и in vitro , хотя подробности того, как именно это будет нарушено, не ясно.Более конкретно, нокаут состояния ded обеспечивает объяснение наблюдаемой потери стабилизации MinD в экспериментах по диссоциации MinD, когда мутант MinE с дефицитом димеризации заменяется на MinE дикого типа (сначала сравните [49] рис. 6B и третьи панели).

Рисунок 6:

Подробные сведения о реакциях для четырех моделей. MinD представлен зеленым кружком, MinE — красным квадратом, а поддерживаемая мембрана — черной линией. Стрелка реакции, помеченная знаком «+ x», указывает на то, что реакции способствует плотность белка (или белкового комплекса) x.Чтобы указать, что стрелка также включает неусиленную базальную скорость, мы аннотируем Ø .

MinE-связывание с мембраной и димеризация являются неотъемлемой частью противоположных процессов в нашей поддерживаемой модели, первая из которых требуется для дестабилизации MinD, а вторая — для его стабилизации. Таким образом, с помощью количественной подгонки модели временного ряда мы выяснили критические и дополнительные роли доменов связывания с мембраной и димеризации MinE.

Выбор модели и резервные параметры

AABSM имеет больше параметров, чем другие недавно предложенные модели (например,грамм. [4, 37]), поэтому их улучшение не вызывает удивления. Фактически, как продемонстрировало исследование удаленной реакции, некоторые параметры явно избыточны. Тем не менее мы включили их, чтобы можно было провести анализ, который подчеркивает, какие реакции являются наиболее важными, и использовали оценку AIC для учета этого преимущества в сложности. Отметим, что SAM имеет даже больше параметров, чем AABSM, но также не соответствует данным, измеренным значением χ ² . Это говорит нам о том, что AABSM является улучшением не только по сравнению с более ранними моделями благодаря дополнительным параметрам, но и потому, что некоторые из этих параметров представляют реакции, которые лучше отражают лежащую в основе биохимию.

Изменяющиеся экспериментальные условия вносят неопределенность в моделирование

Эксперименты по осцилляционным данным и данным MinD-диссоциации проводились с различными составами мембран и расходами буфера. Мы ожидали, что значения параметров будут несколько отличаться между двумя наборами данных, поэтому мы оценили параметры для каждого эксперимента независимо. Как показано на рис. S9, когда вместо этого мы подбираем два набора данных одновременно, ограничивая параметры, используемые для каждого эксперимента, примерно на порядок величины друг от друга, мы обнаруживаем, что AABSM все еще может соответствовать обоим наборам временного графика. данные почти так же хорошо.Значения параметров этого подхода показаны в Таблице S7.

В исследовании удаленных реакций мы обнаружили, что удаление некоторых параметров не оказало значительного влияния на качество подгонки после повторной оптимизации остальных параметров. Во всех таких случаях, когда показатель AIC упал для одного из наборов данных, он повысился для другого, что указывает на то, что подгонка AABSM имеет некоторые степени свободы, которые могут быть устранены, если оба набора данных подходят одновременно с одинаковыми значениями параметров для два эксперимента.Вместо того, чтобы навязывать одинаковые параметры в обоих экспериментах, что, вероятно, было бы неверно с учетом изменчивости экспериментальных условий, мы указываем, что на рис. S9 показаны соответствия для континуума все более ослабленных ограничений. В конечном счете, упрощение AABSM выходит за рамки того, что мы можем сделать с имеющимися у нас данными о времени, и потребует включения большего количества экспериментальных данных и дополнительных теоретических соображений.

Вариабельность оптимальных значений параметров как в зависимости от соответствия модели AABSM и ее упрощений с удаленной реакцией, так и по наборам данных служит предупреждением о биологической точности наших значений параметров.Это в сочетании со степенями свободы в подгонке AABSM затрудняло осмысленную проверку некоторых из описанных выше гипотез посредством моделирования, включая роль связывания с мембраной и димеризации.

Методы

Данные

Для соответствия моделям мы используем данные in vitro , любезно предоставленные Ивановым и Мидзуучи [28] (данные о колебаниях) и Веккьярелли и др. [49] (данные о диссоциации МинД). Геометрия, пространственный масштаб и более детерминированное поведение анализов in vitro позволяют улучшить возможности анализа по сравнению с данными in vivo .Благодаря этим преимуществам в сочетании с постоянным буферным потоком в экспериментах и ​​пространственной почти однородностью данных, проблема подбора данных была уменьшена с одной подгонки каждой из моделей PDE до одной подгонки соответствующих ODE, каждая с тремя меньшее количество состояний (исключение динамических переменных для концентраций объемных мономеров MinD, объемных димеров MinD и объемных димеров MinE). Другими словами, мы сосредоточились на подборе кинетики реакции без сложностей пространственной динамики и переменных объемных состояний.

Требовалась некоторая предварительная обработка данных Иванова и Мидзуучи. Интенсивности флуоресценции флуоресцентно меченых MinD и MinE не были пространственно выровнены, поэтому мы использовали кросс-корреляцию для выравнивания изображений, воспользовавшись преимуществами структур сходной формы в двух сигналах. Чтобы удалить фоновый шум из выровненных данных, мы использовали изображения до того, как какой-либо белок достиг области визуализации проточной кюветы, чтобы вычислить среднюю интенсивность шума в пространстве и времени и вычли ее из всех последующих изображений.Затем мы сгладили смещенные выровненные данные, чтобы скорректировать виньетирование при освещении, умножив на обратную величину оптимально выбранного гуасиана, которую мы нормализовали, чтобы получить максимальное значение 1. Коэффициент преобразования интенсивности флуоресценции MinE в плотность MinE экспериментально не определялся. Использование сглаженных интенсивностей флуоресценции MinD и MinE до того, как значительное количество любого из белков свяжется с поддерживаемым липидным бислоем (с небольшой поправкой на небольшое, но увеличивающееся количество связанного MinD), известные буферные концентрации MinD и MinE и глубина затухающего волн в микроскопии TIRF, мы рассчитали преобразования из сглаженных интенсивностей флуоресценции MinD и MinE в плотности молекул MinD и MinE.Мы обнаружили, что преобразование для MinD довольно хорошо согласуется с оценкой Иванова и Мидзуучи.

Чтобы извлечь временной ряд из данных Иванова и Мидзуучи, который наилучшим образом представляет только кинетику реакции, мы искали область на изображениях, которая была как можно более близкой к пространственно однородной, избегая, например, областей и временных интервалов с фронтами бегущей волны. движется через них. Для этого мы провели поиск по всем дискам размером 1000 пикселей в предварительно обработанных данных для диска с наименьшими пространственными вариациями плотностей MinD и MinE в течение одного периода колебаний.Чтобы уменьшить межпиксельный шум при измерении этой пространственной вариации, мы сгладили предварительно обработанные данные, используя значения из локальных радиально-симметричных двумерных линейных регрессий по дискам из 100 пикселей. В конечном итоге для подгонки модели мы использовали средние значения несглаженных плотностей MinD и MinE в каждый момент времени в пределах выбранного диска в качестве временного ряда для подгонки модели. Результирующие данные о колебаниях показаны на верхней панели фиг. S1 и в нормализованной форме на верхних панелях фиг. 2 и 3 (пунктирные).SEM были опущены, потому что они были неотличимы от изображения на глаз.

Vecchiarelli et al. Данные состояли из временных рядов MinD и MinE, нормализованных по концентрации MinD в начале диссоциации, и необработанных данных временных рядов MinD. Чтобы откалибровать данные временных рядов, мы сначала выровняли нормализованные данные MinD и необработанные данные MinD с помощью наиболее подходящих аффинных преобразований. После согласования масштабирование в каждом из наиболее подходящих аффинных преобразований обеспечивало преобразование нормализованных единиц в произвольные единицы (AU), используемые в экспериментах.Мы откалибровали нормализованные данные временных рядов MinD и MinE для подгонки модели, используя преобразование из AU в димеры / мкм ² , сообщенное Vecchiarelli et al. . Полученные данные о диссоциации MinD показаны на нижней панели фиг. S1 и в нормализованной форме на нижних панелях фиг. 2 и 3 (пунктирные). Отметим, что в отличие от данных о колебаниях, которые мы откалибровали непосредственно по данным ранее в том же эксперименте, Vecchiarelli et al. откалибровал данные о диссоциации MinD с использованием данных из другого собственного эксперимента с аналогичной установкой, поэтому данные о диссоциации MinD могут содержать больше ошибок калибровки, чем данные о колебаниях.

Модели

Реакции, включенные в каждую из моделей, показаны на рис. 6. Ниже мы описываем модификации, внесенные в модель Бонни [4], а также отношения между каждой из протестированных моделей.

Для согласованности с экспериментальными условиями буферного потока, мы зафиксировали объемные концентрации MinD и MinE (см. Вспомогательные информационные методы из [28] для обоснования). Исходная модель Бонни не имеет спонтанной диссоциации MinD, которая имеет решающее значение для согласования данных о диссоциации MinD Веккьярелли при отсутствии MinE, поэтому мы включили реакцию d → D в модель асимметричной активации.Форма термина, который мы использовали для этой реакции (не массового действия), описана и обоснована в дополнительном материале.

Поскольку SAM и AABSM являются более сложными моделями, чем AAM, стремясь объяснить более свежие экспериментальные результаты, которые AAM не может учесть, мы также включили CAAM в наш процесс выбора модели. CAAM по существу включает в себя пересечение всех терминов реакции, обнаруженных в SAM и AABSM, что дает больше возможностей для учета некоторых из этих недавних наблюдений (см. Дополнительные материалы для более подробного обсуждения).Эта дополнительная область не позволяет учитывать двойную роль MinE, поэтому мы протестировали SAM и AABSM.

Мы включили широкий спектр возможных реакций в SAM и AABSM. Мы добавили все обратные реакции, за исключением тех, где димеры MinE спонтанно диссоциируют из комплексов с димерами MinD на мембране и возвращаются в массу (мы также добавляли их в CAAM). Исключенные обратные реакции были опущены, поскольку время пребывания димеров MinE составляет по крайней мере 1.В 3 раза больше времени пребывания димеров MinD во всех частях бегущих волн Min-белка на поддерживаемом липидном бислое in vitro [31]. Мы также исключили реакции, в которых димеры MinD в комплексах de возвращаются в основной объем в SAM и где димеры MinD в комплексах ded возвращаются в объем в AABSM, чтобы обеспечить стабильность в мембранно-стабильных состояниях MinD. Как показано в таблице S1, в том числе реакции диссоциации MinD-мембраны для мембранно-стабильных состояний MinD в SAM и AABSM не меняют наши результаты выбора модели.

Подгонка параметров

Чтобы найти оптимальные численные решения подгонки данных для наших моделей, мы подгоняем их к данным колебаний и данным диссоциации MinD, используя метод гомотопической минимизации для оценки параметров в дифференциальных уравнениях [6]. Помимо оптимизации с ограничениями, показанной в Таблице S7, мы независимо подгоняли модели к двум наборам данных о динамике. Подробности подгонки данных описаны в дополнительном материале.

Данные о колебаниях, данные о диссоциации и сценарии Matlab, моделирующие AABSM в обоих контекстах с оптимальными параметрами, доступны по адресу https: // github.com / ecytryn / Мин-биохимия.

Дополнительный материал

S1 ODE Models

S1.1 Обозначение модели

• c _d — концентрация мембраносвязанных димеров MinD.

• c _de — концентрация гетеротетрамерных комплексов MinD-MinE на мембране.

• c _ede — концентрация гетро-гексамерных комплексов MinE-MinD-MinE на мембране.

• c _ded — концентрация гетерогексамерных комплексов MinD-MinE-MinD на мембране.

• c _e — концентрация мембраносвязанных димеров MinE.

• c _D — постоянная концентрация объемных димеров MinD.

• c _E — постоянная концентрация объемных димеров MinE.

• ω _{u, v → x, y} обозначает скорость реакции c _u и c _v с преобразованием в89 c90 и c _y для u, v, x, y ∈ { Ø, D, E, d, de, ede, ede, e }.

• обозначает скорость реакции c _u и c _v конвертируется в c _x и c 95 y с облегчением _z для u, v, x, y, z ∈ { Ø, D, E, d, de, ede, ede, e }.

• c _max — концентрация насыщения димеров MinD на мембране.

• c _s — константа полумаксимальной концентрации в уравнении Хилла, моделирующем скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны.

• n _s — коэффициент Хилла в уравнении Хилла, моделирующем скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны.

• — постоянная концентрация димеров MinD, которые постоянно связаны с мембраной.Это объясняет эффект димеров MinD, которые остаются постоянно связанными с мембраной, как наблюдали в экспериментах [S28], на спонтанную диссоциацию MinD-мембраны.

• C _d — это постоянная концентрация мономеров MinD, которая не учитывается в моделях ODE, плоская плотность постоянных объемных мономеров MinD, освещенных в пределах глубины волны затухания в микроскопии TIRF и концентрация мономеров MinD, которые прочно связаны с мембраной.

• C _e — постоянная концентрация мономеров MinE, не учитываемая в моделях ODE, плоская плотность постоянных объемных мономеров MinE, освещенных в пределах глубины волны затухания в микроскопии TIRF и концентрация мономеров MinE, которые прочно связаны с мембраной.

S1.2 Моделирование спонтанной диссоциации MinD от мембраны

Без включения спонтанной диссоциации MinD от мембраны в модели подгонка данных о диссоциации MinD с отсутствием MinE была бы бессмысленной.Поскольку время нахождения MinD на поддерживаемом липидном бислое увеличивается с 11 с до не менее 40,71 с при увеличении концентрации MinD с 0,275 мкМ М до 1,1 мкМ М в отсутствие MinE [S31] и механизма, лежащего в основе эта зависящая от концентрации стабилизация неизвестна, мы феноменологически смоделировали скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны с помощью функции обратного холма, где ω _{d → D} — максимальное значение скорости отклонения, c _с — концентрация димера MinD на мембране при половинном максимальном значении скорости отклонения, c _{все d} — концентрация всех димеров MinD (во всех комплексах) на мембране (см. Формы для конкретных моделей в моделях дифференциальных уравнений ниже), c _d — концентрация (MinE -свободных) мембраносвязанных димеров MinD, а n _s — коэффициент Хилла.За исключением этой реакции, d → D , все реакции во всех моделях подчиняются закону действия масс.

S1.4 Модель комплексной асимметричной активации (CAAM)

AAM предполагает, что связанные с мембраной димеры MinD, но не связанные с мембраной тетрамеры MinD-MinE, привлекают объемные димеры MinD для связывания с мембраной. Однако при всплесках MinD и MinE на поддерживаемом липидном бислое in vitro увеличение концентрации буфера MinE увеличивает как максимальную чистую скорость прикрепления к мембране MinD, так и пиковую плотность мембраны MinD [S49].Поскольку предполагаемое увеличение связывания MinE с MinD на мембране, по-видимому, не подавляет способность MinD рекрутировать объемный MinD для связывания с мембраной, мы позволяем связанным с мембраной тетрамеру MinD-MinE привлекать объемные димеры MinD для связывания с мембраной в мембране. CAAM. Мы не знаем ни одной модели, которая включала бы связанный с мембраной MinE, способствующий рекрутированию массы MinE для связывания с MinD-свободным от MinD на мембране. Без этого увеличение чистой скорости присоединения MinE к мембране примерно с 5 до 20 секунд в данных о диссоциации MinD было бы маловероятно, поскольку плотность MinD без MinE на мембране, объемном субстрате MinE, по-видимому, снижается за это время. период.Таким образом, мы позволяем мембраносвязанным тетрамерам MinD-MinE и мембраносвязанным димерам MinE рекрутировать объемные димеры MinE для связывания с мембраносвязанными димерами MinD и в CAAM. Кроме того, мы допускаем возможность некоторых обратных реакций в CAAM, как описано в Методах. Включая вышеупомянутые реакции в AAM, мы определяем CAAM так, что

Как и AAM, его плотность мономера MinD = 2 ( c _d + c _de ) + C _d , а его плотность мономера MinE = 2 ( c _de + c _e ) + C _e .Для подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере мы установили x ∈ { Ø, d, de }. Для подгонки к данным диссоциации MinD при отсутствии MinE, как и в случае с AAM, мы установили c _de = 0, c _e = 0 и все нетривиальные параметры скорости, кроме ω _{d → D} равно 0. Заметим, что в него встроен мультипликативный коэффициент c _D для z ∈ { Ø, d, de } и мультипликативный коэффициент c _E встроенный в него для z ∈ { Ø, d, de }.

S1.5 Симметричная модель активации (SAM)

Мы определяем SAM таким образом, что

Его минимальная плотность мономера = 2 ( c _d + c _de + c _ede ) + C Min _{95 d плотность = 2 ( c de + 2 c ede + c e ) + C e .Для подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере мы установили x ∈ { Ø, d, de, ede }. Для подгонки к данным MinD диссоциации при отсутствии MinE мы установили c de , c ede = 0, c e = 0 и все нетривиальные параметры скорости, кроме ω d → D равно 0. Заметим, что в него встроен мультипликативный коэффициент c D для z ∈ { Ø, d, de, ede } и и имеют встроенный в них мультипликативный коэффициент c E для z ∈ { Ø, de, ede, e }.}

S1.6 Асимметричная активация с мостовой моделью стабильности (AABSM)

Мы определяем AABSM так, что

Его MinD плотность мономера = 2 ( c _d + c _de + 2 c _ded ) + C Min

6

90 d,90 d плотность мономера = 2 ( c _de + c _ded + c _e ) + C _e .Для подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере мы установили x ∈ { Ø, d, de, ded }. Для подгонки к данным диссоциации MinD при отсутствии MinE мы устанавливаем c _de = 0, c _ded = 0, c _e = 0, и все нетривиальные скорости параметров, кроме ω _{d → D} , равного 0. Отметим, что в него встроен мультипликативный коэффициент c _D для z ∈ { Ø, d, de, ded } и имеют встроенный в них мультипликативный коэффициент c _E для z ∈ { Ø, de, ded, e }.

S1.7 Модель ФитцХью Нагумо (FHNM)

Эта FHNM представляет собой упрощенную модель возбуждения нейронов, а не систему Мин, которую мы используем для проверки того, насколько хорошо произвольная модель может описывать данные о динамике времени. Параметры в модели: a, b, c, d, I, v _l и v _u . Модель FHNM определяется так, что

Мы определяем его плотность мономера MinD как v + w + C _d , а плотность мономера MinE как w + C _e .Для подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере мы включаем все состояния и все параметры в модель. Для подгонки к данным диссоциации MinD при отсутствии MinE мы устанавливаем w = 0.

S2 Реализация метода гомотопической минимизации для подгонки данных

Мы используем метод гомотопической минимизации для оценки параметров в дифференциальных уравнениях [S6] чтобы подогнать наши модели к данным динамики времени. В этом разделе мы сначала определяем нашу статистическую модель для использования в методе, а затем описываем детали реализации метода для AAM, CAAM, SAM и AABSM.Мы опускаем детали FHNM для краткости, но отметим, что они похожи по своей природе на те, которые обсуждались.

S2.1 Статистическая модель

Для j ^th (из n _y ) значение данных d _jk измерено в момент времени t _{90 k для 9000 k ∈ {1, 2 …, n t ( j )}, соответствующее наблюдаемое модельное значение y jk и ошибка ε jk ,}

В качестве примеров, только для данных колебаний и AAM, n _y = 2, d _{1 k} — измеренная плотность мономеров MinD в момент времени t _k , d _{2 k} — плотность мономеров MinE в момент времени t _k , y _{1 k} = 2 ( c _{90 d + 90 d + c de ) + C d на момент времени t k и y 2 k = 2 ( c90 de c e ) + C e одновременно t k .Ошибки, ε jk , состоят из ошибок моделирования и ошибок данных. Мы обнаружили, что стандартные ошибки среднего (SEM) в данных о колебаниях находятся в диапазоне примерно от 5 мкм ⁻² до 30 мкм ⁻² , в то время как данные колеблются в масштабе 5 · 10 ³ мкм ⁻² . Мы не извлекали данные о диссоциации MinD из необработанных данных, поэтому мы не знаем его SEM, но мы предполагаем, что они также малы по сравнению с диапазонами данных.Таким образом, мы ожидаем, что ошибки моделирования будут значительно больше, чем ошибки данных, и, следовательно, ожидаем, что ошибки, ε jk , будут в основном состоять из ошибок моделирования. Ошибки моделирования по своей природе не являются независимыми или одинаково распределенными, но без лучшего априорного распределения мы предполагаем, что ε jk являются независимыми и одинаково распределенными от нормального распределения со средним значением 0, для j = 1 , …, n y и k = 1, 2…, n t ( j ). Диапазоны плотности белка меняются в зависимости от наших данных с течением времени. Таким образом, чтобы устранить смещение при подгонке из-за различий в масштабе, мы предполагаем, что ε jk пропорциональны диапазону d jk для k = 1, 2 …, n t ( j ), для j = 1, …, n y и k = 1, 2…, n t ( j ). Поэтому в совокупности мы предполагаем, что где независимы и одинаково распределены из нормального распределения со средним значением 0 и дисперсией, для j = 1, …, n y и k = 1, 2 .. ., n т ( j ). Таким образом, вероятность y jk при d jk и при j = 1,…, n y и k = 1, 2 …, n t ( j ) определяется выражением для постоянного. Значения y jk для j = 1, …, n y и k = 1, 2 …, n t ( j ), которые максимизируют вероятность, — это те, которые минимизируют}

Таким образом, мы измеряем разницу в наблюдаемых модельных значениях из данных динамики времени как сумму взвешенных квадратов остатков в уравнении S10.

S2.2 Определение функционалов,

r _y (p, x) и r _{Δ x} (p, x), для метода гомотопической минимизации

Как описано выше, мы измерить разницу в наблюдаемых модельных значениях из данных динамики времени с помощью суммы взвешенных квадратов остатков в уравнении S10. Таким образом, мы определяем r _y ( p , x ), меру подгонки данных, как определено в [S6], так что где мы нормализуем на, чтобы соответствовать масштабу r _y ( p , x ) в уравнении 2.6 из [S6]. Мы не штрафуем отклонения от интерполированных данных в нашей подгонке, поэтому мы определяем, как описано в разделе 2.6 [S6].

Для согласования с обозначениями в [S6] мы определяем x ₁ = c _d , x ₂ = c _de

006

и ₃ = c _e ( n _x = 3) для AAM и CAAM; x ₁ = c _d , x ₂ = c _de , x ₃ = c96 _{x 4} = c _e ( n _x = 4) для SAM; и x ₁ = c _d , x ₂ = c _de , x ₃ =85 c 906 x ₄ = c _e ( n _x = 4) для AABSM.Мы определяем r _{Δ x} ( p , x ), меру удовлетворения численного решения модели дифференциального уравнения, как определено в [S6], как в уравнении 2.13a из [S6] и дискретизировать модели с использованием метода Симпсона конечной разности, конечной разности с точностью до четвертого порядка. Таким образом, в r _{Δ x} ( p , x ), где k ₊ — индекс выше k in (набор индексов числовой дискретизации), k _— — индекс ниже k in, Δt — шаг сетки в {, b ₀ = 4/6, b ₁ = 1/6, и является правой частью ODE для x _i , для i = 1 ,…, n _x . Для штрафов за сглаживание в r _{Δ x} ( p , x ), s _i ( x ), как определено в [S6], мы установили α _i = 1, β _i = 10 ² и γ _i = 2, для i = 1, …, n _x , как реализовано в [S6], чтобы незначительно изменить r _{Δ x} ( p , x ) с помощью сглаженного набора значений состояния и сильно наложить штраф на r _{Δ x} ( p , x ) с неровным набором значений состояния.

S2.3 Ограничения домена на состояния и параметры

Мы ограничиваем параметры и значения состояний в моделях, чтобы они соответствовали биологическим допущениям и определенным экспериментальным измерениям. Параметры скорости для u, v, x, y, z ∈ { Ø, D, E, d, de, ede, ded, e } являются биологически значимыми, только если они неотрицательны, и мы предполагаем, что реакции не являются слишком быстро, с параметрами скорости более 10 единиц. Таким образом, мы ограничиваем параметры скорости так, чтобы где u _p — единицы измерения параметра p .Кроме того, для SAM и AABSM, включая реакции диссоциации MinD-мембраны в мембранно-стабильных состояниях MinD, как описано в таблице S1, чтобы наложить основное предположение каждой модели, мы ограничиваем скорость диссоциации димера MinD-мембраны не быстрее в мембрано-стабильное состояние MinD, чем мембранно-нестабильное состояние MinD:

Параметр c _max , который имеет отношение только к подгонке данных осцилляций, диктует максимальную концентрацию мембраносвязанных димеров MinD и обязательно составляет не менее половины диапазона плотности мономера MinD с течением времени, .Кроме того, мы предполагаем, что c _max находится в масштабе, поэтому мы ограничили c _max выше на. Таким образом, мы ограничиваем c _max так, чтобы

Мы также предполагаем, что c _с , константа полумаксимальной концентрации в уравнении Хилла, моделирующем скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны, находится в масштабе, поэтому мы ограничили c _с , выше, автор:. Уравнение Хилла, моделирующее скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны, может быть неопределенным, если c _с = 0, поэтому мы ограничиваем c _с ниже 1 мкм ⁻² .Таким образом, мы ограничиваем c _s таким образом, чтобы

Коэффициент Хилла в уравнении Хилла, моделирующем скорость спонтанной диссоциации MinD-мембраны, n _с , обязательно неотрицательный, и мы предполагаем, что он не превышает (биологически очень большое) значение 10, поэтому мы ограничиваем n _s таким образом, чтобы

Постоянная плоская плотность объемных мономеров MinD и постоянная концентрация устойчивых мембраносвязанных мономеров MinD, C _d , обязательно неотрицательны и не превышают минимальную плотность мономера MinD в каждом временном интервале MinD, D _мин , поэтому мы ограничиваем C _d таким образом, чтобы

Аналогичным образом, для данных колебаний, C _e , постоянная плоская плотность объемных мономеров MinE и постоянная концентрация устойчивых мембраносвязанных мономеров MinE обязательно неотрицательны и не превышают минимальный уровень мономера MinE. плотность во времени, E _мин .Плотность MinE составляет 0 мкм ⁻² в начале данных диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, поэтому E _мин не является значимой верхней границей C _e на время курса. Таким образом, мы ограничиваем C _e таким образом, чтобы

Постоянная концентрация устойчивых мембраносвязанных димеров MinD, обязательно неотрицательна и не превышает половины значения C _d , которое включает в себя концентрацию в нем устойчивых мембраносвязанных мономеров MinD, поэтому мы ограничить так, чтобы

Концентрации c _d , c _de , c _ede , c _{ded000 e 9190 только 9 и биологически значимый, если неотрицательный.Таким образом, мы ограничиваем c d , c de , c ede , c ded и89 c} и89 c неотрицательные значения: где c _{d, k} , c _{de, k} , c _{ede, k} , c _{ded, k 90 c190 9, и 90 c190 9, и e, k} — это значения c _d , c _de , c _ede , c _{90ED 90 и e при k ^th индекс числовой дискретизации.}

Все вышеупомянутые ограничения на параметры и значения состояния могут быть записаны в виде набора линейных неравенств. Таким образом, во время ускоренного спуска, реализованного в спуске по перекрывающимся нишам метода гомотопической минимизации, мы используем проекцию с использованием метода Дикстры, как описано в разделе C.2.3 [S6]. При этом мы выбираем небольшой относительный допуск прекращения, ε _c = 10 ⁻⁶ , и меньший абсолютный допуск прекращения,.Чтобы избежать чрезмерного замедления ускоренного спуска из-за большого количества выступов, мы преждевременно прекращаем ускоренный спуск, если количество итераций в методе Дикстры превышает 10 ⁴ .

S2.4 Генерация случайных параметров и значений состояний

Следуя процедуре спуска перекрывающейся ниши в методе гомотопической минимизации, как описано в разделе C.1 [S6], мы случайным образом генерируем параметры и значения состояний изначально и в случайное потомство. При отсутствии предварительных оценок значений параметров мы случайным образом генерируем параметры скорости в широком диапазоне масштабов в соответствии с их границами, уравнение S13: где U (a, b) — равномерное распределение вероятностей на интервале ( a, b ), а u _p — единицы параметра p .

Мы ожидаем, что c _max , которое подходит только для подгонки данных осцилляций, будет в пределах одного или двух порядков величины половины диапазона плотности мономера MinD с течением времени,. Таким образом, в соответствии с границами c _max , уравнением S15, мы случайным образом генерируем c _max , так что

Аналогично, мы ожидаем, что c _s будет в пределах одного или двух порядков величины.Таким образом, в соответствии с границами c _s , уравнением S16, мы случайным образом генерируем c _s , так что

Мы случайным образом генерируем n _s , C _d , C _e и равномерно по их соответствующим границам, Уравнения S17, S18, S19 и S20:

Мы выбираем случайные значения состояний для точного совпадения данных с течением времени.Таким образом, для данных осцилляций и данных о диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, плотность мономера MinD D , плотность мономера MinE E , D ₂ = ( D — C _d ) / 2 и E ₂ = ( E — C _e ) / 2, мы генерируем случайные значения состояния для AAM и CAAM с c _e как свободное состояние, такое что

Аналогичным образом мы генерируем случайные значения состояния для SAM с c _ede и c _e как свободные состояния, так что и мы генерируем случайные значения состояния для AABSM с c _ded и c _e как свободные состояния, так что где U ({·}) — равномерное распределение вероятностей по множеству {·}.Кроме того, для данных диссоциации MinD при отсутствии MinE мы генерируем случайные значения состояний для AAM, CAAM, SAM и AABSM без свободных состояний, так что

S2.5 Случайное возмущение и отбор

Во время генерации полового потомства в пересекающейся нише метода гомотопической минимизации, как описано в разделе C.1 [S6], для каждого полового потомства мы определяем стандарт отклонение возмущения« такое, что где F _c — мера сходимости, определенная ниже, а U (a, b) — равномерное распределение вероятностей в интервале ( a, b ).Затем для параметра p у полового потомства, унаследованного от особи ( p _{g, i, j} , x _{g, i, j} ), возмущаем значение наследуемого параметра « такие, что где Δ r _{g, i, j} — мера сходимости в родительском пространстве j ^th ниши i ^th в поколении g , как определено в уравнении C.1 of [S6], N ( μ, σ ² ) — нормальное распределение со средним значением μ и дисперсией σ ² и p _min и p _max — это ограниченные нижняя и верхняя границы параметра p , как описано в разделе S2.3. В стандартном отклонении возмущения, max {Δ r _{g, i, j} , 10 ⁻² } обеспечивает уменьшающиеся, но значительные возмущения по мере схождения алгоритма, и U (0, 1) допускает широкий диапазон возмущений в. Аналогично, для значения состояния x у полового потомства, унаследованного от особи ( p _{g, i, j} , x _{g, i, j} ), мы возмущаем стоимость наследственного государственное значение« такое, что

Во время отбора при спуске с перекрывающимися нишами, как описано в Разделе C.1 из [S6], мы выбираем естественное значение по умолчанию для силы выбора, q _fit = 1.

S2.6 Остальные детали для реализации метода гомотопической минимизации

Мы выбираем значения λ определить ниши в спуске перекрывающихся ниш метода гомотопической минимизации, как в разделе 3.4.3 [S6]. Мы выбираем родителей и потомство в пересекающихся нишах, как в Разделе E.1.2 [S6]. Для начальных значений масштабирования градиента с _{i, 0} для i в индексированном наборе всех параметров и значений состояния, как описано в разделе C.2.1 [S6], мы выбираем s _{i, 0} = 10 ⁻¹² для всех i , соответствующих параметрам, чтобы гарантировать, что проекции на ограничения, включающие несколько параметров, изначально определены, и мы выбираем s _{i, 0} = 0 для всех i , соответствующих значениям состояния. Выбираем n _max , ε _σ , ε _r , n _max ,, m _pro , 9Δ, и85 r в спуске ниши перекрытия, как в разделе E.1.5 из [S6]. Наконец, мы вычисляем доверительные интервалы для параметров с помощью начальной загрузки, как в Разделе 3.4.4 [S6].

Мы вычислили компоненты генетического алгоритма метода гомотопической минимизации, используя MATLAB , и мы вычислили компоненты ускоренного спуска метода гомотопической минимизации параллельно, используя C ++ на сервере Calcul Québec Guillimin, серверы Compute Canada Cedar и Graham, и сервер WestGrid Orcinus.

S2.7 Уточнения числовой дискретизации

Первоначально мы подгоняем каждую модель к временным данным, используя сетку данных в качестве сетки численной дискретизации.Для некоторых моделей численное решение, которое лучше всего соответствует данным динамики, будет содержать паразитные колебания. В таких случаях мы уточняли сетку численной дискретизации, увеличивая ρ , отношение количества (равномерно расположенных) точек сетки в числовой дискретизации к количеству точек данных во времени, целыми числами до ложного колебания исчезли. Таким образом, для AAM = 3 для данных о колебаниях и = 2 для данных о диссоциации MinD; для CAAM ρ = 1 для данных осцилляций и ρ = 3 для данных диссоциации MinD; для SAM ρ = 1 для обоих наборов данных динамики времени; для AABSM ρ = 1 для обоих наборов данных динамики времени; и для FHNM ρ = 3 для обоих наборов данных динамики времени.

Данные S3 и соответствие модели не показаны в основном тексте

Рисунок S1:

Данные о колебаниях показаны на (a), а данные о диссоциации MinD показаны на (b).

Рисунок S2:

Для CAAM соответствие данным осцилляций показано на (а), а соответствие данным диссоциации MinD показано на (b). Подгонки сплошные, данные пунктирны.

Рисунок S3:

Для SAM соответствие данным колебаний показано на (а), а соответствие данным диссоциации MinD показано на (b).Подгонки сплошные, данные пунктирны.

Рисунок S4:

Для FHNM аппроксимация данных колебаний показана на (а), а аппроксимация данных диссоциации MinD показана на (b). Подгонки сплошные, данные пунктирны.

Значения состояния S4 из подгонки модели не показаны в основном тексте

Рисунок S5:

Для AAM значения состояния из подгонки к данным колебаний показаны на (a), а значения состояний от подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере показаны на (b).

Рисунок S6:

Для CAAM, значения состояния из подгонки к данным колебаний показаны на (a), а значения состояний от подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере показаны на (b).

Рисунок S7:

Для SAM, значения состояния из подгонки к данным колебаний показаны в (a), а значения состояния из подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере показаны на (b).

Рисунок S8:

Для FHNM, значения состояний из подгонки к данным колебаний показаны на (a), а значения состояний от подгонки к данным диссоциации MinD с MinE в проточном буфере показаны на (b).

S5 Одновременная подгонка обоих наборов данных с ограничениями параметров и включение реакций MinD-мембранной диссоциации мембранно-стабильных состояний MinD в модели

Рисунок S9:

Одновременная подгонка обоих наборов данных с ограничениями параметров. Для каждого параметра p , что нетривиально как в модели данных осцилляций, так и в модели данных диссоциации MinD с MinE в проточном буфере, за исключением параметров постоянной концентрации C _d , C _e , и мы ограничиваем p в соответствии с данными колебаний, чтобы быть меньше или равным γp в соответствии с данными диссоциации MinD, и мы ограничиваем p в соответствии с Данные о минимальной диссоциации должны быть меньше или равны γp в соответствии с данными колебаний, для γ = 1, 2, 4, 8, 16.Результирующие значения χ ² , полученные при подгонке, показаны точками. Значения χ ² из неограниченных оптимизаций, в которых γ = ∞ , показаны плоскими пунктирными линиями. Когда параметры в наборах данных ограничены, чтобы быть в пределах примерно одного порядка величины друг от друга, модели, в первую очередь AABSM, все еще могут повторять оба набора данных почти так же хорошо, как и без ограничений. При подгонке учитываем разницу в буферных концентрациях MinE — 1.36 мкМ для данных осцилляций и 2,5 мкМ для данных диссоциации MinD с MinE в проточном буфере — путем умножения параметров скорости массовых реакций связывания MinE, и для z ∈ { Ø, de, ede, e } в SAM и для z ∈ { Ø, de, ded, e } в AABSM, которые в противном случае имеют коэффициент умножения c _E , встроенный в них, на 1,36 мкМ или 2,5 мкМ . Это исключает мультипликативный коэффициент c _E из параметров скорости массовых реакций связывания MinE и вместо этого включает коэффициент преобразования объемных мономеров MinE в димеры в них, в предположении, что весь объемный MinE стабилен в димере. штат.Оценки параметров для AABSM с γ = 16 показаны в таблице S7.

Таблица S1:

Сравнение моделей с реакциями диссоциации мембран MinD в стабильных состояниях MinD и без них. Звездочка (*) указывает на то, что модель включает в себя реакции MinD-мембранной диссоциации мембранно-стабильного состояния MinD, реакции de → D + E и de → D + e для SAM и реакции ded → D + E + D. , ded → D + E + d, ded → D + de, ded → D + e + D и ded → D + e + d для AABSM. × ² — это взвешенная сумма квадратов остатков, а AIC — это информационный критерий Акаике.- это минимальное значение χ ² среди моделей, а AIC _min — минимальное значение AIC среди моделей. AABSM без включения MinD-мембранных реакций диссоциации мембрано-стабильного состояния MinD соответствует данным осцилляций и данным MinD диссоциации лучше, чем SAM, даже с включением реакций MinD-мембранной диссоциации мембран-стабильного MinD. состояние в SAM. Включение MinD-мембранных реакций диссоциации мембранно-стабильного состояния MinD в AABSM не улучшает его соответствие данным осцилляций и не улучшает его соответствие данным MinD-диссоциации.Мы включаем эту таблицу в качестве обоснования исключения мембранно-стабильных реакций диссоциации MinD от SAM и AABSM, как указано в методах.

S6 Оценка параметров на основе подгонок

Мы предоставляем оценки параметров от наших подгонок моделей к данным динамики времени, приведенным ниже. В них, если параметр пустой, он не был включен в примерку. Все параметры с непустыми и ненулевыми значениями были включены в подсчет параметров оценок AIC. Поскольку данные динамики не очень зашумлены, ошибки аппроксимации состоят в основном из ошибок моделирования, и ошибки моделирования, а не независимые и одинаково распределенные гауссовские ошибки были перераспределены во время вычисления доверительных интервалов с помощью начальной загрузки.Таким образом, показанные доверительные интервалы не очень информативны с биологической точки зрения и часто меньше для моделей, которые лучше соответствуют данным о динамике, но мы все равно предоставляем их для справки.

Таблица S2:

Параметры из подгонки AAM к данным осцилляций и данным диссоциации MinD.

Таблица S3:

Параметры из подгонок СААМ к данным осцилляций и данным диссоциации MinD.

Таблица S4:

Параметры из подгонки SAM к данным осцилляций и данным диссоциации MinD.

Таблица S5:

Параметры из подгонок AABSM к данным осцилляций и данным диссоциации MinD.

Таблица S6:

Параметры из подгонок FHNM к данным колебаний и данным диссоциации MinD.

Таблица S7:

Параметры из одновременной подгонки AABSM к данным колебаний и данным диссоциации MinD с ограничениями параметров. γ = 16 при ограниченной оптимизации. Мы предполагаем, что это наиболее важные с биологической точки зрения оценки параметров, которые у нас есть.См. Подпись к рис. S9 для получения подробной информации о приближении с ограничениями, особенно в отношении изменений в AABSM, включающих параметры скорости, и для z ∈ { Ø, de, ded, e }.

Благодарности

Авторы выражают признательность NSERC за финансовую поддержку в виде гранта ENC. Это исследование было частично обеспечено поддержкой Westgrid (https://www.westgrid.ca/), Calcul Quebec (https://www.calculquebec.ca/en/) и Compute Canada (www.computecanada.ca) . Мы благодарим Киёси Мидзуучи и Энтони Веккиарелли за то, что они поделились флуоресцентными изображениями и другими данными своих экспериментов.

Ссылки

1. [S1].

   Д. Андерсон и К. Бернем. Выбор модели и многомодельный вывод. Второй. Нью-Йорк: Springer-Verlag, 63, 2004.

2. [S2].
3. [S3].
4. [S4].
5. [S5].
6. [S6] .↵
7. [S7].
8. [S8].
9. [S9].
10. [S10].
11. [S11].
12. [S12].
13. [S13].
14. [S14].
15. [S15].
16. [S16].
17. [S17].
18. [S18].
19. [S19].
20. [S20].
21. [S21].
22. [S22].
23. [S23].
24. [S24].
25. [S25].
26. [S26].
27. [S27].
28. [S28] .↵
29. [S29].
30. [S30].
31. [S31] .↵
32. [S32].
33. [S33].
34. [S34].
35. [S35].
36. [S36].
37. [S37].
38. [S38].
39. [S39].
40. [S40].
41. [S41].
42. [S42].
43. [S43].
44. [S44].
45. [S45].
46. [S46].
47. [S47].
48. [S48].
49. [S49] .↵
50. [S50].
51. [S51].
52. [S52].
53. [S53].
54. [S54].
55. [S55].

Восстановление самоорганизующихся белков на поддерживаемых липидных бислоях in vitro

. пример стержневых микроструктур ПДМС.Чтобы получить ценные данные из этих анализов, наиболее важными факторами, которые необходимо контролировать, являются качество белка и мембран.

Для обеспечения качества белка массу белка следует подтверждать с помощью SDS-PAGE и масс-спектрометрии. Кроме того, следует убедиться, что белки растворимы и не агрегированы, с помощью аналитической гель-фильтрации или динамического светорассеяния. Гель-фильтрация может использоваться для удаления любой агрегированной фракции белков. Тщательная корректировка pH и качество добавленных нуклеотидов имеют решающее значение, поскольку добавление неотрегулированных или частично деградированных нуклеотидов к белковым запасам или самоорганизующимся анализам достаточно для устранения активности белка, что устраняет самоорганизацию.

Наряду с качеством белка, качество мембран является наиболее важным, и неправильное образование мембран чаще всего является причиной дефектной самоорганизации и происхождения искусственных поверхностных структур.

При выполнении протокола в первый раз полезно пометить поддерживаемые липидные бислои, включив меченые липиды, такие как Atto-655-DOPE или DiI в низких молярных процентах (0,05%). Таким образом, можно напрямую судить о свойствах и качестве мембраны. Используя FRAP, можно оценить текучесть мембраны.Кроме того, можно напрямую оценить качество отмывки SLB, так как будет либо слишком много пузырьков, либо жидкая мембрана, либо мембрана вообще отсутствует, если она была смыта. Подход с открытой камерой позволяет тщательно промывать мембрану и, следовательно, также удалять пузырьки, которые прилипают к поверхности SLB. Наиболее важными факторами для получения жидких и однородных поддерживаемых липидных бислоев являются очистка и гидрофильность поддерживающей поверхности, а также правильный размер и однородность SU Vs. Может быть полезно проверить размер внедорожника и его распределение с помощью динамического рассеяния света. Для узких распределений по размерам мы рекомендуем экструдировать везикулы, а не обрабатывать их ультразвуком. Другие методы очистки покровных стекол, например, обработка сильными основаниями, основными моющими средствами или использование покровных стекол непосредственно после ополаскивания водой, могут дать хорошие результаты, в зависимости от применения и липидной смеси.

Первая половина протокола, представленного здесь, in vitro реконструкция на плоских поддерживаемых липидных бислоях в открытых камерах, имеет то преимущество, что делает поверхность доступной для оптических микроскопов, таких как микроскопия TIRF ³⁰ , анализ FRAP ⁶ , одночастичное отслеживание ³⁴ , а также методы поверхностного зонда, такие как атомно-силовая микроскопия ²⁶ .Большая однородная область позволяет получать более точные статистические данные при определенных концентрациях. Кроме того, подход с открытой камерой позволяет точно контролировать концентрацию белка и быстрое и простое добавление дополнительных компонентов, что позволяет титровать концентрацию белка в одной камере ²⁰ . Анализ также может быть расширен путем добавления других компонентов бактериальных дивисом, таких как FtsZ ^{22 , 35} , ZipA ²² или химерный белок FtsZ-YFP-MTS ^{10 , 35} .

Другие группы использовали аналогичный подход к воссозданию системы Min in vitro , но использовали проточную кювету вместо открытой камеры ^{17 , 18 , 19} . Проточные кюветы имеют определенные преимущества, в частности, когда требуется полностью замкнутая трехмерная среда. ¹⁸ , влияние потока ^{17 , 19 , 23} или состав мембраны ²³ на образцах MinCDE. исследованы, или если белковые структуры должны наблюдаться в условиях ограничения белка ¹⁹ .Тем не менее, локальный контроль молекулярных концентраций сложнее. Компоненты белка, особенно MinD, прочно связываются с мембраной, с которой они впервые сталкиваются ^{18 , 19} . По нашему опыту, белки часто неспецифически связываются с трубками, входными отверстиями, шприцами и другими микрожидкостными частями. Следовательно, локальные концентрации белка отличаются от входных концентраций ¹⁸ , а также изменяются по длине проточной ячейки, что приводит к множеству различных структур белка на мембране между входом и выходом, как наблюдали другие ¹⁹ .

Вторая половина протокола, представленного здесь, реконструкция in vitro в стержневидных микроструктурах с повторным использованием подхода открытой камеры на узорчатой ​​основе, покрытой липидными бислоями, позволяет просто имитировать поведение белка in vivo , даже если точный контроль над концентрациями белка теряется из-за удаления буфера. Обратите внимание, что, поскольку длина волны MinDE примерно на порядок больше in vitro , чем in vivo , стержневые микрополости также примерно на порядок больше (10 x 30 мкм), чем стержневидные E.coli клеток.

В целом, этот протокол позволяет точно контролировать все условия, включая концентрацию белка, состав буфера и свойства мембраны. Использование трехмерных структурированных опор позволяет изучать реакцию в условиях пространственного ограничения, имитируя поведение in vivo без необходимости в сложном микрофлюидическом оборудовании.

AlphaFold: решение грандиозной проблемы биологии 50-летней давности

Мы также увидели признаки того, что прогнозирование структуры белка может быть полезным в будущих усилиях по реагированию на пандемию, как один из многих инструментов, разработанных научным сообществом.Ранее в этом году мы предсказали несколько белковых структур вируса SARS-CoV-2, включая ORF3a, структура которого ранее была неизвестна. В CASP14 мы предсказали структуру другого белка коронавируса, ORF8. Впечатляюще быстрая работа экспериментаторов подтвердила структуры как ORF3a, так и ORF8. Несмотря на их сложный характер и наличие очень небольшого количества связанных последовательностей, мы достигли высокой степени точности обоих наших прогнозов по сравнению с их экспериментально определенными структурами.

Мы не только ускоряем понимание известных заболеваний, но и рады возможности этих методов исследовать сотни миллионов белков, для которых у нас в настоящее время нет моделей, — обширную территорию с неизвестной биологией. Поскольку ДНК определяет аминокислотные последовательности, которые составляют структуры белков, революция в геномике сделала возможным считывание последовательностей белков из естественного мира в массовом масштабе — с 180 миллионами последовательностей белков и подсчетом в базе данных Universal Protein (UniProt).Напротив, учитывая экспериментальную работу, необходимую для перехода от последовательности к структуре, только около 170 000 белковых структур находятся в банке данных о белках (PDB). Среди неопределенных белков могут быть некоторые с новыми интересными функциями, и — так же, как телескоп помогает нам заглянуть глубже в неизвестную вселенную — такие методы, как AlphaFold, могут помочь нам найти их.

Открывая новые возможности

AlphaFold — одно из наших самых значительных достижений на сегодняшний день, но, как и во всех других научных исследованиях, есть еще много вопросов, на которые нужно ответить.Не всякая структура, которую мы прогнозируем, будет идеальной. Еще многое предстоит узнать, в том числе о том, как несколько белков образуют комплексы, как они взаимодействуют с ДНК, РНК или небольшими молекулами, и как мы можем определить точное местоположение всех боковых цепей аминокислот. В сотрудничестве с другими можно многое узнать о том, как лучше всего использовать эти научные открытия при разработке новых лекарств, о способах управления окружающей средой и многом другом.

Для всех нас, работающих над вычислительными методами и методами машинного обучения в науке, такие системы, как AlphaFold, демонстрируют потрясающий потенциал ИИ как инструмента для фундаментальных открытий.Подобно тому, как 50 лет назад Анфинсен поставил задачу, выходящую за пределы возможностей науки в то время, многие аспекты нашей Вселенной остаются неизвестными. Объявленный сегодня прогресс вселяет в нас уверенность в том, что ИИ станет одним из самых полезных инструментов человечества в расширении границ научных знаний, и мы с нетерпением ждем впереди многих лет упорной работы и открытий!

---

Пока мы не опубликуем статью об этой работе, пожалуйста, цитируйте:

Высокоточное прогнозирование структуры белка с использованием глубокого обучения

Джон Джампер, Ричард Эванс, Александр Прицель, Тим Грин, Майкл Фигурнов, Кэтрин Туньясувунакул, Олаф Роннебергер, Расс Бейтс, Огюстин Жидек, Алекс Бриджленд, Клеменс Мейер, Саймон А.А. Коль, Анна Потапенко, Эндрю Дж. Баллард, Эндрю Ромера, Бернардино -Паредес, Станислав Николов, Ришуб Джейн, Йонас Адлер, Тревор Бэк, Стиг Петерсен, Дэвид Рейман, Мартин Штайнеггер, Михалина Пачольска, Дэвид Сильвер, Ориол Виньялс, Эндрю У. Старший, Корай Кавукчуоглу, Пушмит Кохли, Демис Хассабис.

в Четырнадцатой критической оценке методов прогнозирования структуры белка (тезисы), 30 ноября — 4 декабря 2020 г. Получено отсюда.

Мы находимся в самом начале изучения того, как лучше всего дать возможность другим группам использовать наши предсказания структуры, наряду с подготовкой рецензируемой статьи для публикации. Хотя наша команда не сможет ответить на все запросы, если AlphaFold может иметь отношение к вашей работе, отправьте несколько строк об этом на alphafold @ deepmind.com. Мы свяжемся с вами, если появятся возможности для дальнейшего изучения.

RCSB PDB — 6U6S: ЯМР-структура раствора белка I24N-delta10-ngMinE из Neisseria gonorrheae

Бактериальные MinD и MinE образуют стоячую колебательную волну, которая позиционирует ингибитор деления клеток MinC, связывающий MinD, повсюду на мембране, кроме в середине клетки, обеспечивая позиционирование цитокинетической перегородки в середине клетки. Во время этого процесса MinE подвергается сворачиванию, поскольку он взаимодействует с разными партнерами…

Бактериальные MinD и MinE образуют стоячую колебательную волну, которая позиционирует ингибитор клеточного деления MinC, который связывает MinD, повсюду на мембране, кроме средней точки клетки, обеспечивая позиционирование цитокинетической перегородки в середине клетки. Во время этого процесса MinE подвергается свёртыванию, поскольку он взаимодействует с разными партнерами. Мы исследуем динамику обмена между основным и возбужденным состояниями димера MinE в 3 формах, используя ЯМР релаксационной дисперсии ¹⁵ N: полноразмерный белок (6-нитевой β-лист, расположенный между 4 спиралями), представляющий состояние покоя; N-концевую делецию из 10 остатков (Δ10), имитирующую компетентное состояние связывания с мембраной, где N-концевая спираль отщепляется для взаимодействия с мембраной; и N-концевые делеции 30 (Δ30) или 10 остатков с мутацией I24N (Δ10 / I24N), в которых β1-цепи на границе димера выдавлены и доступны для связывания MinD, оставляя после себя 4-цепочечный β- простыня.Полноразмерный MinE сэмплирует 2 «возбужденных» состояния: первое похоже на полноразмерный / Δ10 гетеродимер; второй, также отобранный по Δ10, либо аналогичен, либо находится на пути к форме 4-нитевого β-листа. И Δ30, и Δ10 / I24N образец 2 возбуждали частицы: первая может включать дестабилизацию β3- и β3′-цепей на границе раздела димеров; изменения во втором случае более обширны, включая дальнейшее нарушение вторичной структуры, возможно, представляя собой совокупность состояний на пути к восстановлению состояния покоя.Количественная информация о конформационной динамике MinE, включающей эти возбужденные состояния, имеет решающее значение для понимания самоорганизации колебательного паттерна с помощью динамики взаимодействия MinD-MinE на мембране.

---

Организационная принадлежность : & nbsp

Лаборатория химической физики, Национальный институт диабета, болезней органов пищеварения и почек, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-0520; mariusc@mail.