10 минут на эллипсоиде: Сколько калорий сжигает эллипс?

Содержание

Сколько калорий сжигает эллипс?

Прежде, чем дать ответ на этот вопрос, эксперты «Мир Спорта» предлагают начать с осмысления того, что же такое калория?

Далеко не каждый человек, пытающийся узнать, сколько калорий сжигает эллиптический тренажёр, как сжечь за одну тренировку больше и какой спортивный агрегат для «уничтожения» калорий лучше приобрести, понимает, о чём вообще идёт речь?

Калория – не что иное, как единица измерения. Что же она измеряет? В первую очередь тепло. Во вторую — энергию, без которой не может жить человек.

Тем, кто одержим желанием максимизировать расход «взятых на борт» калорий на эллипсоиде, важно осознать: для любого процесса жизнедеятельности, в том числе, для интеллектуального труда и даже для пребывания в состоянии абсолютного покоя нам нужны калории.

Откуда они берутся? Не от спортивной нагрузки. Из потребляемой нами еды. Те, кто проводят неоправданно изнурительные тренировки (с чем угодно – орбитреком, велосипедом, вёслами на байдарке или железом в тренажёрке) сталкиваются с неизбежной сонливостью.

Она «кричит» нам о том, что в организме иссяк источник энергии. Расходован чрезмерно большой запас калорий, и нужно восстановить его за счёт:

потребления продуктов питания
сна, который «ставит» организм на «подпитку» и «перезагрузку».

Что же мы делаем? После самой интенсивной тренировки бежим в кафе или магазин, чтобы мгновенно уничтожить её достижения и результаты – восполнить запас калорий. И чаще преумножить его.

Именно эта ошибка приводит к появлению «экспертных мнений» о том, что, дескать, сколько калорий не сжигается на эллипсоиде, «жир с боков всё же не уходит».

Ну, конечно же, он никуда не денется, если за 2 часа среднего тренинга на эллипсоиде потратить примерно 1100 калорий, а затем отправиться на шашлыки, чтобы приобрести 2200, съев килограмм жареного мяса.

Побеждает лишний вес не тот, кто доводит себя до исступления на любом из предлагаемых нами спортивных агрегатов, а тот, кто при этом тренинге еще и знает секрет формулы БЖУ (умеет считать белки, жиры, углеводы, попадающие в организм).

1 грамм протеина – 4 калории.
1 грамм углеводов – тоже 4
А вот в грамме жира их уже 9.

Важна норма поступающих в организм калорий. Именно норма, потому что хронический недостаток, равно как и переизбыток, приводит к негативным последствиям. При переизбытке мы толстеем, задыхаемся при подъёме на лестницу, а при недостатке? Теряется хорошее настроение и работоспособность.

На сегодняшний день количество людей, живущих в мире, близится к отметке 8 млрд. (на 2018 год цифра составляет 7,594 млрд). Из них страдает от ожирения 800 млн. То есть, каждый десятый житель нашей планеты. Все ли они элементарно переедают в силу «любви к вкусной и неполезной пище»?

Нет. Откроем тайну: число людей с избыточным весом растёт, потому что жизнь становится всё более неспокойной. И если в наших широтах принято считать, что стресс «заливают» преимущественно горячительными напитками, то, поверьте, в целом по «больнице» это вовсе не так. Каждый десятый гражданин Земли «заедает» нервное перевозбуждение, не являясь гурманом.

Большинство людей толстеют не потому, что часто и много едят, а напротив – потому что живут в бешеном ритме и НЕ едят вовремя. Изголодавшись, они приходят домой и «штурмуют холодильник» когда есть вовсе и не стоит, а пора лечь спать после лёгкого ужина.

В такой ситуации совершенно не важно, сколько калорий сжигает эллиптический тренажер с утра в тренажёрном зале или на лоджии: организм «наверстал» всё с лихвой. И «спортсмен» отправился на боковую, отращивать во сне жировую прослойку.

Перееданию способствует не только «абстрактный» бешеный ритм жизни, когда по дороге на работу кто-то успевает «заглотить» гамбургер, а кто-то шаурму. Избыточный вес — «социальная проблема», как и алкоголизм. Если ты видишь, что тебя окружают такие же «едоки», любящие «заправиться на ночь» и обедать «на бегу», то чувствуешь себя «в своей тарелке» и легко пробиваешь отметку отведённой тебе суточной нормы в 1800 калорий.

1800 калорий – средний суточный показатель потребности в «подпитке» для мужчин. Женщинам нужно поменьше – 1500. В профессиональной литературе вы найдете показатель суточной нормы аж 2500 калорий. И решите: это повод для того, чтобы есть больше. Да! Но только если вам 20-25 лет. Организм в этот период имеет отличный обмен веществ.

А что прикажете делать в 40-45 лет? Указанную минимальную планку в 1800 калорий, приходящихся на сутки, в этом возрасте нужно оценивать «критически», потому что даже минимальное превышение отзовется на фигуре.

Возможно, вам не терпится узнать, сколько калорий сжигается на эллипсе. Но куда важнее понимать, что 75% занимающихся без наблюдения

опытного диетолога
хорошего тренера

напоминают хомяков, которые

вращают лапками установленное в ловушке колесо
и при этом всё время едят.

Увы, они никогда не меняют внешнего вида!

Ещё 20% наносят ущерб своему здоровью, сконцентрировавшись на «чистой воды математике» — считают количество калорий. А что же качество? Ему не уделяется внимания.

Качеством в этой ситуации являются витамины и минералы, нужные организму и содержащиеся в фруктах и овощах. Макароны и сладости имеют высочайший калораж. Но не приносят ничего, кроме разочарования, когда мы смотрим в зеркало на утро после съеденного накануне торта.

Эллипсоид, каким бы навороченным он не был, способен помочь в борьбе с лишним весом лишь на треть. Его «удельный вес» в процессе похудения – не более 30 %! А остальное? Это ваше питание!

И вот мы плавно подбираемся к вопросу эффективности орбитрека (эллипсоида) в тренировочном процессе.

Особенности сжигания калорий на эллиптическом тренажёре

Главной особенностью, которой выделяется расход калорий на хорошем эллипсоиде, является сочетание универсальности и безопасности. Дело в том, что беговая дорожка подходит далеко не каждому человеку, стремящемуся похудеть. Например, люди пожилого возраста или те, кто имеют проблемы с коленными суставами, наверняка предпочтут воздержаться от использования беговой дорожки из-за рекомендаций врача.

Велосипед? Очень хороший вариант. Но при этом те, у кого проблема с позвоночником, смогут крутить педали только в горизонтальном варианте велотренажёра, потому что больной спине можно больше нанести вреда, чем обеспечить пользы, занимаясь на вертикальном велосипеде.

Эллипсоид, позволяющий максимально полезно и равномерно распределить нагрузку по всему телу, подходит и тем, кто страдает от болезней суставов (нагрузка на колени здесь исключена), и тем, кто достиг солидного возраста, и тем, у кого «нелады» с позвоночником.

В этом спортивном агрегате реализована русская народная мудрость «поспешай медленно». Размышляя над вопросом, сколько калорий сжигается на «неэффективном» эллипсоиде, не сбрасывайте со счетов:

его максимальную пригодность для людей с различными проблемами со здоровьем (а таких, увы, большинство).
комфортабельность эксплуатации (побегайте-ка на беговой дорожке в 5 утра – вы услышите много приятного от соседей снизу, в то время, как эллипсоид подчёркнуто бесшумен).
способность «щадить» Вас! Это важно. Человек с весом 70 кг уничтожит на эллипсоиде 1036 калорий за 2 часа непрерывной работы, хотя мог бы их сжечь за 1 час на беговой дорожке. И это прекрасно. Потому что на работу он отправится полный сил и энергии, поработав на орбитреке 1 час и потеряв 518 калорий. Куда уйдут оставшиеся? На Вашу продуктивность в ходе рабочего дня.

Очевидные преимущества эллиптического тренажёра

для сжигания калорий

Существуют графики энергозатратности, при составлении которых исследованы самые разные виды активности — от работы с пылесосом до плавания быстрым кролем и бега трусцой. При анализе этих процессов вычисляется соотношение теряемых нами калорий на 1 кг нашего веса за 60 минут и определяется «рейтинг» видов активности, приносящих максимальную пользу человеку.

Тренировка на орбитреке (эллипсоиде) считается одной из самых эффективных. А почему? Такой тренажёр, за счёт своей универсальности и деликатности воздействия на организм позволяет нам заниматься продолжительное время, соотнося свои желания с возможностями.

Мы не «убиваемся» на эллипсоиде, бережём себя, не травмируем позвоночник, поясницу, колени, и не выключаемся из процесса максимально долгое время.

И вновь зададимся вопросом – почему? Происходит:

Укрепление сердечно-сосудистой системы

На беговой дорожке или на велосипеде люди, согласно статистике, чаще сходят с дистанции. Это наша психология: «Я пробегу в первый день 1 час, а во второй день пробегу 2 часа, а на третий…». Третьего дня не будет, потому что Вы можете свалиться с гипертоническим кризом или тахикардией.

С эллипсоидом этого не случится. Если Вы подошли к тренировкам правильно, начав с 5-10 минут, делая паузы (тренируясь через день) и прибавляя к тренингу по 5 минут каждый день, то Вы помогаете сердцу и сосудам стать крепче, предотвращая тем инфаркты и инсульты.

Улучшение дыхательной системы

Людям, которые занимались спортом последний раз в школе, важно начать тренировки на орбитреке, потому что именно этот тренажёр не увеличивает объём лёгких (что в некоторых случаях может быть опасно), а тренирует дыхательную систему, заставляя нас забыть про одышку при подъёме на 5 этаж. У вас куда меньше риска заработать в ходе тренировки головокружение, упасть с тренажёра и получить травму, чем в случае с беговой дорожкой, полотно которой непрерывно движется. Это несомненный плюс. Лёгкие функционируют, укрепляясь постепенно, без стресса.

Комплексная тренировка мышц

Короткой фразой о том, что эллипсоид даёт нагрузку на все группы мышц, можно было бы ограничиться. Но мы продолжим, сказав, что эта нагрузка деликатна и полезна для организма. В разумной степени нагружаются руки и ноги (именно орбитрек даёт возможность в режиме обратного вращения прокачать заднюю часть бедра, чего не позволит сделать беговая дорожка или велотренажёр). Идёт нагрузка на плечи, но при этом они не становятся «раздутыми», как у бодибилдеров. Есть нагрузка на спину, но она щадящая и боли возникают крайне редко. Прорабатываются грудь и пресс. Чудо! Мы начали с вопроса, сколько калорий сжигается на эллипсе, а пришли к тому, что функционал этого устройства не сводится к одному лишь «уничтожению» потреблённого за день «калоража».

Он дарит здоровье и развитие.

Сколько сжигает эллипс в сравнении с другими кардиотренажерами

Калории на эллипсоиде жгутся медленнее! Если за час интенсивной работы на беговой дорожке (имеется в виду непрерывный бег на скорости 10 км/ч) вы потеряете 800-900 калорий, а на велосипеде 700-800, то орбитрек отнимет у вас 400. Хорошо это или плохо? Может лучше, всё-таки, купить беговую дорожку?

Еще раз! Калории – не мусор, а источник вашей работоспособности. Помните это. Помимо спортивного зала, где установлен орбитрек, есть прекрасный мир, в котором вам очень понадобятся силы, энергия. Их дают калории. И, прочитав эту статью, вы будете, как минимум, задумываться о двух вещах. Не только о количестве этих калорий, но и об их качестве.

А ещё о том, что именно эллипсоид, представленный в нашем спортивном дискаунтере, не просто позволит вам начать путь к самосовершенствованию и прекрасной фигуре, но и даст возможность задержаться на этом пути максимально долго. Ведь орбитрек — это в меньшей степени тренажёр для «спорта», как беговая дорожка или велосипед. А в большей – ресурс для длительного, приятного саморазвития, долгосрочного закрепления желаемого результата.

Вывод

Вопрос о том, сколько калорий сжигается на современном эллипсоиде, лучше рассматривать в сочетании с другими, не менее важными вопросами, затрагивающими стиль и периодичность вашего питания, образ жизни, количество стрессовых ситуаций и методы борьбы с эмоциональным перенапряжением. Мир многогранен. И спортивные инструменты для саморазвития, которые мы предлагаем Вашему вниманию, просят грамотного отношения к ним, обещая приносить владельцам максимальную пользу взамен.

Мы уверены в том, что читатели нашей статьи сумеют извлечь из занятий на эллипсоиде максимально позитивный эффект для своего здоровья!

его польза и сколько калорий сжигается за один подход на эллиптическом тренажере

Когда вы решаете разнообразить классическую тренировку и начинаете крутить педали в обратном направлении, то работающие мышцы на эллиптическом тренажере уже другие. В дело вступают подколенные сухожилия и ягодицы и в меньшей степени четырехглавые мышцы. Для максимальной проработки ягодичных мышц и подколенных сухожилий, слегка отодвиньте ягодицы назад, как будто вы хотите сесть, и держите колени под углом 90 градусов во время педалирования назад.

Мышцы рук — бицепс и трицепс. Хотите проработать бицепс — тяните за рукоятки во время тренировки, а если нужно прокачать трицепс, держитесь за руль.

Мышцы спины и груди. Какие мышцы работают во время тренировки на эллиптическом тренажере? Не только мышцы нижней части тела! Во время занятий можно прокачать и широчайшую мышцу спины, и грудные мышцы. Мышцы спины активно работают, когда вы тянете рукоятки на себя, а грудные задействованы, когда вы держитесь за руль.

Сколько калорий сжигается на эллиптическом тренажере?

Занятия на эллиптическом велосипеде — это идеальный формат для похудения. Сколько калорий сжигает тренировка на эллиптическом тренажере? На одном занятии можно сжечь от 450 до 830 калорий в час, что в 2-4 раза больше, чем при ходьбе! Все зависит от интенсивности занятия:

низкая интенсивность — 450 ккал;

средняя интенсивность — 650 ккал;

высокая интенсивность — 830 ккал.

Во время интенсивных или интервальных тренировок вы можете сжечь чуть ли не все калории, наеденные за день, — за час эллиптический тренажер поможет избавиться от более 800 ккал.

Когда вы делаете упражнения со средней интенсивностью, ваше тело использует жировые запасы в качестве источника энергии. Так что и кардиотренировки средней интенсивности эффективно сжигают лишний жир.

Чтобы сбросить 1 кг, нужно сжечь 7000 ккал. Отсюда самый оптимальный график тренировок на эллиптическом тренажере — каждый день в течение 20 минут с высокой интенсивностью. Так вы потеряете 1 кг за месяц. Рассчитайте, на сколько килограммов вы хотите похудеть и составьте индивидуальный график кардиозанятий на эллипс-тренажере.

Сколько калорий сжигает орбитрек (эллиптический тренажер) 2021

Орбитрек, или эллиптический тренажер входит в число популярных тренажеров. Люди тренируются на нем дома и в спортзалах: избавляясь от лишнего веса и сжигая лишние углеводы, качая мышцы и тренируя сердце, повышая выносливость и делая эластичными суставы.

Тренируясь на таком спортинвентаре, вы сможете привести в порядок:

Сердце.
Спину и бицепсы благодаря использованию поручней.
Грудь и трицепсы.
Ягодицы и четырехглавые мышечные ткани бедер, их переднюю и заднюю часть.
Икры, при небольшом наклоне тела вперед.
Подколенные сухожилия.

Калории, пожалуй, один из важных показателей, который контролирует спортсмен во время занятий. Естественно, что каждого пользователя интересует вопрос — сколько калорий сжигается на орбитреке. Об этом и другом наша статья.

Сколько калорий сжигается на орбитреке

Итак, сколько калорий сжигается на эллиптическом тренажере, интересует практически каждого, кто начинает тренироваться и имеет лишний вес. Да и худой человек также не против узнать ответ, так как высвечиваемые на табло данные позволяют оценить, как интенсивно прошла тренировка: чем выше нагрузка, тем большее количество калорий тратится и тем лучше прокачиваются мышечные волокна.

И здесь мы подходим к главному — однозначного ответа на вопрос, сколько калорий сжигает эллипсоид нет: можно бежать при максимальных усилиях, но крайне медленно и истратить такое же количество углеводов, как при минимальной нагрузке, но с ускоренным темпом бега.

В интернете мы нашли информацию о том, что в среднем при занятиях на этом тренажере сжигается 13 кал в минуту или 780 кал в час. Решили проверить на собственном опыте. Взяли модель с 8 степенями нагрузки и поставили на него достаточно тренированного человека. Установили максимальный уровень — восьмой — и предложили побегать полчаса.

Результат вышел следующий — за 30 минут человек пробежал 11 км и израсходовал 240 кал. При помощи нехитрых вычислений становится понятно, что за час было затрачено всего 480 кал. Это достаточно хороший результат. Но для затрат 780 кал бежать надо было бы как минимум в 1,5 раза быстрее, что под силу только хорошо тренированному спортсмену. Учитывайте это.

То есть, если вы новичок в этом деле, то, задавая вопрос, сколько калорий сжигает Орбитрек, не рассчитывайте на 780 кал/час — первоначальные показатели будут намного скромнее. И уже потом, при усиленных занятиях, повысив интенсивность, вы сможете достигать бОльших показателей.

Теперь посчитайте, что если среднестатистическому человеку в день необходимо примерно 1300—2000 кал, то часовая тренировка позволит убрать третью часть калорий от суточной нормы.

Расход калорий на эллиптическом тренажере

Итак, мы выяснили, сколько калорий сжигается на эллипсе. Теперь давайте разберемся, как происходит расход калорий на эллиптическом тренажере, что на него влияет. Вот основные факторы:

Нагрузка. На спортивном оборудовании каждый пользователь волен самостоятельно выбирать программу — начинайте с малого, постепенно увеличивая значения.
Длительность. Чем дольше длится тренировка, тем больше углеводов вы будете сжигать и тем быстрее сможете похудеть — главное не переусердствуйте.
Скорость. Чем усиленнее вы будете крутить педали, тем больше энергии сможете расходовать и тем большее количество жира сожжете.

Зная условия, которые влияют на калорийные затраты, подбирайте оптимальный режим нагрузки и длительность занятий.

Как считаются калории на эллипсоиде

Начинающих пользователей интересует вопрос, как считаются калории на эллипсоиде? Здесь, за вас все сделает сам тренажер. На мониторе во время тренировки постоянно высвечиваются показатели, вы можете на протяжении всего периода контролировать их, например, ускоряться или при сильной усталости замедляться.

Учитывайте, что можно повысить эффективность тренировочного процесса — это ускорит похудение и усилит положительное воздействие тренировок на организм. Эффективное время для занятий — между подъемом и первым питанием. В этот период в качестве источника энергии используется жир, а не углеводы, которые в виде гликогена находятся в мышцах. Гликоген уже израсходовался ночью, и организм сразу начинает сжигать жировую прослойку.

Второй фактор, влияющий на эффективность — по возможности занимайтесь после силовой тренировки, тогда процесс похудения будет происходить быстрее.

Третье условие — начинайте тренировку умеренно, не разгоняйтесь сразу, хотя бы первые 10 минут. В начале занятий сжигание жира, а не мышц, идет при низкоинтенсивной нагрузке.

Надеемся, что мы ответили на ваш вопрос — сколько калорий сжигает эллипсоид, и теперь вы сможете заниматься более эффективно, зная все тонкости, правильно подбирая нужный ритм и время для занятий.

правила занятий, программы тренировок. — Элептика.ру

Каталог статей

Каждый стремиться к самосовершенствованию, хочет выглядеть лучше, иметь привлекательные формы и быть физически подготовленным человеком. Регулярные сбалансированные занятия спортом не только поднимают настроение, придают силы и замедляют процесс старения, но и способствуют:

Сжиганию жира = похудению;
Улучшению формы и рельефности фигуры;
Увеличению мышечной массы, силы, выносливости;
Развитию гибкости;
Улучшению обмена веществ;
Предотвращению травм;
Улучшению координации, развитию ловкости.

Если уделять тренировкам хотя бы 15-30 минут три раза в неделю (в совокупности всего 1.5 ч. в неделю), то можно получить огромную пользу для своего организма.

Основные составляющие физического состояния

Есть четыре составляющих, которые определяют физическое состояние организма. В этом разделе коротко охарактеризуем каждую и разъясним их роль.

Сила	Это способность мышц преодолевать нагрузку. Сила способствует физической мощи и скорости, и очень важна для спортсменов.
Выносливость	Это способность прилагать силу многократно в течение периода времени. Например, способность пробежать 10 км без остановки.
Гибкость	Это амплитуда движения суставов. Увеличивая гибкость, вы растягиваете мышцы и сухожилия, что способствует снижению вероятности травм или болезненных ощущений.
Выносливость сердечно-сосудистой и дыхательной систем	Это самая важна составляющая физического здоровья организма, характеризующая эффективность работы сердца и легких.

Начальный уровень тренировки.

Это минимальный уровень упражнения, который требуется для достижения существенного улучшения любого фитнес-параметра.

Прогресс.

По мере того, как спортсмен становится более натренированным, требуется большая интенсивность упражнения, чтобы достичь предела возможностей и, следовательно, обеспечить дальнейшее улучшение.

Предельные возможности.

Тренироваться на пределе возможного — означает нагрузки, превышающие состояние комфорта. Интенсивность, продолжительность и частота упражнений должны быть выше начального уровня и постепенно увеличиваться по мере того, как тело привыкает к увеличивающейся нагрузке. Начальный уровень должен расти по мере улучшения вашей физической формы. Важно заниматься по программе и постепенно увеличивать предельный уровень.

Различные формы упражнений дают различные результаты. От типа выполняемого упражнения зависит, и какие группы мышц включены в работу, и какой источник энергии используется (жиры или углеводы).

Разминка и расслабление мышц после упражнений

Прежде чем начать тренировку, всегда следует выполнить разминку, чтобы подготовить тело к последующей работе. Разминка должна быть легкой и предпочтительно задействовать те мышцы, которые будут включены в тренировку. После тренировки необходимо выполнить упражнения на растяжку, которые позволят стать более гибкими. Также, благодаря растяжке, на следующий день спортсмен не будет испытывать боль в мышцах.

Сердечный ритм и подсчет пульса

Если человек только начинает заниматься спортом, то можно достичь хороших результатов с частотой пульса 110 — 120 ударов в минуту. Если же в хорошей физической форме, то необходим более высокий уровень нагрузки.

Во время первых занятий частота пульса должна составлять около 65 — 70% от максимального значения. Максимальное значение частоты пульса можно рассчитать по формуле: 220 минус «возраст спортсмена».

С возрастом снижается работоспособность сердца, также как и других мышц. Что-то можно компенсировать за счет физических упражнений.

Подсчет пульса (на запястье или сонной артерии на шее, с помощью указательного и среднего пальцев) производится в течение 10 секунд сразу же после завершения тренировки.

Не следует переусердствовать, иначе появится ощущение дискомфорта. Не стоит каждый день беспокоиться об изменении частоты пульса, которое может быть вызвано перепадами давления. Значение пульса — это всего лишь ориентир, и незначительные отклонения в ту или иную сторону допустимы.

Тренировка силы и выносливости

Основной принцип тренировки на выносливость — обеспечение одновременной тренировки сердечно-сосудистой, дыхательной системы, силы мышц, гибкости и координации при помощи быстрой смены упражнений. Это увеличивает значение частоты пульса и поддерживает его на достигнутом уровне, что улучшает физическую форму.

Не следует приступать к выполнению упражнений данного вида, пока спортсмен не достигнет достаточно хорошего уровня физической формы.

Основной принцип тренировки силы — это тренировка с перегрузкой. При данном виде тренировки мышцы работают с большей нагрузкой, чем обычно. Это достигается увеличением нагрузки, которую нужно преодолевать во время тренировки.

Мышечная боль

В первую неделю занятий это может быть единственным показателем того, что спортсмен начал тренировочную программу. Конечно, интенсивность зависит от первоначального физического уровня подготовки.

Доказательством того, что программа тренировок составлена верно, будет незначительная боль в большинстве основных групп мышц. Это нормально и в будущем неприятное ощущение исчезнет.

Если спортсмен испытывает значительный дискомфорт, то, возможно, он тренируется по программе высокого уровня или увеличивает уровень программы слишком быстро. Если испытывает боль в течение или после упражнения, значит что-то не в порядке. Следует прекратить тренировку и проконсультироваться у врача.

Дыхание во время упражнений

Не нужно задерживать дыхание во время выполнения упражнения. Дыхание подразумевает выдох на усилии и вдох на расслаблении, что дает правильное распределение кислорода, который питает мышцы.

Передышка

Передышка необходима между тренировками, причем для каждого человека индивидуально. В основном, ее периодичность будет зависеть от уровня физической подготовки и программы, которую спортсмен выбрал. Следует уделять время отдыху между упражнениями, но отдых не должен превышать двух минут. Большинству людей для отдыха будет достаточно от 30 секунд до одной минуты.

Программы

Выбранная программа тренировок должна зависеть от уровня физической подготовки, свободного времени и целей. Первое время следует придерживаться тренировок по программе №1 и постепенно увеличивать как время, так и интенсивность тренировок. Если человек уже достиг определенного уровня и занимается регулярно, то можно тренироваться по программе №2.
Всегда следует помнить о разминке и упражнениях на расслабление; умеренность и последовательность — это секрет постоянных результатов.

1. Программа для начинающих

Периодичность: 3-4 раза в неделю;
Продолжительность: 20-30 минут;
Интенсивность: 60-70% от максимальной частоты пульса;
Частота шагов: менее 50 шагов в минуту.

В первое время внимание следует уделить постепенному увеличению непрерывной активности в течение 20 — 30 минут, а не достижению и поддержанию заданной интенсивности тренировки. Когда получится непрерывно тренироваться 20 — 30 минут, необходимо постепенно увеличивать время выполнения упражнения на рекомендованном уровне интенсивности. Данной программы следует придерживаться в течение первых 6 — 8 недель тренировок.

2. Программа промежуточная

Периодичность: 3-5 раза в неделю;

Продолжительность: 20-45 минут;

Интенсивность: 70-80% от максимальной частоты пульса;

Частота шагов: 50-60 шагов в минуту.

В большинстве случаев, эта программа будет давать желаемые результаты в соответствии с целями тренировок для основной массы занимающихся спортом.

3. Программа для подготовленных

Частота: 4-6 раза в неделю;
Продолжительность: 30-60 минут;
Интенсивность: 80-90% от максимальной частоты пульса;
Частота шагов: 60-80 шагов в минуту.

Эта программа рекомендуется только для нуждающихся в развитии и поддержании наивысшего уровня тренировки сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Альтернативой продолжительной тренировки с высокой интенсивностью может служить тренировка с интервалами, в которой работа с большей интенсивностью (с большей частотой шагов) в течение 30 — 60 секунд чередуется с работой с меньшей интенсивностью в течение 1 — 2 минут.

Упражнения на растяжку

Растяжку следует включать и в разминку, и в упражнения на расслабление после тренировки. Необходимо производить растяжку после выполнения дыхательных упражнений в течение 3 — 5 минут. Движения следует выполнять медленно и плавно, без подпрыгиваний и рывков. Продолжать растяжку стоит до возникновения незначительного напряжения в мышцах, но ни в коем случае не боли. Дышать нужно медленно, ритмично и не задерживать дыхание.

Растяжка четырёхглавой мышцы

Возьмитесь одной рукой за стопу и тяните пятку к ягодицам. Задержитесь в этом положении 20 — 30 секунд, затем вернитесь в исходное положение. Повторите для другой ноги.

Растяжка икроножных мышц и ахиллова сухожилия

Отставьте ногу назад. Нога должна быть прямой. Делайте движение бедрами вперед, сгибая другую ногу в колене. Задержитесь в таком положении на 20 — 30 секунд, вернитесь в исходное положение. Повторите для другой ноги.

Растяжка мышц спины

Вытяните руки вперед, ноги прямые, наклоните туловище ниже уровня рук, сгибая ноги в коленях. Задержитесь в этом положении на 20 — 30 секунд.

Растяжка задней области плеча

Возьмитесь за локоть и тяните руку к середине спины, задержитесь в этом положении на 20 — 30 секунд, и затем вернитесь в исходное положение. Повторите для другой руки.

Растяжка подколенного сухожилия и низа спины

Поднимите ногу вверх, затем тяните ее к потолку. Задержитесь в этом положении на 20 — 30 секунд. Повторите для другой ноги.

Растяжка мышц бедра, ягодичных и брюшных

Тяните колено к полу, плечи должны быть прижаты к полу. Задержитесь на 20 — 30 секунд. Повторите для другой ноги.

Растяжка внутренней поверхности бедра

Соедините ступни ног вместе, надавив сверху-вниз на внутренние части коленей, слегка наклонитесь вперед. Задержитесь в этом положении на 20 — 30 секунд.

Растяжка мышц груди и плеч

Упритесь ладонями в пол, руки прямые, переместите ягодицы вперед, так, чтобы руки остались в исходном положении.

Заключение

Для достижения максимальных физических результатов и получения максимального удовольствия можно изменять нагрузку, частоту и интенсивность во время выполнения упражнений. В дополнение: когда чувствуется переутомление, нужно перейти к более легким упражнениям для того, чтобы восстановить силы. В результате этого спортсмен будет получать больше удовольствия от тренировок, и чувствовать себя лучше.

Физические упражнения должны выполняться регулярно. Если человек прекращает заниматься физическими упражнениями, то достигнутая им степень физической подготовленности довольно быстро снижается, и он, по степени тренированности сердечно-сосудистой системы, уже ничем не отличается от человека, ведущего малоподвижный образ жизни. Поэтому, чтобы физические упражнения поддерживали в хорошем состоянии сердечно-сосудистую, дыхательную систему, форму и рельефность фигуры, необходимо сделать их одним из необходимых элементов вашего образа жизни. Регулярные правильные тренировки — залог успеха!

Как сбросить вес с помощью эллипсоида? | Tренирофка.ру

Социальные сети и блоги переполнены информацией о тренировках и упражнениях для здоровых людей. Но, по статистике, каждый третий посетитель тренажерного зала или фитнес-клуба имеет серьезные заболевания или более 10 килограммов лишнего веса. Однако новички часто не осознают своих ошибок и отчаянно пытаются сбросить вес на велотренажере или с ходу начинают поднимать тяжелую штангу. Когда вред от неправильных силовых нагрузок превышает пользу, а программа тренировок для похудения на велотренажере не приносит желаемого быстрого результата, новоявленные спортсмены возвращаются к прежнему образу жизни. Избежать разочарования поможет грамотная индивидуальная программа тренировок для похудения на эллиптическом тренажере (эллипсоиде, орбитреке). Не знаете, как самостоятельно составить план занятий? Все гениальное просто – нужно освоить базовые знания, не пренебрегать правильной техникой и ставить перед собой конкретные цели с учетом телосложения.

Преимущества эллиптического тренажера

Есть силовые тренажеры, а есть кардиотренажеры. Первые позволяют подтянуть наиболее слабые мышцы и скорректировать фигуру.

Тренажеры из кардиозоны способствуют сбросу лишнего веса. Оба вида тренажеров дают такой результат, которого не добиться тренировками в домашних условиях. Скептически относитесь к традиционному «кардио» и сомневаетесь, можно ли сбросить вес, тренируясь на эллипсоиде, велотренажере или беговой дорожке? Тогда посмотрите видео Тани Рыбаковой, которая благодаря аэробным и силовым нагрузкам похудела на 55 кг. Стройная ныне спортсменка начинает свои занятия в зале с 10 минут на беговой дорожке, а заканчивает 20 минутами на эллиптическом тренажере с пульсом 135 ударов в минуту.

Есть силовые тренажеры, а есть кардиотренажеры. Первые позволяют подтянуть наиболее слабые мышцы и скорректировать фигуру. Тренажеры из кардиозоны способствуют сбросу лишнего веса. Оба вида тренажеров дают такой результат, которого не добиться тренировками в домашних условиях. Скептически относитесь к традиционному «кардио» и сомневаетесь, можно ли сбросить вес, тренируясь на эллипсоиде, велотренажере или беговой дорожке? Тогда посмотрите видео Тани Рыбаковой, которая благодаря аэробным и силовым нагрузкам похудела на 55 кг. Стройная ныне спортсменка начинает свои занятия в зале с 10 минут на беговой дорожке, а заканчивает 20 минутами на эллиптическом тренажере с пульсом 135 ударов в минуту.

Мужчинам и женщинам с большим индексом массы тела нужно минимизировать ударную нагрузку на суставы. Поэтому программа тренировок для похудения на степ-платформе и беговой дорожке им не подходит. Из-за значительных жировых запасов на животе придется наложить вето и на упражнения для пресса. Прекрасной альтернативой запретным комплексам и пробежкам станет тренировка на эллипсоиде, которая разрешена даже людям старшего возраста и при варикозном расширении вен.

Преимущества эллипсоида по сравнению с другими кардиотренажерами и бегом:

конструкция позволяет одновременно тренировать ноги и прорабатывать мышцы груди, рук, спины;
педали вращаются вперед и в обратную сторону;
занятия не вредят суставам и позвоночнику;
движения агрегата плавные, поэтому риск получить травму минимален;
траектория шага позволяет целенаправленно задействовать проблемные зоны нижней части тела;
держась за неподвижные поручни, можно акцентированно проработать бедра и ягодицы;
движения непрерывные, благодаря чему мышцы лучше насыщаются кровью и кислородом, активнее сжигаются калории;
орбитрек легко настраивается под разный рост и вес.

Правильная программа тренировок на кардиотренажерах для «сушки» или похудения дополнительно укрепляет дыхательную систему и сердце, повышает эластичность сосудов и капилляров. Такой легкий вид фитнеса позволяет полным людям чувствовать себя комфортно в спортзале и не комплексовать.

Читайте также «Правила тренировки на эллиптическом тренажере»

Советы по тренировке на эллипсоиде

Занятия на эллипсоиде должны быть частью тренировочного комплекса: 50–60% тренировочного времени нужно уделять эллиптическому тренажеру, а 40–50% – силовой нагрузке, благодаря которой похудевшее тело будет упругим и красивым. Контролировать увеличение нагрузки помогает пульсометр: чем больше скорость и сопротивление, тем выше пульс.

Первые 5–7 минут тренировки нужно посвятить суставной разминке – круговым вращениям во всех суставах (по 5–10 раз в каждую сторону). После нее можно приступать к занятию на эллипсоиде в медленном темпе. За 10 минут мышцы разогреются, после чего можно ускоряться и выполнять запланированную тренировку. Заканчивать занятие надо «охлаждающей» заминкой: постепенно замедлять скорость и следить за снижением пульса. В конце желательно сделать упражнения на растяжку.

Выбирая время для занятий, ориентируйтесь на свой биоритм: людям, которые прекрасно себя чувствуют по утрам, можно заниматься в первой половине дня, а «совам» больше подходит послеобеденная тренировка. Особенно эффективны для похудения тренировки натощак, но делать это можно только с разрешения врача. Вечерняя тренировка должна заканчиваться за два часа до сна.

Тренировки не превратятся в рутину, если использовать все возможности электронных программ на эллипсе. Внесут разнообразие и самостоятельно спланированные интервальные занятия. Если тренажер оснащен виртуальным тренером, то стоит прислушаться к его рекомендациям для лучшей проработки мышц.

Как тренироваться на эллипсоиде новичкам?

Задача начинающего спортсмена – приучить тело к нагрузке, освоить технику и научиться шагать без остановки. Первое время движения должны осуществляться без наклона туловища вперед или назад. Энтузиастам, которые хотят быстрее скинуть лишнее и готовы заниматься хоть весь день, придется умерить свой пыл: оптимальная продолжительность тренировки для новичка – 30 минут. Людям с низким уровнем физической подготовки хватит трех тренировок в неделю. За одну минуту желательно делать 40–50 шагов. При этом пульс не должен выходить за пределы 60–70% от максимального. Если частота сердечных сокращений (ЧСС) выше, нужно сбавить скорость.

Определить свою максимальную частоту пульса просто – нужно от 220 отнять свой возраст. Если нет пульсометра, можно самостоятельно посчитать ЧСС в любой момент тренировки: посчитать количество ударов за 10 секунд и умножить результат на 6. Если пульс будет низким, то укрепятся мышцы, а жировые запасы останутся в целости и сохранности.

Тренировки обязывают изменить свой рацион и режим питания. За 2 часа до нагрузки можно есть полезные низкокалорийные продукты: каши (гречневую, овсяную, перловую, бурый рис), овощи и совсем немного белковых продуктов. На тренировке нужно пить воду комнатной температуры. Обязательно подбирайте удобную спортивную одежду и кроссовки для тренировок (не кеды!).

Как повышать нагрузку на эллипсоиде?

За несколько недель регулярных занятий на орбитреке организм адаптируется к стрессу: дышать станет легче, появится мышечный тонус и повысится выносливость. Это повод плавно увеличивать нагрузку:

Дать больше нагрузки на ту или иную часть тела можно, сменив положение туловища:

Больше нагрузить ягодичные мышцы девушкам помогает ходьба назад: тело немного отклоняется назад, ноги сильнее сгибаются в коленном суставе и колени поднимаются выше.
Для лучшей проработки ног и ягодиц подойдет ходьба с наклоном туловища вперед: корпус наклонен вперед, таз немного отведен назад, шаги «продавливающие», руками нужно держаться за неподвижные поручни.
Увеличит нагрузку на ноги и попу ходьба с имитацией сидячего положения: руки на неподвижных поручнях, таз опущен вниз и отведен назад, в движении бедро поднимается до параллели с полом, таз не меняет своего положения и не подпрыгивает, спина прямая без увеличения прогиба в пояснице.

Как тренироваться на эллипсоиде для похудения?

Девушки часто интересуются, на каком кардиотренажере быстрее сгорают калории. Но результат зависит не от выбранного тренажера, а от того, сколько усилий прилагает человек. Так что на конечный результат в основном влияет интенсивность занятий.

Обрести стройность поможет эффективный интервальный тренинг:

I

15–20 секунд интенсивной нагрузки;
30–60 секунд отдыха;
11 повторов и в конце 5 минут тренировки с понижением сопротивления.

II

повышение сопротивления в течение 15 минут;
низкий темп 15 минут;
4 повтора и растяжка в конце.

III

3 минуты работы в размеренном темпе;
2 минуты с максимальной нагрузкой;
повторить нужное количество раз в рамках выделенного времени.

Многочисленные отзывы подтверждают, что эллиптический тренажер помогает быстро избавиться от 2–3 килограммов. Однако зацикливаться на одном тренажере не стоит. Нужно учитывать, что когда организм привыкает к однообразным кардиотренировкам, человек перестает худеть. Бесконечно увеличивать нагрузку не получится: жиросжигание начинается спустя 30–40 минут активного тренинга и длится примерно 20–30 минут, после чего организм перестает сжигать жир и начинает использовать в качестве энергии мышцы. Продолжать прогрессировать помогут другие виды тренировок.

Только спортом проблему лишнего веса не решить – необходимо еще правильно питаться. Если отдельно сравнивать эффективность сбалансированного рациона (без насыщенных жиров и быстрых углеводов) с эффективностью от тренировок, то быстрее худеют благодаря здоровой еде. Но без физической нагрузки качество тела будет ужасным, поэтому спорт должен стать неотъемлемой частью жизни. Не ограничивайтесь одним видом физической активности: больше двигайтесь в течение дня, катайтесь на велосипеде, играйте в теннис и другие спортивные игры.

Процесс похудения обычно сопровождается повышенной усталостью и сонливостью, а организм отчаянно не желает расставаться с запасами на черный день и повышает аппетит. Чтобы достичь поставленной цели без срывов, нужно вести тренировочный дневник, придумывать себе любые способы повышения расхода энергии дома и искать другие источники удовольствия, помимо еды. Тратьте больше калорий, чем потребляете и не подчиняйте свою жизнь питанию – воспринимайте прием пищи как функцию, помогающую поддерживать жизнь в теле!

Источник http://trenirofka. ru/programmy-trenirovok/dlya-pohudeniya/na-ellipticheskom-trenazhere.html

Как похудеть на эллиптическом тренажере Академия спорта

« Назад

Как похудеть на эллиптическом тренажере 14.09.2015 11:00

Эллиптический тренажер набирает все большую популярность среди домашних тренажеров, главная причина – мнение о том, что занимаясь на эллипсоиде можно достаточно легко похудеть. И действительно, для того, чтобы привести вес в норму недостаточно изнурять себя диетами, необходимо также ввести в ежедневный рацион «порцию» тренировок, чтобы привести мышцы в тонус и избавиться от лишнего подкожного жира. Не секрет, что главное правило для похудения – сжечь в течение дня больше калорий, чем потребить. Если с пищей получать 2000 калорий, а расходовать 500, естественно, что положительного результата можно и не дождаться.

Многие задают вопрос, как заниматься на эллиптическом тренажере, чтобы похудеть? Главный ответ – заниматься с удовольствием и с хорошим настроением! Мы рекомендуем Вам выбрать эллипсоид, который будет Вам нравиться, ведь он станет Вашим надежным партнером на пути к заветной цели. Включайте громкую ритмичную музыку и интенсивно крутите педали!

Сколько заниматься на эллиптическом тренажере, чтобы похудеть? Важным фактором успеха является регулярность занятий! Тренироваться на орбитреке предпочтительно 3-4 раза в неделю минимум по полчаса, с каждым занятием постепенно увеличивая нагрузку. Замените мягкий диван при просмотре любимого фильма или сериала на энергичные занятия на эллипсоиде. Эллиптический тренажер относится к классу кардиотренажеров, а это значит, что занимаясь, Вы повышаете пульс, обогащаете клетки организма кислородом и ускоряете метаболизм. Все это способствует сжиганию жира. Со временем можно увеличивать частоту вращения педалей, тогда будет сжигаться еще больше калорий. Постарайтесь вкладывать в тренировку максимум сил. Бесполезно просто встать на педали тренажера и вяло передвигать ногами. Нужно работать до увеличения пульса, до пота, до того состояния, когда чувствуется каждая задействованная мышца.

Занятия на эллипсоиде будут эффективны для похудения, если Вы будете придерживаться также принципов правильного питания. В первую очередь, стоит ограничить употребление мучного и сладкого, но это не значит, что нужно полностью отказаться от вкусненького. Занятия будут более эффективными, если Вы не будете есть за 2-3 часа до начала тренировки. После занятий можно выпить стакан чистой воды, а через час перекусить, не слишком наедаясь. Кстати, уже через несколько интенсивных тренировок на эллипсоиде, Вы заметите, что аппетит стал гораздо умереннее, это еще одно из положительных свойств кардионагрузок.

Какие же мышцы работают на эллиптическом тренажере? Эллиптический тренажер – один из самых эффективных и универсальных тренажеров для дома. Кроме кардионагрузок вы приводите в тонус внутренние и внешние мышцы бедер и ягодицы, при этом, Вы не травмируете ударными нагрузками тазобедренные и коленные суставы, так как движения по эллипсовидной траектории плавны и естественны. Кроме того, эллиптический тренажер воздействует на мышцы спины, рук и пресса! Разве можно представить более эффективный и универсальный тренажер?

Ну и самое, пожалуй, главное преимущество орбитрека в том, что он у Вас дома. Ваш надежный друг и партнер ждет Вас дома и в дождь, и слякоть, и ветер, и снег. Нехватка времени на занятия не станет причиной пропустить тренировку – теперь Вам не нужно тратить время на дорогу в спортзал или парк.

Приведем несколько отзывов тех, кому удалось похудеть на эллиптическом тренажере:

Марина, 44 года: поначалу был тяжело заниматься по 30 минут в день, но постепенно мышцы привыкли, и я стала даже получать удовольствие от тренировок. Похудела на 5 кг за месяц, и буду продолжать использовать эллипсоид для похудения. Это замечательный тренажер.

Ольга, 29 лет: начала заниматься недавно, уже худею, сжигаю по 340 калорий в день. Планирую наращивать частоту вращения педалей, чтобы худеть еще интенсивнее. Советую всем эллиптический тренажер.

Оксана, 38 лет: за полгода занятий на тренажере мне удалось сбросить 17 кг, считаю это отличным результатом. Я занималась очень упорно, пот бежал градом. Питание особенно не ограничивала, только на ночь не наедалась, старалась плотно обедать до шести часов вечера. Сейчас мой вес 65 кг, меня практически все устраивает, но я не планирую бросать занятия, мне они доставляют удовольствие.

Ульяна, 36 лет: за два месяца потеряла 7 кг, занимаясь на эллипсоиде, начинала с 20 минут, постепенно наращивая темп. Очень удобно, что тренажер стоит дома и никуда не нужно ехать.

Рекомендуем также прочитать статью:

Как правильно заниматься на эллиптическом тренажере? (часть 2)

Типы тренировок по уровню интенсивности

Нельзя прибегать к упражнениям слишком резко на беговых дорожках и эллипсе. В Интернете существует немало печальных отзывов, гласящих о том, что упражнения на эллипсоиде приводят к гипертонии или аритмии. На самом деле, в таких последствиях вины спортивного агрегата нет: дело в том, что спортсмены слишком спешат к заветной цели – похудению, игнорируя правила безопасности. Перед тем, как стать на эллипс, важно максимально обогатить запас знаний о занятиях на данном тренажере.

Базовая тренировка

В случае, если у вас нет большого опыта спортсмена, или вам нужно восстановить форму после травмы, приступайте к первым упражнениям на эллипсе. Несмотря на слово «базовый», данные упражнения помогут вам изрядно попотеть.

Подготовка. Прежде чем приступить к основной части занятий, позаботьтесь о правильной разминке. Отожмитесь, займитесь приседаниями, сделайте несколько наклонов для того, чтобы подготовить свое тело к будущей нагрузке.
Разминка. Займите исходное положение на тренажере, которое указано выше в нашей статье. Прокручивайте педали в течение пяти минут, не торопясь.
Разогрев. Отнимите от цифры 220 свой возраст – это максимум вашего пульса на предстоящей тренировке. Пульс не должен превышать 50% от данного показателя. ЧСС должен достигать около 90 ударов в минуту. Прокручивайте педали еще примерно 10 минут.
Следующий этап длится полчаса. Чередуйте ЧСС 50% от максимума в течение четырех минут и 70% в течение двух минут. Для повышения пульса нужно немного ускориться. Ни в коем случае нельзя превышать ЧСС более, чем на 126 ударов в минуту (если вам 40 лет).
Заминка. Замедлите темп упражнений: пульс должен успокоиться.

Интенсивная тренировка

Даже опытным спортсменам не следует игнорировать разминку. Пять минут спокойных упражнений поможет вам подготовить телу к более внушительной нагрузке.
20 минут делайте упражнения, чередуя пульс в районе 50% максимума (90 ударов в минуту) и 80% (144 ударов для человека 40 лет).
Последний этап упражнений – замедление темпа работы на эллипсоиде до снижения пульса к 72 ударам в минуту.

Программы тренировок по виду ходьбы на эллипсе

Рассматривая программы интенсивных упражнений важно обратить внимание на то, что количество возможных упражнений огромно. Если не позволять себе разнообразие, упражнения на эллипсоиде в скором времени могут надоесть, или же спортсмен останется на базовом уровне. Этого не произойдет, если более тесно ознакомиться с возможными программами, касающимися ходьбы.

Вариант 1. Классическая ходьба

В данном случае туловище должно располагаться вертикально. При этом ноги нужно располагать по принципу велосипеда: правая нога двигает педаль вперед, а левая рука тянет рукоятку на себя. После этого все необходимо делать без остановок в обратном режиме. Левой ногой нужно толкать педаль, а правой рукой – тянуть рычаг.

Нужно поддерживать правильную позицию тела. В данном случае нагрузка на группы мышц распределится равномерно, что поможет избежать травм. Для похудения тренировка на эллипсе должна достигать более получаса. Обратите внимание на регулярность занятий: они должны проводиться примерно 3-4 раза в неделю.

Вариант 2. Обратная ходьба.

Нередко спортсмены (особенно представительницы прекрасного пола) стремятся к крепким, упругим ягодицам. Данный метод тренировки поможет не только избавиться от лишнего веса, а и подтянуть ягодицы.

Для выполнения упражнения нужно слегка присесть. Колени расположить чуть выше, чем при классической ходьбе.

Вариант 3. Наклонная ходьба

Ошибочно полагать, что занятия на данном спортивном агрегате запрещены людям, страдающим от проблем с позвоночником. Это не совсем так. Людям, страдающим от постоянной боли в спине, можно практиковать ходьбу со слегка наклоненным корпусом на 45 градусов. Конечностями нужно толкать педали и тянуть рычаги. В данном случае нагрузка снимается со спины.

Вариант 4. Сидячая ходьба

Данное упражнение поможет подкачать область ягодиц, бедер и пресса. Для этого нужно расположиться на эллипсе так, чтобы бедра находились параллельно полу. Сделайте присед. Первое время это сделать достаточно непросто, однако таким образом спортсмен погружается в энергозатратную среду.

Пятидневная программа тренировок на эллипсе для похудения

Лишний вес приносит массу проблем. Дело не только в проблемах со здоровьем, которые провоцируют лишние килограммы: в данном случае не менее важны психологические проблемы и неуверенность в собственной привлекательности. Мы поможем вам ознакомиться с эффективной тренировкой на эллипсоиде, позволяющей эффективно сбросить лишний вес.

Для начала важно напомнить о том, что занятия любым видом спорте не принесут никакого результата без соблюдения специальной диеты и нормализации режима питания. В таком случае вы зря потратитесь на спортивный агрегат и абонементы в зал. Не считайте, что сбросить лишний вес можно только благодаря частым и интенсивным тренировкам. Для начала приступайте к разминке. Сжечь жир можно только после подготовки тела к этому процессу. Занимайтесь пять минут без сильной спешки до начала интенсивных упражнений.

Рассчитайте максимум своего пульса и определите нормальный диапазон, который должен достигать 60-70% . Тренируйтесь примерно 40 минут, не выходя из данного эшелона. Низкая ЧСС позволяет сжечь жир эффективнее всего. Тренировка по сжиганию жира заминает примерно 5-7 минут.

В случае соблюдения всех рекомендаций, за час тренировки в день с двумя перерывами в неделю вы получите нужный эффект уже через неделю.

Интервальная тренировка на эллипсе и её особенность

Человеческий организм быстро приспосабливается почти к любым нагрузкам, а интервальный метод помогает сделать «встряску» телу для достижения желаемого результата.

Для правильных занятий на эллипсе важно регулярно менять стратегии. Далее мы предложим основной вариант тренировки с интервалами: он подойдет новичкам и пожилым людям, нуждающимся в большем разогреве.

Первая фаза – умеренный пульс, пульс достигает 60% от максимума. Занятия длятся около двух минут.
30 минут тренировки нужно осуществлять с постоянной сменой интенсивности занятий: четыре минуты с пульсом 65% от максимума с приближением 75% пульса в течение трех минут.
Заминка подразумевает замедление ритма работы с занижением ЧСС.
В финале можно сделать растяжку, которая поможет избавиться от ощущения ломоты в теле. Это актуально во время первого занятия.

Кому противопоказаны тренировки на эллиптическом тренажёре

Перед тренировкой на эллипсе нужно проконсультироваться с врачом в случае:

— Заболеваний сердечнососудистой системы и хронических инфекций;

— Онкологических заболеваний;

— Сахарного диабета;

— Перенесенных травм;

— Врожденных пороков внутренних органов.

Для человека физические нагрузки являются благом. Опытные врачи и спортивные инструкторы подскажут вам правила занятий на эллипсоиде, подстраиваясь индивидуально под ваш организм.

Геоид, эллипсоид, сфероид и датум и их взаимосвязь — справка

Геоид определяется как поверхность гравитационного поля Земли, которая примерно равна среднему уровню моря. Он перпендикулярен направлению силы тяжести. Поскольку масса Земли неоднородна во всех точках, а направление силы тяжести меняется, форма геоида неправильная.

Щелкните ссылку ниже, чтобы получить доступ к веб-сайту Национального управления океанографии и атмосферы (NOAA).На веб-сайте есть ссылки на изображения, показывающие интерпретацию геоида под Северной Америкой: http://www.ngs.noaa.gov/GEOID/.

Для упрощения модели были придуманы различные сфероиды или эллипсоиды. Эти термины взаимозаменяемы. В оставшейся части статьи будет использоваться термин сфероид.

Сфероид — это трехмерная форма, созданная из двухмерного эллипса. Эллипс представляет собой овал с большой осью (более длинная ось) и малой осью (более короткая ось).Если повернуть эллипс, форма повернутой фигуры будет сфероидом.

Большая полуось составляет половину длины большой оси. Малая полуось составляет половину длины малой оси.

Для Земли большая полуось — это радиус от центра Земли до экватора, а малая полуось — это радиус от центра Земли до полюса.

Один сфероид отличается от другого длиной большой и малой полуосей.Например, сравните сфероид Clarke 1866 со сфероидами GRS 1980 и WGS 1984 на основе измерений (в метрах) ниже.

6356583 1980

Сфероид	Большая полуось (м)	Малая полуось (м)
Clarke 1866	6378206.4	635658336
6378137	6356752.31414
WGS84 1984	6378137	6356752.31424518

Сравнение сфероидов

Определенный сфероид может быть выбран для использования в определенной географической области, потому что этот конкретный сфероид исключительно хорошо имитирует геоид для этой части мира. Для Северной Америки предпочтительным сфероидом является GRS 1980, на котором основана Североамериканская датум 1983 (NAD83).

Опорная точка строится поверх выбранного сфероида и может включать в себя локальные изменения высоты. В случае сфероида вращение эллипса создает абсолютно гладкую поверхность во всем мире. Поскольку это не очень хорошо отражает реальность, местные данные могут включать в себя локальные изменения высоты.

Базовые данные и сфероид, к которым привязаны координаты набора данных, могут изменять значения координат. Ниже приводится иллюстративный пример с использованием города Беллингхэм, штат Вашингтон.Сравните координаты в десятичных градусах для Беллингема, используя NAD27, NAD83 и WGS84. Очевидно, что в то время как NAD83 и WGS84 выражают координаты, которые почти идентичны, NAD27 сильно отличается, потому что основная форма Земли по-разному выражается используемыми датумами и сфероидами.

48,74404656 -122,46818353793 48,7438798543649 -122,46818353793 +48,7438798534299

Датум

Долгота

Широта

NAD 1927

-122.466652

NAD 1983

WGS 1984

Географический приведенные ниже координаты относятся к городу Беллингхэм, штат Вашингтон, с использованием трех разных систем отсчета.

Долгота — это угол от нулевого меридиана в Гринвиче, Англия, до центра Земли, затем на запад до долготы Беллингема, штат Вашингтон.Широта — это угол, образованный от экватора до центра Земли, затем на север до широты Беллингема, штат Вашингтон.

Если поверхность Земли в Беллингеме выпуклая, угловые измерения в десятичных градусах от Гринвича и экватора станут немного больше. Если поверхность в Беллингеме будет понижена, углы станут немного меньше. Это два примера того, как координаты меняются в зависимости от датума.

Связанные темы

Оставить отзыв по этой теме? Модель сегментации эллипсоида

для анализа пакетов трехмерных конфокальных изображений с ослабленным светом флуоресцентных многоклеточных сфероидов

Abstract

В онкологии двумерные модели культивирования in vitro являются стандартными испытательными площадками для открытия и разработки методов лечения рака, но в последние десятилетия появились доказательства того, что такие модели имеют низкую прогностическую ценность с точки зрения клинической эффективности.Поэтому они все чаще дополняются более физиологически релевантными 3D-моделями, такими как культуры сфероидных микроопухолей. Если применяются подходящие флуоресцентные метки, наборы конфокальных трехмерных изображений могут характеризовать структуру таких объемных культур и, например, пролиферацию клеток. Однако ряд проблем мешают точному анализу. В частности, ослабление сигнала в ткани сфероидов препятствует получению полного изображения для сфероидов диаметром более 100 микрометров.А количественный анализ больших наборов данных 3D-изображений является сложной задачей, вызывая потребность в методах, которые можно было бы применять в крупномасштабных экспериментах и учитывать препятствующие факторы. Мы представляем надежный, недорогой в вычислительном отношении метод 2.5D для сегментации сфероидных культур и для подсчета пролиферирующих клеток в них. Предполагается, что сфероиды имеют форму приблизительно эллипсоида. Они идентифицируются по информации, представленной в проекции максимальной интенсивности (MIP) и соответствующем виде высоты, также известном как Z-буфер.Он предупреждает пользователя о невозможности компенсации потенциальных факторов, вносящих смещение, и включает компенсацию затухания сигнала.

Образец цитирования: Barbier M, Jaensch S, Cornelissen F, Vidic S, Gjerde K, de Hoogt R, et al. (2016) Модель эллипсоидной сегментации для анализа ослабленных светом трехмерных конфокальных стеков изображений флуоресцентных многоклеточных сфероидов. PLoS ONE 11 (6): e0156942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942

Редактор: Томас Абрахам, Медицинский колледж Херши штата Пенсильвания, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ

Поступила: 4 сентября 2015 г .; Одобрена: 23 мая 2016 г .; Опубликовано: 15 июня 2016 г.

Авторские права: © 2016 Barbier et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Файл S1 доступен в качестве вспомогательной информации. Описанные файлы Data_3, Data_4, Data_5 и Data_6 доступны в репозитории данных Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7).

Финансирование: Авторы MB, SJ, FC, RH, RG, EG и YTC были профинансированы фармацевтическими компаниями Janssen из Johnson & Johnson.Авторы SV и KG были поддержаны совместным предприятием Innovative Medicines Initiative в рамках Соглашения о гранте № 115188, ресурсы которого состоят из финансового вклада Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 / 2007–2013) и взносов натурой от Европейской Федерации. фармацевтических производств и ассоциаций. Спонсоры предоставили авторам поддержку в виде заработной платы, но не сыграли никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: У авторов этой рукописи есть следующие конкурирующие интересы: MB, SJ, FC, RH, RG, EG и YTC были сотрудниками Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson & Johnson. Авторы подтверждают, что это не влияет на их приверженность всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Успешность открытия и разработки лекарств в онкологии составляет всего 6% [1].Традиционные модели, используемые для тестирования онкологических препаратов, представляют собой однослойные культуры опухолевых клеток, выращенные на стеклянных и пластиковых подложках. Эти модели сильно отличаются от поведения солидной опухоли in vivo. Для сравнения, считается, что 3D-культуры более точно имитируют микроокружение опухоли [2], поскольку они допускают более сложные взаимодействия между раком и стромальными клетками и подвергают клетки воздействию более реалистичных механических сил. Исследования продемонстрировали важные различия в профилях транскрипции [3] и чувствительности к лекарствам [4-8] между 2D и 3D системами клеточных культур.Недавний обзор см. В [9]. Консорциум PREDECT нацелен на валидацию различных трехмерных моделей клеточных культур путем сравнения их гистологии и экспрессии белка с результатами, обнаруженными в образцах пациентов [10].

Важной категорией таких моделей являются сфероидальные микротопухоли, выращенные в матриксе, таком как Matrigel ^®, с присутствием поддерживающих стромальных клеток или без них. Обычно раковые клетки высевают во внеклеточный матрикс в каждую лунку микротитратора, и со временем развиваются множественные сфероиды разных размеров.Эти трехмерные многоклеточные сфероидные модели более точно отражают градиенты питательных веществ, кислорода и лекарств, которые могут быть обнаружены в опухоли, воспроизводя гипоксические, пролиферативные, апоптотические и некротические области [11, 12]. Подходящие красители или антитела могут быть применены для обнаружения этих областей / процессов, но точная количественная оценка пространственного распределения в трехмерном сфероиде по отношению к размеру сфероида является сложной задачей.

Значительные качественные различия могут быть обнаружены визуальной оценкой микрофотографий.Но точная и воспроизводимая количественная оценка статистически значимых различий требует автоматизированного анализа изображений, особенно в крупномасштабных исследованиях. Чтобы извлечь всю пространственную информацию из трехмерного образца, необходимо применить анализ трехмерного изображения, но это дорогостоящий процесс. Более того, разрешение изображения в осевом направлении намного хуже, поэтому получение информации ограничено, если рассматривать ось z как эквивалентную другим. Чтобы обойти это, многие методы применяют гибридную форму, известную как 2.5D анализ [13, 14]. Обычно двухмерная проекция, которая сама по себе жертвует всей информацией о глубине, сочетается с методом извлечения и хранения ограниченного количества информации о глубине. Чтобы получить значимую информацию из анализа изображений 2.5D, эти методы должны включать допущения, позволяющие экстраполяцию обратно в трех измерениях. Ортогональная проверка с использованием независимо генерируемой «основной истины» важна для гарантии того, что анализ в достаточной степени представляет исходный набор данных.

Для точного выделения количественных характеристик в качестве отправной точки требуются изображения адекватного качества. Получение таких наборов данных трехмерного изображения осложняется рядом проблем, которые менее важны или отсутствуют в настройке 2D. К ним относятся сферические и хроматические аберрации (которые для ограниченной толщины образца обычно корректируются в конструкции объектива), плохое осевое разрешение, фотообесцвечивание и фототоксичность во время длительного сбора данных, а также поглощение и рассеяние света, приводящие к ослаблению сигнала в глубине образца.В этой статье мы сосредоточимся на том, как устранить экспериментальные ошибки, связанные с ослаблением света.

Во многих приложениях можно уменьшить влияние ослабления света. Перед визуализацией образцы тканей можно очистить химическим способом, используя такие монтажные среды, как SeeDB [15], Clarity [16], ClearT [17] или Scale [18]. Поскольку эффекты рассеяния света уменьшаются на более длинных волнах, качество изображения значительно улучшается с помощью многофотонной микроскопии, в которой используется возбуждающий инфракрасный свет, проникающий глубже в ткань [19].Флуоресцентная микроскопия со световым слоем снижает влияние ослабления света за счет освещения и измерения образца под разными углами [20, 21]. Однако большинство этих технологий несовместимо со средней и высокой производительностью экспериментов на сотнях или тысячах образцов. В настоящее время их необходимо выполнять с использованием стандартных формирователей изображений с высоким содержанием контента и микротитровальных планшетов. Это ограничивает возможности конфокальной микроскопии с вращающимся диском, использование дальних красных красителей и применение программных методов для коррекции ослабления света после сбора данных [22, 23].

Доступны разнообразные инструменты для анализа флуоресцентных изображений трехмерных сфероидных культур, такие как количественная оценка используемых здесь маркеров пролиферации. Инструменты анализа изображений общего назначения включают как коммерчески доступные пакеты, такие как Imaris (Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com) и Volocity (PerkinElmer, Inc., США), так и свободно доступные программные инструменты с открытым исходным кодом, такие как FIJI. (ImageJ) [24] и ICY [25]. Более того, в контексте обнаружения многоклеточных сфероидов и флуоресцентных пятен существует множество инструментов, совместимых с высокопроизводительным анализом и предназначенных для конкретных задач: Amida (морфология сфероидов) [26], AnaSP (объем сфероидов) [13], MINS (ядерный сегментация) [27], CellSegm (общая сегментация) [28], smart 3D-FISH (обнаружение пятен) [29] и goIFISH (обнаружение пятен) [30].Однако на сегодняшний день нет инструмента анализа, который рассматривал бы затухание сфероидного сигнала и мог бы использоваться с высокой пропускной способностью. В этой статье представлен метод анализа изображений 2.5D для культур трехмерных сфероидов, подходящий для данных Z-стека, полученных с помощью конфокальных формирователей изображений с высоким содержанием. Наш метод сегментирует весь трехмерный сфероид и обнаруживает внутри него отдельные помеченные клетки. Эти клетки окрашиваются определенным маркером, например маркером пролиферации клеток, таким как EdU. Его удобно применять в экспериментах со средней производительностью для оценки роста раковых клеток в различных условиях культивирования и лечения.Производительность предлагаемого подхода сравнивается с простым методом 2D-анализа MIP и полным 3D-анализом, выполненным с помощью Bitplane Imaris.

Результаты и обсуждение

Предлагаемый метод анализа состоит из двух основных частей: сегментация раковых сфероидов и идентификация положительных клеток на основе флуоресцентного мечения, присутствующего во всех раковых клетках и специфическом маркере, соответственно. Оба они подробно описаны в следующих разделах. В нашем примере набора данных раковые клетки помечены RFP, а специфическим маркером является EdU, маркер пролиферирующих клеток, как подробно описано в разделе «Материалы и методы».Параметры и выходные характеристики метода приведены в таблицах 1 и 2.

Сегментация многоклеточных сфероидов

Первый шаг — это двухмерная сегментация сфероидов на проекциях максимальной интенсивности (MIP). Затем к сегментированным двумерным сфероидальным маскам добавляются эллипсы. Наконец, эти эллипсы экстраполируются на трехмерные эллипсоиды. Процедура предполагает, что стопки трехмерных изображений корректируются на неравномерное фоновое освещение, чтобы устранить любое систематическое смещение в представлении высоты фоновых пикселей, а расстояние между двумя последующими срезами (часто называемое z-шагом) должно быть меньше, чем средний диаметр ячейки.

2D сегментация.

На рис. 1 показаны концепции MIP и соответствующего вида в высоту. В каждой координате (x, y) мы получаем максимальное значение интенсивности и координату z соответствующего воксела. Для основной сегментации сфероидов, которая проиллюстрирована на рис. 2, мы сначала выбираем локально однородные области с высоты (показано на 2 (b)) [31]. Такие области соответствуют пикселям объекта (сфероида), в то время как фоновые пиксели имеют тенденцию быть более случайными по координате z.Путем применения фильтра диапазона, который вычисляет для каждого пикселя максимальную разность интенсивности соседних пикселей в пределах диапазона радиуса r _{, получается мера локальной неоднородности, как показано на фиг. 2 (C). На рис. 2 (E) показана гистограмма разницы высот на рис. 2 (C), что указывает на то, что большое количество пикселей при более низких значениях принадлежит сфероидальным областям. Применение порогового значения max _z-range к изображению на фиг. 2 (C), значение, определяемое протяженностью первого пика в гистограмме, приводит к отделению объектов от фона.Наконец, результирующие объекты переднего плана идентифицируются с помощью маркировки связанных компонентов. Другой порог min _MIP, определяемый средним значением фоновой интенсивности MIP, применяется к средней интенсивности каждого объекта в MIP, чтобы гарантировать, что обнаруженные объекты имеют ожидаемую минимальную интенсивность флуоресценции, характерную для сфероидов. Применение такого порога предотвращает обнаружение ложных объектов.}

Рис. 1. MIP и соответствующий вид по высоте.

Проекция с максимальной интенсивностью (MIP) и высота изображения показаны (ab), а для одной плоскости xz из изображения (c) указывается (красными / белыми квадратами), откуда произошли пиксели, то есть, какие координаты z дали наибольшую интенсивность.Соответствующие z-значения отображаются в виде высоты, а интенсивности пикселей отображаются в MIP. Когда два сфероида перекрываются в боковом направлении, MIP покажет сфероид с наибольшей интенсивностью.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g001

Рис. 2. Сегментация сфероидов в 2D.

(a): часть проекционного изображения максимальной интенсивности канала RFP стека трехмерных изображений, (b): соответствующий вид высоты, (c): после применения фильтра диапазона к виду высоты, дающего локальную дисперсию в z-глубина, где яркие (темные) пиксели указывают фоновые (сфероидные) области, (d): гистограмма (a), показывающая, что передний план не может четко различаться, (e): гистограмма (c), показывающая разделение между передний план и задний план возможны.(f) после сегментации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g002

Подгонка эллипсов к двумерным сфероидальным маскам.

Подгонка эллипсов к сфероидам, сегментированным в 2D, выполняется путем минимизации среднеквадратичной ошибки разницы с сегментированной 2D-маской. На этом этапе мы предполагаем, что эллиптические сфероиды проверены путем измерения округлости 2D-масок сегментации сфероидов. Сфероидные маски с низкой двумерной округлостью не имеют формы двумерного эллипса и не приведут к удовлетворительной подгонке трехмерного эллипсоида.Может быть несколько причин, помимо фактической неправильности формы сфероида, которые могут способствовать созданию неправильных 2D-масок. К ним относятся сфероиды, которые не полностью видны в MIP, потому что они закрыты другими более яркими сфероидами, и сфероиды, которые были неправильно сегментированы на этапе 2D сегментации, например, путем слияния двух сфероидов. Поскольку эти сфероиды могут привести к неправильной маске трехмерной сегментации, они отфильтровываются на основе их двумерной округлости.

Приближение трехмерного эллипсоида.

Затем трехмерный эллипсоид соответствует каждому из двумерных эллипсов. Применяя эту процедуру, мы предполагаем, что сфероид имеет эллипсоидальную форму, которая либо близка к сферической, либо удовлетворяет менее строгому условию, что две оси эллипсоида ориентированы в плоскости xy. Первый случай применим к сфероидам, культивируемым в гомогенной матрице, а второй случай может иметь место для сфероидных культур, засеянных слоем, зажатым между двумя матрицами.Поскольку мы предполагаем, что 3-я ось эллипсоида расположена вдоль оси z, необходимо оценить положение центра эллипсоида и длину 3-й оси. (X, y) -координаты центра эллипсоида в 3D предполагаются как (x, y) -координаты центра 2D-эллипса, z-координаты центра и эллипсоида 3 ^rd. Длина оси определяется профилем интенсивности по вертикальной оси. На рис. 3 показаны полученные подобранные эллипсоиды для стека изображений трехмерной культуры сфероидов.Теперь также можно оценить объем сфероида.

Рис. 3. Подгонка трехмерных эллипсоидов.

(a) Сегментированные сфероиды в 2D, наложенные на MIP. (b-c) Эллипсоиды, подогнанные к маске сфероида на (a). Проекции центральных срезов сфероидов с (b) верха (плоскость xy) и (c) стороны (плоскость xz) показаны наложенными на подогнанные эллипсоиды.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g003

Определение анализируемой области эллипсоида.

Имеется убывающий градиент интенсивности от поверхности к центру сфероида. Следовательно, клетки могут быть идентифицированы неправильно. Эта проблема проиллюстрирована на рис. 4 (A), где xy- и xz-срезы через центр сфероида показывают типичное распределение интенсивности из-за ослабления сигнала. Обратите внимание, что сигнал канала EdU также снижается в нижних частях сфероида, что делает невозможным обнаружение EdU-положительных клеток в этой области. Также обратите внимание, что ослабление сигнала из-за визуализации глубоких тканей — не единственная причина деторирования сигнала.При использовании, например, точечных сканирующих микроскопов, другие факторы, такие как фотообесцвечивание, также могут стать существенными.

Рис. 4. Затухание света в многоклеточных сфероидах.

(a) Вид сверху в плоскости xy сфероида с подогнанным эллипсоидом, где показаны каналы RFP (561 нм), Hoechst (405 нм) и EdU (640 нм). (б) Тот же сфероид, вид сбоку (плоскость xz). Сигнал от нижней части сфероида не обнаруживается (если предположить, что сфероид имеет эллипсоидальную форму).(c) Параметры сфероида, полученные из вертикальной кривой профиля RFP-сигнала через центр эллипсоида: верхняя z-координата, максимальная интенсивность, анализируемая глубина (соответствует заданному пользователем минимальному проценту интенсивности).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g004

Поскольку все клетки сфероидов несут стабильный флуоресцентный маркер (таким образом, предполагается, что он постоянный в пределах одного сфероида), их вертикальный профиль интенсивности через центр сфероид можно использовать как меру ослабления сигнала.Действительно, постепенное снижение стабильного сигнала маркера (здесь соответствует сигналу RFP) с увеличением глубины в сфероидной ткани наблюдается на Фиг.4 (C). Чтобы измерить максимальную глубину сфероида, до которой могут быть точно обнаружены положительные клетки, мы предполагаем, что ослабление конкретного флуоресцентного маркера сопоставимо с ослаблением стабильного маркера. Когда длины волн обоих каналов существенно не различаются, это разумное предположение. Учитывая заданное пользователем значение минимального процента интенсивности, которое должно сохраняться после ослабления сигнала, мы можем определить глубину анализируемой области сфероида (см. Раздел «Материалы и методы»).

Анализируемая глубина впоследствии сравнивается с вертикальным диаметром сфероида. Выявлены три различных случая (как показано на рис. S1):

Виден весь сфероид. На результаты не влияет ослабление света.
Видно более половины сфероида. Верхнее полушарие эллипсоида будет проанализировано, а результаты экстраполированы на нижнюю половину, предполагая аналогичные характеристики.
Видно менее половины сфероида.Сфероид не может быть проанализирован, потому что положительное количество клеток не может быть экстраполировано с поверхности сфероида на ядро, где, как ожидается, доступность кислорода и питательных веществ будет различной [11].

Поскольку только половина сфероида должна быть видна, предлагаемая нами процедура анализа расширяет окно размеров сфероидов, которые могут быть проанализированы, позволяя диаметрам быть примерно вдвое больше. Кроме того, будут идентифицированы сфероиды, которые слишком велики для полного анализа (например, случай 3), и их можно будет исключить из анализа образца.В случае, если необходимо исключить значительное количество сфероидов, предлагаемый анализ больше не подходит, и необходимо использовать другие типы анализа культур сфероидных клеток.

Проверка аппроксимации эллипсоида.

Для того, чтобы протестировать предложенный этап 2D сегментации, мы сравнили результаты автоматизированной и ручной 2D сегментации данных, оценив чувствительность обнаружения сфероидов и точность полученных контуров, как подробно описано в разделе «Материалы и технологии». Раздел «Методы».MIP 8 стопок изображений были вручную сегментированы, как описано в разделе «Материалы и методы», и мы обнаружили среднюю точность 0,911 ± 0,066 и чувствительность 0,928 в пределах 95% доверительного интервала [0,909, 0,944]. Чувствительность сильно зависит от порога min _MIP, а также от того, относится ли сегментированный контур к категории сфероидов или шумов, особенно для сфероидов, средняя интенсивность которых близка к фоновой. На фиг. S2 (A) и S2 (B) мы построили график чувствительности и соотношения ложных срабатываний (FP) и их интервала оценки Уилсона как функции порога интенсивности min _MIP.Чувствительность уменьшается вместе с количеством ложных срабатываний с увеличением порога, поэтому при установке порогового значения следует учитывать определенный компромисс. S2 (C) и S2 (D) Фиг. Иллюстрируют среднюю интенсивность сфероида как функцию различных категорий, указывая на то, что контуры сфероида, классифицированные как ложноположительные (FP), обычно имеют низкую интенсивность. Точность контуров сегментации сфероидов, которые определены в GT как «хорошо разделенные сфероиды», значительно высока (точно совпадающий контур имеет точность, равную 1) и показывает, что неоднородность изображения высоты является допустимой. мера для сегментации этого типа клеточных культур.

Сфероиды, перекрывающиеся в MIP, не подходят для анализа (как показано на рис. 5 (A)). Поскольку ожидается, что округлость перекрывающихся сфероидов будет ниже, идентификация сфероидов с небольшим значением округлости позволит удалить большинство из этих объектов. Чтобы проверить, действительно ли существует корреляция между перекрытиями и округлостью сфероидов, округлость, определенная с помощью двухмерной маски автоматической сегментации, была нанесена на график относительно различных классов GT, то есть хорошо разделенных сфероидов (красный), смежных сфероидов (голубой) и перекрывающиеся сфероиды (зеленые) на рис. 5 (B), где заметное уменьшение округлости можно наблюдать в перекрывающихся сфероидах (p ***).

Рис. 5. Проверка алгоритма сегментации эллипсоида.

(a-c) Классификация сфероидов, скрытых другими в данных GT, сравнивается с автоматической идентификацией этих сфероидов на основе округлости 2D-масок сфероидов. (а) иллюстрирует типичную ситуацию, когда форма двумерной маски сфероида не эллиптическая, потому что сфероид перекрывается с другим (более ярким), зеленая пунктирная линия показывает GT-контур сфероида, а сплошные контуры являются результатом автоматического сегментация.(b) показывает округлость сфероида, полученную в результате автоматической сегментации, как функцию класса сфероида в GT, где различные классы заданы карикатурой на оси x, представляющей хорошо разделенные (красный), смежные (синие) или перекрывающиеся (темно-зеленые) сфероиды. (c) показывает процент правильно сегментированных пикселей с помощью автоматической сегментации как функцию округлости для класса хорошо разделенных (красный) и перекрывающихся (зеленый) сфероидов. (d) показывает сфероиды разных размеров, которые классифицируются в соответствии с их анализируемой областью: анализируется весь, более половины или менее половины сфероида (категория видимости).Над полосами отображается количество сфероидов для каждой категории видимости. Метки большой (синий), средний (красный) и маленький (зеленый) соответствуют сфероидам с количеством ячеек больше 200, от 50 до 200 и меньше 50 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g005

Чтобы убедиться, что порог округлости удаляет перекрывающиеся сфероиды, доля правильно сегментированных пикселей сфероидных масок была построена как функция их округлости для каждого сфероида. и помечены ручной классификацией наземной истины на Рис. 5 (C).Корреляция между ними очень значима (p ***) с расчетным значением r = 0,70 и доверительным интервалом [0,64, 0,75]. MANOVA, примененный к данным, показывает, что распределения двух показанных классов сфероидов значительно различаются (p ***). Рисунок далее показывает, что применение порога округлости действительно удаляет большинство перекрывающихся сфероидов. В качестве нежелательного побочного эффекта этого фильтра были удалены некоторые хорошо разделенные, но неэллиптические структуры. Они могут представлять собой инвазивные сфероиды, а не компактные микропухоли, и исключаются из анализа.На фиг. S5 указано происхождение сфероидов, которые опущены из-за слишком низкой округлости. Для рассматриваемых наземных истинных изображений было пропущено менее 20% сфероидов, в основном из-за того, что они были затемнены во время построения изображения.

Наконец, на рис. 5 (D), взаимосвязь между размером сфероида и ослаблением света проиллюстрирована с использованием набора образцов, содержащего контроль и культуры, обработанные SOC (стандарт лечения), как описано в разделе «Материалы и методы». Как и в предыдущем разделе, сфероиды были разделены на группы по 100%, более 50% или менее 50% видимых сфероидов.В то время как стандартный метод анализа изображений 2D MIP может анализировать сфероиды только в первой категории 100% видимости, наш подход также позволяет количественно определять сфероиды, принадлежащие ко второй категории (> 50%), которая в этом случае содержит примерно 25% от общего количества сфероидов, как видно из подсчета сфероидов для каждой категории видимости.

Идентификация клеток, положительных по данному ядерному маркеру

Клетки, положительные по данному ядерному маркеру, обнаруживаются либо с помощью дорогостоящего в вычислительном отношении 3D, либо с помощью быстрого 2.Алгоритм 5D точечного обнаружения на основе MIP и высоты изображения соответствующего флуоресцентного канала. Предполагается, что разрешения достаточно для разрешения отдельных ядер, которые физически разделены цитоплазмой (как показано в S1 Movie). В обоих подходах маркерные положительные пятна обнаруживаются с использованием фильтра Лапласа гаусса (LoG) в масштабе ожидаемого размера ядра, который показывает координаты пятен на исходном изображении как локальные минимумы. Параметр максимального радиуса пятна устанавливается так, чтобы разрешить слияние нескольких локальных минимумов, происходящих внутри ядра, при сохранении различия между отдельными ядрами.Оптимальный масштаб для ожидаемого размера ядер определяется заранее с помощью 2D MIP. Общая суммарная интенсивность LoG MIP максимизируется за счет оптимизации параметра масштаба, от одной десятой максимального радиуса пятна до самого значения. Кривая общей суммарной интенсивности как функция параметра масштаба показана на S3 Fig. После этого пятна фильтруются на основе их интенсивности, с порогом, равным средней интенсивности сфероида в MIP (в результате получается один порог для каждого изображения). .В качестве примера результаты подхода показаны на панели (b) S3 Fig, где красные кружки представляют обнаруженные EdU-положительные клетки. Для алгоритма обнаружения пятна 2.5D исходный стек изображений заменяется его 2D MIP, и z-координата пятна получается из обзора высоты.

Применение подхода к изучению распространения

Мы применили предложенный нами алгоритм для анализа изображений пролиферирующих клеток в трехмерных сфероидных культурах, продемонстрировав его эффективность на частично ослабленных стеках изображений.Это изображения культур клеток многоклеточного сфероидного рака предстательной железы, обработанных в течение 17 дней цитотоксическим соединением (доцетаксел) или цитостатическим соединением (MDV-3100). Как показано на фиг. 6, опухолевые клетки были помечены RFP, стромальные клетки — GFP, а красители Hoechst и EdU были применены для идентификации ядер и пролиферирующих клеток соответственно. Анализировали объем сфероида и количество EdU-положительных клеток на сфероид. Объем и количество EdU-положительных клеток на сфероид в конечной точке эксперимента показаны для культуры раковых клеток PC346-c для обоих соединений (фиг. 7A и 7B).Под действием доцетаксела уменьшается как объем, так и количество EdU-положительных клеток на сфероид. Общее количество EdU-положительных клеток на объем изображения (четыре разных поля были отображены в лунке для образца), показанное на фиг. 7 (C), дополнительно указывает на то, что обработка доцетакселом снижает общее количество EdU-положительных клеток в культуре.

Рис. 6. Данные примера анализа распространения.

(а): Схема маркировки используемых клеток и красителей. (b-c): изображение 3D культуры раковых клеток in vitro, меченных / окрашенных EdU, RFP, GFP и Hoechst.Показана проекция максимальной интенсивности.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g006

Рис. 7. Сравнение предложенного метода анализа с базовым методом анализа 2D MIP.

Пролиферация культуры сфероидных клеток, количественно определенная с помощью EdU-положительных клеток, из трехмерной гомогенной сфероидной культуры, обработанной цитотоксическим соединением (доцетаксел, 1e-8 M) и цитостатическим соединением (MDV-3100, 1e-7 M). На (а) показан объем сфероида, а на (b) — количество EdU-положительных клеток на сфероид.В (c) показано общее количество положительных ячеек EdU на объем изображения, где размер точек представляет собой общее соотношение переднего плана / фона MIP стека изображений. В (d) сравнивается количество положительных клеток EdU, основанное как на предложенном, так и на методе анализа 2D MIP. Показана нормализованная разница в EdU-положительных клетках, взвешенная с объемом сфероида.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g007

Сравнение с результатами 2D-анализа.

Важное различие между нашим подходом и стандартным 2D MIP-анализом (как описано в разделе «Материалы и методы») заключается в том, что количество обнаруженных EdU-положительных клеток в большом сфероиде корректируется. Значимость этой разницы показана при сравнении двух подходов на графиках на рис. 7 (D). Как и ожидалось, значительная отличная от нуля разница между двумя подходами обнаружена в обработанных MDV культурах, представляющих культуру с более крупными сфероидами. Предлагаемый нами новый алгоритм корректирует сигналы, потерянные из-за ослабления света, в то время как маленькие сфероиды в основном приводят к тем же результатам.Таким образом, наш подход особенно полезен для сфероидных культур, содержащих изрядное количество более крупных сфероидов в культурах. В частности, это может привести к значительной разнице при сравнении двух образцов, содержащих разные средние размеры сфероидов, больших и малых, например, при визуализации культуры растущих сфероидов в разные моменты времени. Смещение выборки больших сфероидов из 2D MIP-анализа может привести к неточным выводам.

Сравнение с полным 3D-анализом.

Мы сравнили предложенный алгоритм с полным трехмерным анализом, выполненным в широко используемом коммерческом инструменте общего назначения Bitplane Imaris (Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com). Мы сравнили обнаружение пролиферирующих клеток и вычисление объема совпадающих обнаруженных сфероидов. Из-за различий в алгоритмах сегментации перекрытие обнаруженных сфероидов составило 63%. В S4 (A) Fig сравниваются объемы обоих методов. Объем, полученный при полном 3D подходе, в среднем больше, чем в 2.5D подход для маленьких сфероидов, но меньший для больших сфероидов. На панели (b) это проиллюстрировано. Мы предполагаем, что из-за сегментации на основе интенсивности в Imaris очень маленькие сфероиды, как правило, кажутся вытянутыми вдоль z-направления из-за плохого z-разрешения, увеличивая общий объем, в то время как более крупные сфероиды, как правило, не полностью отображаются из-за ослабления сигнала. . Чтобы проверить эту гипотезу, мы построили график сферичности сфероидов как функции их объема на панели (c). Уменьшение подобранной кривой указывает на то, что более крупные сфероиды не сегментированы правильно.Чтобы проиллюстрировать влияние на анализ роста, мы наносим на график разницу между количеством положительных клеток EdU, полученными с помощью нашего подхода и Imaris. Этот график на панели (d) показывает, что для больших сфероидов (где категория видимости меньше 100%) наш подход приводит к большему количеству пятен, что соответствует коэффициенту корреляции (Спирмен), который был равен 0,26.

Чтобы продемонстрировать вычислительное преимущество использования подхода 2.5D, мы рассчитали время для обоих методов (на стандартной рабочей станции с процессором Intel ^® Core ™ i7-3920XM, работающим на скорости 2.9 ГГц и 8 ГБ ОЗУ). Используемые стопки изображений имели размер 1024 x 1256 x 91 пиксель (использовались два 16-битных канала). В Imaris на сегментирование сфероидов и обнаружение пятен уходило в среднем 7 минут. Наш подход 2.5D выполнил это за 3 минуты, а при использовании упрощенного алгоритма обнаружения пятна (на основе MIP и обзора высоты) это сократилось до 1 минуты.

Материалы и методы

Стек изображений многоклеточной сфероидной культуры

Клеточные культуры, использованные для тестирования метода анализа, содержали клетки рака простаты человека LNCaP (ATCC, Роквилл, США) или клетки PC346c (линия клеток рака простаты, полученная из Медицинского центра Erasmus через консорциум PREDECT) и CAF-PF179T фибробласты, ассоциированные с раком человека (линия клеток, полученная из Института Вейцмана через консорциум PREDECT) [32], встроенные в Matrigel ^® (Corning № 356231, лот № 3198769, сниженный фактор роста, без фенолового красного, концентрация: 4 мг / мл).Их суспендировали в матрице и высевали (10000 опухолевых клеток и 1000 стромальных клеток в 60 мкл / лунку) в 96-луночные планшеты (96-луночные черные микропланшеты для культивирования клеток из полистирола с дном μClear ^®; Greiner, # 655090), которые были предварительно покрытый матрицей (30 мкл / лунка). Обработка культур цитотоксическим соединением (доцетаксел) или цитостатическим соединением (MDV-3100) началась на 6-й день, когда культуры находились в экспоненциальной фазе, и эксперимент был завершен на 23-й день, когда необработанные культуры достигли стационарной фазы. .Раковые и стромальные клетки стабильно экспрессировали tRFP и eGFP соответственно. Перед визуализацией культуры клеток окрашивали 10 мкМ EdU в течение 2 часов (Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS; Life Technologies) для обнаружения пролиферирующих клеток и Hoechst 33342 (8,1 мкМ, 30 мин) для мечения всех ядер, а затем фиксировали 4% формальдегид.

Пакеты микроскопических изображений многоклеточных сфероидных культур получали с помощью конфокального вращающегося дискового микроскопа Yokogawa CellVoyager 7000 (Wako Automation, Сан-Диего, США) с использованием UPLSAPO 10x / 0.4 NA и расстояние между срезами в стопке по оси Z 10 мкм. Пары длина волны возбуждения-фильтр, используемые для каналов tRFP, eGFP, Hoechst и EdU, составляли 561 нм — BP 600/37, 488 нм — BP 522/35, 405 нм — BP 447/45 и 640 нм — BP 676/29. , соответственно.

Наземные изображения

Основополагающие данные были сгенерированы для трехмерных гомогенных многоклеточных сфероидных культур рака LNCaP путем ручного рисования двухмерной маски для каждого сфероида на MIP. Более того, каждый сфероид был отнесен к одному из следующих случаев: (1) хорошо разделены, (2) перекрываются с более яркими сфероидами в MIP (делая их неотделимыми), (3) перекрываются с менее яркими сфероидами в MIP (отображая их хорошо отделимы), (4) просто касаясь других сфероидов, и (5) касаясь границы 2D-проекции изображения.Маркировка проводилась с использованием плагина RoiManager в FIJI (ImageJ) [24], в результате чего контуры для случаев (1) — (5) были окрашены в красный, зеленый, пурпурный, голубой и синий цвета соответственно. Эти наземные данные использовались для проверки шага 2D сегментации алгоритма путем определения чувствительности и точности и представлены в файле S2.

Реализация алгоритмов анализа

Анализ стеков изображений проводился с использованием набора инструментов анализа изображений DIPimage (Технологический университет Делфта, Делфт, Нидерланды) для MATLAB ^® (выпуск 2014a, The MathWorks Inc., Натик, США). Алгоритмы доступны в виде пакета сценариев MATLAB в файле S1: исходный код алгоритмов анализа изображений, содержащий как код для генерации фигур, так и реализацию метода. Для запуска предоставленного кода требуется рабочая среда MATLAB с установленным набором инструментов DIPimage и следующие внешние библиотеки: набор инструментов биоформатов для MATLAB, JSONlab и ReadImageJROI. Реализация также доступна на GitHub: https://github.com/mbarbie1/ellipsoids-analysis-paper.мерзавец.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен в R (https://www.r-project.org) с использованием RStudio IDE (https://www.rstudio.com). Данные были проверены на нормальность с использованием критерия Шапиро-Уилкса, значимость была получена с использованием T-критерия Велча и непараметрического U-критерия Манна-Уитни для ненормальных распределений. Чтобы сравнить многомерные распределения, например данные о размере сфероида и количестве пролиферирующих клеток применяли MANOVA. Во всех таких случаях сравнивались только две группы, поэтому приближение F-статистики сводится к статистике T-квадрата Хотеллинга.Значимость обозначена как *: p <0,05, **: p <0,01 и ***: p <0,001.

Получение параметров аппроксимации трехмерного эллипсоида

Координата z центра и длина вертикальной оси берутся из пикселей исходного 3D-изображения. Z-координата центра эллипсоида определяется как среднее значение z-координат внешнего края маски 2D сегментации. Чтобы получить длину вертикальной полуоси эллипсоида, мы рассматриваем окрестность, которая содержит 8 ближайших соседних пикселей центра эллипса ( x _c, y _c) в xy- плоскость и достаточный диапазон (в 2 раза превышающий наибольший диаметр D эллипса) в направлении z:

Усреднение по этой окрестности дает профиль I (z) через центроид маски сегментации двумерных сфероидов (см. Рис. 4 (C)).Координата z вершины сфероида (которая меньше всего страдает от ослабления света) определяется из кривой профиля как координата z над центром сфероида, где кривизна становится нулевой (точка перегиба). Когда двумерная маска рассматриваемого сфероида имеет область ниже определенного порогового значения min _{и радиуса}, вышеупомянутый подход не используется; вместо этого длина вертикальной оси аппроксимируется средней длиной осей эллипса в плоскости.

Характеристика затухания сигнала в сфероидах

Глубина, до которой сфероид поддается анализу, ограничена ослаблением сигнала в ткани сфероида.Мы вычисляем максимальную глубину (координату z) в сфероиде, для которой определенный пользователем процент интенсивности все еще сохраняется после ослабления сигнала. Чтобы получить эту глубину, мы предполагаем, что: (1) флуоресцентное окрашивание опухолевых клеток является постоянным в пределах каждого сфероида, (2) коэффициенты рассеяния и поглощения, определяющие ослабление сигнала, постоянны внутри сфероидной ткани и равны нулю снаружи, и (3) ) значения интенсивности первого среза сфероида не имеют затухания.

Ожидается, что затухание сигнала будет наибольшим в (x, y) -центре эллипсоида для каждой координаты z. Поэтому вертикальный профиль интенсивности через центр эллипсоида используется для характеристики затухания сигнала. Профили интенсивности I ( z ) определяются, как описано в предыдущем разделе (см. Рис. 4 (C)). Обычно они имеют крутой наклон к одному максимуму I _max = max _z I ( z ) около вершины сфероида, за которым следует уменьшение интенсивности.Мы рассматриваем I _max как интенсивность без затухания, а процент, оставшийся после затухания, определяется как P _att ( z ) = 100 I ( z ) / I _max . Заданный пользователем порог минимального сохраняемого процента P _min приводит к диапазону [ z _max, z _{анализируемому}], для которого P _att ( z )> P _мин действителен.Анализируемая глубина сфероида определяется как расстояние между первой z-координатой сфероида и z _{анализируемым}.

Другие методы анализа, использованные для сравнения

Для сравнения использовались двухмерный MIP-анализ, а также полный трехмерный анализ. Оба подхода подробно описаны ниже.

Базовый метод анализа 2D MIP.

Для 2D-анализа пролиферации в тестовых данных был применен следующий подход к анализу изображений: Аналогично предложенному алгоритму была получена 2D-маска сегментации MIP RFP-канала, после чего EdU-положительные клетки были идентифицированы с помощью 2D-изображения. Алгоритм точечного обнаружения выполняется на канале EdU.Но, в отличие от предложенного анализа, все EdU-положительные клетки в 2D-областях сфероидных масок считаются принадлежащими соответствующим сфероидам, и никакой коррекции ослабления сигнала не предпринималось.

Рабочий процесс полного трехмерного анализа

Imaris.

Анализ изображений был проведен с использованием функции извлечения клеток из ImarisCell, компонента Bitplane Imaris (v8.1.2, Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com), где «сфероиды и пролиферирующие клетки» переводятся как « клетки и клеточные везикулы ».Сфероиды были сегментированы с помощью инструмента для извлечения поверхности, и были извлечены морфологические особенности поверхностей сфероидов. Пролиферирующие клетки выявляли с помощью прибора для точечного обнаружения. Впоследствии обнаруженные поверхности и пятна были импортированы в модуль анализа клеток для определения границ сфероидов и пролиферирующих клеток. Наконец, были экспортированы характеристики, относящиеся к расположению сфероидов и количеству пролиферирующих клеток. В заключение отметим, что, хотя существует метод коррекции ослабления для однородного ослабления сигнала (через модуль Imaris ImarisXT), наши сфероидные культуры в значительной степени неоднородны, и этот метод нельзя применять.

Чувствительность и точность маски 2D сегментации

Чтобы количественно оценить отклонение автоматизированной сегментированной маски от наземного истинного изображения, мы сравниваем области двухмерного сегментированного изображения R _GT = { M _j} наземного истинного изображения с областями R _A = { m _i}, найдено с помощью автоматической сегментации. Для каждой области M _j мы ищем соответствующую область m _i, которая перекрывается с M _j более чем на 50%.Области M _i, для которых не найдена соответствующая область, считаются ложноотрицательными (FN), в то время как области m _i не принадлежат области наземной истинности M _j являются ложными срабатываниями (FP). Чувствительность определяется соотношением: TP / (TP + FN), где TP означает истинные положительные результаты. Ошибка чувствительности определяется доверительным интервалом, определенным Уилсоном, так называемым интервалом оценки Уилсона [33].

Для истинно положительных результатов (сегментированные области м _и, которые принадлежат наземной области истинности в соответствии с вышеуказанным критерием) точность сегментации может быть определена количественно путем назначения штрафа, определяемого тем, насколько близки контуры двух областей. . Это делается следующим образом: расстояние пикселей областей м _i \ M _j (включая все пиксели из м _i, не принадлежащие M _j) и M _j \ m _i, от контура области M _j рассчитывается, используя расстояние изображения (в мкм) контурной маски M _j, которая взвешивает вклад ошибки неправильно классифицированных пикселей.Сигмоидальная функция f ( x ) = 1 / {1 + exp [- k ( x — x ₀)]} с x ₀ = 1,5 мкм и k = 2 мкм К этому расстоянию применяется ^-1, так что очень маленькие ошибки в контуре сфероида мало влияют на оценку ошибки, но большие ошибки имеют постоянный вес. Затем пиксели суммируются и нормализуются путем деления на площадь целевой области. Результирующий штраф e _i близок к нулю для почти перекрывающихся сфероидальных масок, а точность сфероидной маски m _i может быть определена как 1 — e _i.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Связь между категориями видимости и размером сфероида.

Слева направо показаны сфероиды уменьшающихся размеров как представители различных категорий видимости: измерить можно менее половины сфероида, более половины или весь сфероид. Показаны xy- и xz-срезы в середине сфероидов, наложенные белыми пунктирными контурами эллипсоидов (которые были подогнаны вручную). В плоскостях xz нарисованный вручную тонкий пунктирный контур показывает приблизительную границу анализируемой области сфероидов.По мере уменьшения размера сфероида функция рассеяния точки (PSF) конфокального микроскопа приводит к искажению сферической формы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s001

(TIF)

S2 Рис. Зависимость чувствительности сегментации от порога интенсивности min

_MIP.

(a-b) Зависимость чувствительности, отношения FP / P и их 95% доверительного интервала (Wilson) от порога, установленного для средней интенсивности сегментированных сфероидов (мин. _MIP).(c) Показывает среднюю интенсивность каждого сфероида как функцию их категории сегментации: истинные положительные результаты (красный), ложные положительные результаты (зеленый), сфероиды, пропущенные при сегментации (синий), маски сегментации, объединяющие несколько сфероидов в GT (пурпурный), и сфероиды, которые обнаруживаются как множественные маски сфероидов (коричневые). (d) Представляет количество сфероидов для каждой из категорий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s002

(TIF)

S3 Рис. Обнаружение пятен в пространстве шкалы.

Шаги обнаружения пятна показаны на примере стека изображений в файле Data_3, который доступен от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7). (a) показывает общую сумму интенсивности пикселей MIP-изображения, отфильтрованного LoG, как функцию параметра гауссова масштаба σ (параметр сглаживания). Значение σ, которое максимизирует общую сумму яркости пикселей (отрицательного LoG), представляет собой оптимальный масштаб σ для обнаружения пятна. (b) показывает визуальное сравнение результатов обнаружения пятна, происходящего из подхода 3D LoG, используемого в нашем подходе (красные кружки), и обнаружения трехмерного пятна, рассчитанного с использованием Bitplane Imaris (синие кружки).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s003

(TIF)

S4 Рис. Сравнение предложенного метода анализа с подходом к анализу в полном 3D (с использованием Bitplane Imaris).

(a) полученный объем сфероида как для полного трехмерного метода (синие точки), так и для нашего подхода (красные точки) показан для соответствующих сфероидов. (b) отношение объема, полученного от Imaris, к объему, полученному с помощью нашего подхода, вместе с линейной аппроксимацией данных. На панели (c) сферичность сферических поверхностей, полученных в Imaris, представлена как функция объема.Здесь получается нелинейная аппроксимация. (d) разность количества пролиферирующих клеток, полученная с помощью нашего подхода, с теми, которые получены в Imaris, нанесены на график, где цвета соответствуют категории видимости: 100% (красные точки) и> 50% (зеленые точки). Для этих образцов не было сфероидов с видимостью <50%.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s004

(TIF)

S5 Рис. Сфероиды опущены при аппроксимации эллипсоида из-за неоднородности формы.

Процент сфероидов, которые опущены из-за низкой округлости, классифицируются на сфероиды несферической формы, затемненные сфероиды или неправильно сегментированные сфероиды. В качестве набора данных используются изображения наземной достоверности из файла Data_4, который доступен от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s005

(PNG)

S2 Файл. 2D наземная правда.

Это zip-файл, содержащий вручную сегментированные 2D-маски с метками наземных истинных данных (соответствующие стеки 3D-изображений можно найти в файле Data_4, который доступен в Dryad (doi: 10.5061 / дриада.0м9н7)). Раковые сфероиды (LNCaP) подразделяются на пять различных классов: (1) хорошо разделенные, (2) перекрывающиеся с более яркими сфероидами в MIP (делая их неотделимыми), (3) перекрывающиеся с менее яркими сфероидами в MIP (визуализация он хорошо отделяется), (4) просто касаясь других сфероидов, и (5) касаясь границы 2D-проекции изображения. Открытие изображений в FIJI (ImageJ) с помощью ROI Manager позволяет визуально проверить данные.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156942.s007

(ZIP)

S1 Фильм. Алгоритм обнаружения пятна проиллюстрирован на стеке трехмерных изображений, представленных в виде фильма.

Это стек 3D-изображений из файла Data_6, который доступен в Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7), сохраненный как фильм в формате AVI со сжатием JPEG. Он показывает канал EdU стека трехмерных изображений в файле Data_3, доступном от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7), с положительными ячейками EdU, аннотированными маленькими сферами. Этот фильм может служить примером результата алгоритма обнаружения пятна (3D-версия).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s008

(AVI)

Благодарности

Руководители рабочего пакета и платформы и представители партнеров в IMI PREDECT: Джон Хикман (Institut de Recherche Servier), Майк Бербридж (Institut de Recherche Servier), Эмми Вершурен (Университет Хельсинки), Олли Каллиониеми (Университет Хельсинки), Юха Клефстрём (Университет Хельсинки), Катрин Брискен (Федеральная политехническая школа Лозанны), Варда Роттер (Институт науки Вейцмана), Моше Орен (Институт науки Вейцмана), Катарина Брито (Институт экспериментальной биологии и технологии), Джек Соджагик (Radbologia Experimental e Tecnológica) Медицинский центр Университета Неймегена), Гвидо Йенстер (Erasmus MC Rotterdam), Вистке ван Верден (Erasmus MC Rotterdam), Яак Вило (Тартуский университет), Юлия Шулер (Oncotest GMbH), Оути Монни (Biomedicum Genomics Ltd), Саймон Т.Барри (AstraZeneca), Сильвия Грюневальд (Bayer Schering Pharma AG), Пекка Каллио (Orion Pharma), Ханс-Йоахим Мюллер (F. Hoffmann-La Roche AG), Адам Нопора (F. Hoffmann-La Roche AG), Вольфганг Зоммергрубер ( Boehringer Ingelheim International GmbH), Элизабет Андерсон (Boehringer Ingelheim International GmbH), Хайко ван дер Куип (Robert Bosch Gesellschaft fuer medizinische Forschung mbH), Ральф Грэзер (Boehringer Ingelheim International GmbH), Йоланда Т. Чонг (компании Janssen Pharmaceutical ), Рональда де Хугта (фармацевтические компании Janssen из Johnson & Johnson), Мэтью Смолли (Кардиффский университет), Эрвина Богаерта (AbbVie).Далее М. Барбье благодарит авторов набора инструментов DIPimage (Технологический университет Делфта).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SV RH RG YTC EG. Проведены эксперименты: КГ СВ. Проанализированы данные: МБ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: KG RH SV FC SJ EG IMI PREDECT Consortium. Написал статью: MB SJ SV KG RG YTC EG RH.

Список литературы

1. Hay M, Thomas DW, Craighead JL, Economides C, Rosenthal J.Показатели успешности клинических разработок исследуемых препаратов. Nat Biotechnol. 2014; 32 (1): 40–51. pmid: 24406927.
2. Левингер И., Вентура Ю., Ваго Р. Жизнь трехмерна, как и должны быть культуры рака in vitro. Adv Cancer Res. 2014; 121: 383–414. pmid: 24889536.
3. Wrzesinski K, Rogowska-Wrzesinska A, Kanlaya R, Borkowski K, Schwämmle V, Dai J, et al. Культурный разрыв: экспоненциальный рост в классическом 2D и метаболическое равновесие в 3D-средах.PLoS One. 2014; 9 (9): e106973. pmid: 25222612
4. Aljitawi OS, Li D, Xiao Y, Zhang D, Ramachandran K, Stehno-Bittel L, et al. Новая трехмерная модель на основе стромы для тестирования чувствительности лейкозных клеток к химиотерапии in vitro. Лимфома лейка. 2014; 55 (2): 378–91. pmid: 23566162; PubMed Central PMCID: PMC40.
5. Лонгати П., Цзя Х, Эймер Дж., Вагман А., Витт М.Р., Реммарк С. и др. Трехмерные сфероиды карциномы поджелудочной железы индуцируют богатый матрицей, химиорезистентный фенотип, предлагая лучшую модель для тестирования на наркотики.BMC Рак. 2013; 13: 95. pmid: 23446043; PubMed Central PMCID: PMC3617005.
6. Перче Ф., Торчилин В.П. Сфероиды раковых клеток как модель для оценки протоколов химиотерапии. Cancer Biol Ther. 2012. 13 (12): 1205–13. pmid: 228
; PubMed Central PMCID: PMC3469478.
7. Jiguet Jiglaire C, Baeza-Kallee N, Denicolai E, Barets D, Metellus P, Padovani L, et al. Ex vivo культуры глиобластомы в трехмерном гидрогеле сохраняют исходную динамику роста опухоли и подходят для доклинического скрининга лекарственной и радиационной чувствительности.Exp Cell Res. 2014. 321 (2): 99–108. pmid: 24355810.
8. Кошкин В., Аиллес Л.Е., Лю Г., Крылов С.Н. Метаболическое подавление устойчивой к лекарствам субпопуляции в раковых сфероидных клетках. J Cell Biochem. 2015. pmid: 26054050.
9. Хикман Дж. А., Грэзер Р., де Хугт Р., Видик С., Брито С., Гутекунст М. и др. Трехмерные модели рака для фармакологии и биологии раковых клеток: определение сложности опухоли in vitro / ex vivo. Biotechnol J. 2014; 9 (9): 1115–28. pmid: 25174503.
10. Hickman JA. Доведение наркотиков до суда. Int Innov. 2013: 80–2.
11. Тома С. Р., Циммерманн М., Агаркова И., Кельм Дж. М., Крек В. Системы трехмерных культур клеток, моделирующие детерминанты роста опухоли при обнаружении раковых мишеней. Adv Drug Deliv Rev.2014; 69–70: 29–41. pmid: 24636868.
12. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W., Kunz-Schughart LA. Сфероиды многоклеточных опухолей: недооцененный инструмент снова набирает обороты.J Biotechnol. 2010. 148 (1): 3–15. pmid: 20097238.
13. Piccinini F. AnaSP: программный пакет для автоматического анализа изображений многоклеточных сфероидов. Компьютерные методы Программы Biomed. 2015; 119 (1): 43–52. pmid: 25737369.
14. Chen W, Wong C, Vosburgh E, Levine AJ, Foran DJ, Xu EY. Высокопроизводительный анализ изображений сфероидов опухоли: удобное программное приложение для автоматического и точного измерения размеров сфероидов. J Vis Exp. 2014; (89). pmid: 25046278; PubMed Central PMCID: PMC4212916.
15. Ke M-T, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: простой и сохраняющий морфологию агент оптической очистки для реконструкции нейронных цепей. Nat Neurosci. 2013; 16: 1154–61. pmid: 237
16. Чунг К., Уоллес Дж., Ким С.И., Калянасундарам С., Андалман А.С., Дэвидсон Т.Дж. и др. Структурный и молекулярный опрос интактных биологических систем. Природа. 2013. 497 (7449): 332–7. pmid: 23575631; PubMed Central PMCID: PMC40.
17. Куваджима Т., Ситко А.А., Бхансали П., Юргенс С., Гвидо В., Мейсон К.ClearT: метод очистки нейронов и ненейрональных тканей без использования моющих средств и растворителей. Разработка. 2013; 140: 1364–8. pmid: 23444362
18. Хама Х., Курокава Х., Кавано Х., Андо Р., Шимогори Т., Нода Х. и др. Масштаб: химический подход к флуоресцентной визуализации. Nat Neurosci. 2011; 14: 1481–8. pmid: 21878933
19. Helmchen F, Denk W. Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Нат методы. 2005. 2 (12): 932–40. pmid: 16299478.
20. Пампалони Ф, Ансари Н, Стельцер Э.Глубокая визуализация живых клеточных сфероидов с высоким разрешением с помощью флуоресцентной микроскопии на основе световых пластин. Cell Tissue Res. 2013; 352 (1): 161–77. pmid: 23443300.
21. Томер Р., Хайри К., Амат Ф, Келлер П.Дж. Количественная высокоскоростная визуализация целых развивающихся эмбрионов с одновременной мультиэкранной световой микроскопией. Нат методы. 2012. 9 (7): 755–63. pmid: 22660741.
22. Strasters KC. Количественный анализ в цитометрии конфокальных изображений. Кандидатская диссертация. Делфт: Издательство Делфтского университета, 1994.
23. Strasters KC, van der Voort HTM, Geusebroek JM, Smeulders AWM. Быстрая коррекция затухания при флуоресцентной конфокальной визуализации: рекурсивный подход. Биовизуализация. 1994; 2: 78–92.
24. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Нат методы. 2012. 9 (7): 676–82. Epub 2012/06/30. pmid: 22743772; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3855844.
25. де Шомон Ф., Даллонжвиль С., Шенуар Н., Эрве Н., Поп С., Провуст Т. и др.Icy: открытая платформа информатики биоизображений для расширенных воспроизводимых исследований. Нат методы. 2012. 9 (7): 690–6. pmid: 22743774.
26. Харма В., Щуков Х.П., Хаппонен А., Ахонен И., Виртанен Дж., Сиитари Х. и др. Количественная оценка динамических морфологических реакций на лекарства в трехмерных органотипических культурах клеток с помощью автоматического анализа изображений. PLoS One. 2014; 9 (5): e96426. pmid: 24810913; PubMed Central PMCID: PMC4014501.
27. Лу Х, Канг М., Ксенопулос П., Муньос-Дескальцо С., Хаджантонакис А.К.Быстрый и эффективный метод ядерной сегментации 2D / 3D для анализа данных изображений ранних эмбрионов мыши и стволовых клеток. Отчеты о стволовых клетках. 2014. 2 (3): 382–97. pmid: 24672759; PubMed Central PMCID: PMC3964288.
28. Hodneland E, Kogel T, Frei DM, Gerdes HH, Lundervold A. CellSegm — набор инструментов MATLAB для высокопроизводительной трехмерной сегментации ячеек. Исходный код Biol Med. 2013; 8 (1): 16. pmid: 23938087; PubMed Central PMCID: PMC3850890.
29. Gue M, Messaoudi C, Sun JS, Boudier T.Smart 3D-FISH: автоматизация анализа расстояний в ядрах интерфазных клеток путем обработки изображений. Цитометрия А. 2005; 67 (1): 18–26. pmid: 16082715.
30. Трин А., Рай И. Х., Альмендро В., Хелланд А., Русснес Х. Г., Марковец Ф. GoIFISH: система для количественной оценки неоднородности отдельных клеток по изображениям IFISH. Genome Biol. 2014; 15 (8): 442. pmid: 25168174; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4167144.
31. Паркер Д.Л., Чапман Б.Е., Робертс Дж. А., Александр А. Л., Цуруда Дж. С..Повышенная детализация изображения за счет непрерывности в Z-буфере MIP: приложения к магнитно-резонансной ангиографии. J. Магнитно-резонансная томография. 2000. 11 (4): 378–88. pmid: 10767066
32. Мадар С., Брош Р., Буганим Ю., Эзра О., Гольдштейн И., Соломон Х. и др. Модулированная экспрессия WFDC1 во время канцерогенеза и клеточного старения. Канцерогенез. 2009. 30 (1): 20–7. pmid: 18842679; PubMed Central PMCID: PMC2639035.
33. Уилсон ЭБ. Вероятный вывод, закон последовательности и статистический вывод.J Am Stat Assoc. 1927. 22 (158): 209–12.

Shuttle Radar Topography Mission

Наборы данных о высоте местности уровня 2 (цифровые топографические карты)

Наборы данных о высоте местности уровня 2 содержат данные цифровой топографии, обработанные из диапазона C данные, собранные во время миссии.

Каждая публикация в наборе данных о высоте местности уровня 2 представляет собой измерение высоты (публикацию) в метров относительно поверхности эллипсоида WGS84.
Горизонтальная точка отсчета для наборов данных высоты местности уровня 2 является эллипсоидной моделью земли WGS84.
Абсолютная точность по горизонтали (круговая ошибка 90%) составляет 20 метров.
Абсолютная точность по вертикали (линейная ошибка 90%) составляет 16 метров.

Наборы данных состоят из файлов, охватывающих области 5 градусов по широте и 5 градусов по долготе.

Для данных между экватором и 50 градусами широты сообщения размещаются с интервалом 1 дюйм (одна угловая секунда). широта на 1 дюйм долготы.
На экваторе это расстояние примерно 30 на 30 метров.
Для данных за пределами 50 градусов широты сообщения размещаются с интервалом 1 дюйм широты и 2 дюйма долготы. (Поскольку продольное расстояние уменьшается с увеличением широты от экватора, 1 дюйм долготы равен всего около 15 метров на 50 градусах широты.)

Наборы данных случайной ошибки высоты

Наборы данных случайных ошибок высоты содержат оценки случайных ошибок (в метрах) для измерений высоты в наборах данных высоты местности уровня 2.(Случайная погрешность по высоте определяется как компонент ошибки по высоте, которая не коррелирует между разносами по высоте.)

Каждый набор данных о высоте местности уровня 2 будет иметь соответствующий файл набора данных случайных ошибок высоты, охватывающий одну и ту же область по широте и долготе и с сообщениями, зарегистрированными вместе с измерениями высоты.
Наборы данных ортотрансформированных изображений с полосами

Наборы данных полосового ортотрансформированного изображения генерируются во время формирование интерферограммы в процессоре топографии.

Каждый набор данных создается из данных внутренней антенны для одной подполосы; один файл охватывает территорию примерно 60 км в ширину и от 450 до 4500 км (от 1 до 10 минут) в длину. (В настоящее время наборы данных из разных наборов данных или из нескольких регионов одного набора данных не разбиваются на мозаику перед доставкой в NGA.)

Образцы в наборах данных ленточного ортотрансформированного изображения расположены на расстоянии 15 метров на 15 метров и привязаны к локальной системе координат радара.
Систематическая ошибка высоты Модель

Модель систематической ошибки по высоте содержит оценку неслучайной составляющей погрешности по высоте, определенной в ходе послеполетной проверки.
Окончательный отчет о проверке и Глобальная ошибка высоты Модель

Отчет об окончательной проверке документирует алгоритмы оценки ошибок и глобальные характеристики ошибок, определенные на основе всего набора данных.

Модель глобальных ошибок по высоте расширяет модель систематических ошибок по высоте за счет оценки длинноволновых ошибок, которые нельзя определить только по континентальным данным.

Функции MicroRNA-276a в эллипсоидном теле и нейронах грибовидного тела для наивного и условного избегания обоняния у дрозофилы

Введение

MicroRNAs (miRNAs) представляют собой небольшие РНК (∼21–23 nt длиной), которые, как полагают, регулируют до 50% генов на посттранскрипционном уровне путем связывания с комплементарными последовательностями в мРНК-мишенях (Bartel, 2009). MiRNA-опосредованная регуляция стала ключевым механизмом, управляющим синаптической пластичностью (Schratt et al., 2007). Мы демонстрируем роль miR-276a в Drosophila как для наивных реакций на запахи, так и для обонятельных воспоминаний.Мы сосредоточились на этом конкретном гене miRNA, потому что он отображается рядом с одной из мутаций, идентифицированных с помощью прямого мутагенеза для выявления дефектов памяти (Dubnau et al., 2003). Манипулируя пространственной и временной функцией этой miRNA, мы обнаружили сложную роль как в наивных, так и в условных ответах на запах. Мы также демонстрируем, что DopR, рецептор дофамина первого типа, является функциональным нижестоящим эффектором miR-276a.

Павловское обонятельное кондиционирование у Drosophila предоставило мощную систему для исследования генетических и схемных механизмов памяти (Margulies et al., 2005; Кин и Уодделл, 2007; Бусто и др., 2010). Появилась модель, в которой нейроны грибовидного тела (MB) объединяют входные сигналы раздражителя, обусловленного запахом (CS), с входными сигналами нейромодулирующего безусловного стимула. Для аверсивного обучения информация безусловного стимула опосредуется несколькими охарактеризованными дофаминергическими нейронами (Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Krashes et al., 2009; Aso et al., 2010), проецирующимися на нейроны MB. . Формирование всех стадий аверсивной обонятельной памяти (короткой, средней и долговременной) требует экспрессии DopR в МБ (Kim et al., 2007a; Qin et al., 2012). Однако долговременная память (LTM) включает более широкую нервную цепь, потому что CREB-опосредованная экспрессия генов необходима вне MB, в дорсально-передне-боковых нейронах, которые посылают входные данные в MB (Chen et al., 2012) и NMDA-рецептор. функция необходима для LTM в подтипах R4 нейронов эллипсоидного тела (EB) (Wu et al., 2007).

Помимо MB, функция DopR также необходима для модуляции различных форм возбуждения на внешние раздражители, включая этанол, кокаин и кофеин (Andretic et al., 2008; Kong et al., 2010; Van Swinderen and Andretic, 2011), а также возбуждение, вызванное испугом, вызванное повторяющимися затяжками воздуха (Lebestky et al., 2009). Для определенных форм возбуждения экспрессия DopR необходима в подмножествах R2 / R4m нейронов EB (Lebestky et al., 2009; Kong et al., 2010), которые включают тип (ы) клеток, для которых необходима функция NMDA-рецептора. обонятельный LTM (Wu et al., 2007). Таким образом, наивные ответы на внешние раздражители и долгоживущие условные ответы на запахи играют роль нейронов EB, а также участвуют в передаче сигналов дофамина на DopR.

В этом исследовании мы показываем, что miR-276a необходима внутри MB для кондиционированного обонятельного LTM и в подтипах R2 / R4m EB нейронов для наивного обонятельного избегания. Более того, мы способны полностью подавить как LTM, так и дефекты наивного обонятельного ответа при нарушениях miR-276a, просто уменьшая количество копий DopR . Сверхэкспрессия DopR в MB также достаточна для фенокопирования дефектов LTM у мутантов miR-276a . Мы предлагаем модель, в которой miR-276a точно настраивает уровни DopR в MB для кондиционированного обонятельного LTM и внутри EB для наивных запаховых реакций.

Результаты

Генетические реагенты для манипулирования локусом гена

miR-276a

Мутант miR-276a ^Rosa , выделенный при скрининге прямого мутагенеза (Dubnau et al., 2003), имеет элемент ap {lacW}, вставленный на 1,2 т.п.н. выше области гена, кодирующей предсказанный dme-mir-276a предшественник. dme-mir-276a и сайт вставки элемента p {lacW} попадают в большую межгенетическую область размером ~ 100 т.п.н., где отсутствуют известные или предсказанные гены, кодирующие белок в ~ 50 т.п.н. либо выше, либо ниже последовательности miRNA ( Инжир.1 А ). dme-mir-276b , который также принадлежит к семейству гена dme-mir-276 , расположен на ~ 45 т.п.н. Оба этих локуса miRNA продуцируют предшественников РНК, которые могут вносить вклад в экспрессию последовательности-пассажира miRNA, miR-276 *, с идентичной последовательностью из двух локусов (рис. 1 B , C ). Зрелые miRNA, miR-276a и miR-276b, отличаются друг от друга всего на 1 н. Профили экспрессии miRNA из культивируемых клеток S2 Drosophila или различных тканей показывают, что количество miR-276a в 10 раз выше, чем miR-276b, и большая часть miR-276 * возникает из локуса-предшественника dme-mir-276a ( Czech et al., 2008).

Рисунок 1.

Генетическая и поведенческая характеристика локуса гена miR-276a . A – C , Ген dme-miR-276a попадает в большую межгенную область ( A ). Элемент p {lacW}, который вызывает мутантный фенотип miR-276a ^Rosa , вставлен на 1,2 т.п.н. выше области-предшественника dme-mir-276a . Проиллюстрирована структура каждого мутантного аллеля или трансгена, включая гипоморфный аллель miR-276a ^Rosa , нулевой аллель miR-276a ^D8 и точные аллели удаления miR-276a ^A ^{6 miR-276a ^D2.2 . Также показаны структура и относительные размеры спасательных конструкций, включая три спасательных клона ВАС и геномный фрагмент 4,7 т.п.н. ( A ). Семейство гена dme-miR-276 продуцирует два предшественника miRNA, которые дают начало трем miRNA (miRBase: http://www.mirbase.org): dme-miR-276a , dme-miR-276b и dme-miR-276 * ( B , C ). D , относительный уровень экспрессии miR-276a в головах WT, miR-276a ^{Rosa / Rosa} , miR-276a ^{D8 / D8} и miR-276a ^{D8 / Rosa} животных, измерено методом QPCR.* p <0,05; N = ∼3–8. E , miR-276a ^D8 и miR-276a ^Rosa аллели не смогли дополнить друг друга для LTM, измеренного через 24 часа после 10 тренировок с интервалом. * p <0,05; N = 16. F , miR-276a ^D8 и miR-276a ^Rosa аллели не смогли дополнить друг друга в тесте обонятельного избегания с MCH (1.0 × 10 ⁻³ об / об). * p <0,05; N = ∼4–6. G , Предотвращение шока (60 В) казалось нормальным при WT, miR-276a ^{Rosa / +}, miR-276a ^{D8 / +} и miR-276a / Роза} животных. n.s., не имеет значения; N = 4. H , Два точных аллеля вырезания, miR-276a ^A ⁶ и miR-276a ^D2.2 , может обратить вспять дефект избегания обоняния, наблюдаемый у miR-276a ^{Rosa / D8} мутантных животных. * p <0,05; N = 6. I , Тесты обонятельного избегания с MCH, OCT и BA в различных концентрациях для WT, miR-276a ^{Rosa / +}, miR-276a ^{D8 D8 / +} и miR-276a ^{D8 / Rosa} животных. N = ∼6–10.

Чтобы исследовать функцию локуса miR-276a в поведении, мы сначала создали набор реагентов для управления экспрессией miR-276a как с временной специфичностью, так и со специфичностью клеточного типа.Мы произвели как точные, так и неточные иссечения вставки элемента p {lacW} (рис. 1 A ; см. Материалы и методы). В аллеле miR-276a ^D8 геномная область размером ~ 3,6 т.п.н. справа от сайта вставки элемента p {lacW} была удалена, и в геноме осталась последовательность ~ 2,8 т.п.н. Таким образом, miR-276a ^D8 удаляет весь предшественник mir-276a и может считаться нулевым аллелем. В miR-276a ^A6 и miR-276a ^D2.2 аллелей, Р-элемент почти полностью удален и фланкирующих делеций обнаружено не было. Следовательно, предполагается, что эти эксцизионные аллели восстановят нормальную функцию этого локуса (рис. 1 A ). В дополнение к этим мутантным аллелям мы создали трансгенных животных-спасателей, содержащих геномные клоны ВАС, Ch422-133G18 (~ 20 т.п.н.), Ch422-151h23 (~ 19 т.п.н.) и Ch421-46B15 (~ 75 т.п.н.), которые содержались в p [ acman] векторов (Venken et al., 2006, 2009). Эти клоны ВАС покрывают область-предшественник mir-276a и не включают какие-либо близлежащие гены, кодирующие белок, или область-предшественник mir-276b (рис.1 А ).

Чтобы охарактеризовать экспрессию miR-276a в указанных выше мутантах и спасательных трансгенах ВАС, мы использовали QPCR для определения уровней miR-276a в головах мух (фиг. 1 D , 2 C ). У гомозиготных мутантных голов животных miR-276a, ^{, Rosa,}, уровень экспрессии miR-276a был снижен примерно на 40% по сравнению с животными дикого типа. В miR-276a ^D8 гомозиготных мутантных голов животных, экспрессия miR-276a (фиг.1 D ; F _(3,18) = 25.09, p <0,05) был почти устранен (низкая остаточная экспрессия предположительно происходит от локуса miR-276b , который отличается от miR-276a только на 1 нт). Это согласуется с выводом о том, что miR-276a ^D8 является нулевым аллелем miR-276a , а miR-276a ^Rosa является гипоморфным аллелем. Животные, трансгетерозиготные по двум мутантным аллелям miR-276a ^D8 и miR-276a ^Rosa ( miR-276a ^{D8 / Rosa} ), дают дефектную экспрессию miR-276a miR-276a, промежуточную между экспрессией miR-276a miR. -276a ^Rosa и miR-276a ^D8 гомозиготных животных (рис.1 D ; F _(3,18) = 25,09, p <0,05). Поскольку гомозиготный мутант miR-276a ^D8 является полулетальным (немногие доживают до зрелого возраста), мы использовали miR-276a ^{D8 / Rosa} в качестве жизнеспособной, но сильной комбинации аллелей для поведенческих экспериментов. Для трансгенов BAC rescue только Ch421-46B15, самая большая из трех конструкций (геномный фрагмент ~ 75 т.п.н.) восстанавливала экспрессию miR-276a (фиг.2 C ; F _(3,19) = 16.06, p <0,05).

Рисунок 2.
Спасение трансгенов мутантов miR-276a . A , копия спасательного клона ВАС Ch421-46B15 размером ~ 75 т.п.н. полностью устраняет дефект поведения избегания обоняния у мутантных животных miR-276a ^{D8 / Rosa} . * p <0,05; N = ∼12–16. B , Два спасательных клона ВАС размером ~ 20 т.п.н., Ch422-151h23 и Ch422-133G18, не смогли устранить дефект избегания обоняния у мутантных животных miR-276a ^{D8 / Rosa} .* p <0,05; N = 4. C , Уровни экспрессии miR-276 восстанавливаются с помощью ВАС Ch421-46B15 ∼75 kb, но не с помощью BAC Ch422-133G18 ∼20 kb. * p <0,05; n.s., не имеет значения; N = 4–8.
miR-276a ^{D8 / Rosa} мутантные животные обладают дефектной долговременной обонятельной памятью и наивным обонятельным избеганием
Изначально о дефекте LTM сообщалось для гипоморфного аллеля miR-276a ^Rosa (Dubnau et al., 2003). Мы протестировали кратковременную и долговременную обонятельную память, а также сенсомоторные реакции на запахи и электрический шок, соответствующие задаче, с использованием сильной комбинации аллелей miR-276a ^{D8 / Rosa} . Мы обнаружили, что животных miR-276a ^{D8 / Rosa} продемонстрировали значительную дефектную производительность для LTM, измеренную через 24 часа после 10 тренировок с интервалом, в то время как животные, гетерозиготные по miR-276a ^D8 или miR-276a ^Rosa Аллель работает нормально по сравнению с WT (рис.1 E ; F _(3,60) = 11,77, p <0,05). Однако животные miR-276a ^{D8 / Rosa} также демонстрировали значительно дефектные реакции наивного избегания (рис. 1 F , I ) на MCH (рис. _(3,18) = 5,88, p <0,05) и ОКТ (рис.1 I ; F _(3,34) = 9,51, p <0,05), но не BA ( Рис.1 I ; F _(3,20) = 1.88, не значимо) при концентрациях, используемых для нашего стандартного анализа памяти (1 × 10 ⁻³ об / об, 1,5 × 10 ⁻³ об / об и 0,5 × 10 ⁻³ об / об соответственно для MCH, OCT и BA) по сравнению с WT или гетерозиготными мутантными контролями. При более высоких концентрациях в 10 раз ответы казались нормальными для ОКТ (рис. 1 I ; F _(3,20) = 4,06, несущественно), но не для MCH (рис. 1 I ; ). F _(3,20) = 19,74, p <0.05). Эти наблюдения открывают возможность того, что сниженная реакция на наивный запах сильных комбинаций аллелей miR-276a вносит вклад в дефект обонятельной памяти (но см. Ниже). Предотвращение поражения электрическим током (60 В) оказалось нормальным для всех генотипов (рис. 1 G ; F _(3,11) = 0,20, незначительно).
Функция miR-276a лежит в основе наивных дефектов избегания обоняния
В дополнение к тестам комплементации, показанным на рисунке 1 E , I , мы также проверили, был ли устранен наивный дефект избегания запаха с помощью точных аллелей удаления, в которых был удален Р-элемент и была восстановлена геномная структура.Действительно, животные, трансгетерозиготные по мутантным аллелям miR-276a (гипоморфный аллель miR-276a ^Rosa или нулевой аллель miR-276a ^D8 ) и любой из двух точных аллелей эксцизии (
3 miR-271 или miR-276a ^D2.2 ) демонстрируют нормальные наивные ответы обонятельного избегания на MCH (рис.1 H ; F _(5,30) = 16,96, p <0,05). Затем мы проверили, достаточны ли трансгены, содержащие геномные клоны ВАС, для восстановления наивных дефектов обонятельной реакции (рис.2). Все три протестированных клона ВАС включают предполагаемую область-предшественник miR-276a , но исключают любые другие гены, кодирующие белок, или кодирующую область miR-276b (фиг. 1 A ). Мы обнаружили, что уровни экспрессии и поведенческий дефект miR-276a ^{D8 / Rosa} могут быть полностью устранены путем предоставления трансгенной копии клона ВАС Ch421-46B15 размером ~ 75 т.п.н. (рис.2 A , F _(2,35) = 5,49, p <0,05). Напротив, более мелкие клоны ВАС (∼20 kb Ch422-133G18 и ∼19 kb Ch422-151h23) (рис.1 A ) не удалось спасти экспрессию miR-276a ^{D8 / Rosa} или обонятельное поведение (рис.2 B ; F _(3,12) = 13,42, p <0,05). Вместе вышеперечисленные находки предоставляют конвергентные доказательства того, что miR-276a ответственна за дефект в ответах на наивный запах.
Доминантно-отрицательная фенокопия «губки» миРНК наивный дефект обонятельного ответа
мутантов miR-276a
В качестве дополнительного и независимого подхода мы использовали систему «губки» miRNA (Ebert et al., 2007), который недавно был адаптирован к модели Drosophila (Loya et al., 2009). Трансгены «губки» включают 10 повторяющихся последовательностей, комплементарных miR-276a, с несовпадениями в положениях 9–12 для повышения стабильности. Когда экспрессия UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE индуцируется с помощью GAL4, эндогенный miR-276a должен «всасываться», и его нормальное функционирование должно нарушаться (Fig. 3 A ). В качестве контроля мы использовали мух UAS :: EGFP :: SCRAMBLED , у которых 10 повторяющихся комплементарных последовательностей заменены скремблированной последовательностью, не распознаваемой какой-либо miRNA в Drosophila .Мы продемонстрировали эффективность и специфичность этого подхода с помощью анализа in vivo , в котором экспрессия UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE может подавлять летальность развития от пан-нейрональной сверхэкспрессии miR-276a (рис. 3 ). В ). Затем мы протестировали наивное поведение избегания обоняния у животных, экспрессирующих UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE или UAS :: EGFP :: SCRAMBLED под пан-нейронным драйвером elav- GAL4 (рис. 3 E ). .Мы использовали две независимые трансгенные линии для UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE и UAS :: EGFP :: miR-SCRAMBLED . Мы обнаружили, что экспрессия UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE в нейронах ухудшала производительность животных в тесте наивного обонятельного избегания, в то время как животные, экспрессирующие трансгены UAS :: EGFP :: SCRAMBLED , работали нормально (рис. . 3 E ; F _(5,42) = 24,48, p <0,05). Контрольные животные, которые содержали UAS-трансгены, но не содержали драйвер Gal4, также работали нормально (рис.3 F ; F _(4,25) = 0,75, незначительно).
Рисунок 3.

Функция miR-276a после развития в нейронах EB для наивных обонятельных ответов. A – D , Проиллюстрирована индуцибельная «губчатая» система miRNA у Drosophila (Loya et al., 2009) ( A ). Количественная оценка скорости вылупления эмбрионов на ранних этапах от скрещивания трансгена UAS :: miR-276a-4.7Kb с elav с или без UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE показала, что «губка» miR-276a может эффективно « впитывать »избыточный miR-276a ( B ).«Губка» в качестве сенсора, сообщающего об эндогенной экспрессии в мозге miR-276a. Экспрессия EGFP в репрезентативном мозге от потомства скрещивания elav с UAS :: EGFP :: SCRAMBLED ( C ) и экспрессия EGFP в репрезентативном мозге от потомства скрещивания elav с UAS: : EGFP :: miR-276a ГУБКА ( D ). E , F , Нейрональная экспрессия UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE с elav GAL4 вызывает аналогичный дефект поведения, наблюдаемый у мутантного животного miR-276a , и экспрессия трансгена UAS :: EGFP :: SCRAMBLED контроля не влияет на избегание обоняния ( E ; * p <0.05; N = 8). Животные, гетерозиготные по каждому трансгену, демонстрируют нормальное поведение избегания обоняния ( F ; n.s., не значимо; N = 6). G , Экспрессия miR-276a после развития является достаточной для восстановления нормального наивного избегания обоняния. Проиллюстрирована схема индукции температурного сдвига (слева; подробности см. В разделе «Результаты и материалы и методы»). Обонятельное избегание было частично устранено, когда функция miR-276a была включена постразвитие (справа; * p <0.05; n.s., не имеет значения; N = ∼4–12). H – J , Чтобы отобразить схему, в которой miR-276a требуется для наивного обонятельного избегания, трансгена UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE трансгена были экспрессированы с набором линий GAL4 ( Or83b , Gh246 , Gh398 , OK107 , c747 , c232 и c547 ), каждый из которых маркирует определенные типы клеток, которые составляют обонятельную или обонятельную цепь памяти Drosophila (

H .Экспрессия трансгенов UAS :: EGFP :: miR276aSPONGE с c547 GAL4, который маркирует нейроны R2 / 4m в EB, фенокопирует наивный дефект избегания обоняния, наблюдаемый у miR-276a мутантных животных ( I ; * p <0,05; N = 8). Напротив, другие типы клеток не влияли на это обонятельное поведение ( I ; n.s., не значимо; N = 4). Паттерн экспрессии c547 демонстрируется в J .

Помимо повторения мутантного фенотипа, система «губка» также обеспечивала косвенное наблюдение паттерна экспрессии miR-276a. Поскольку эндогенный miR-276a может связываться с 3’UTR трансгена UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE , экспрессия EGFP, управляемая пан-нейрональным elav -GAL4, была значительно снижена по сравнению с экспрессией . UAS :: EGFP :: ЗАКРЕПЛЕНИЕ . Это согласуется с идеей, что miR-276a широко экспрессируется в головах взрослых мух (рис.3 C , D ).

Функция miR-276a после развития достаточна для наивных обонятельных реакций

Чтобы определить временные требования для функции miR-276a, мы объединили термочувствительный трансген GAL80, управляемый промотором тубулина ( GAL80 ^ts ) (McGuire et al., 2004) с elav- GAL4. GAL80 ^ts является супрессором GAL4, и при разрешающей температуре (18 ° C) GAL80 ^ts активен и подавляет контролируемую GAL4 экспрессию трансгена UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE .При ограничительной температуре (29 ° C) GAL80 ^ts инактивируется, и трансгены SPONGE или SCRAMBLED экспрессируются. Мы скрестили трансгенных мух UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE или UAS :: EGFP :: SCRAMBLED с elav; GAL80 ^ts животных. Потомство от этих скрещиваний содержали при ограничительной температуре (29 ° C). Следовательно, экспрессия трансгена сохранялась, а функция miR-276a блокировалась во время развития. После эклозии мы разделили потомство каждого скрещивания на две группы: одну постоянно инкубировали при рестриктивной температуре (29 ° C), при которой функция miR-276a нарушается, а другую — смещали до разрешающей температуры (18 ° C). ), что позволяет снова включить функцию miR-276a.Обе группы инкубировали еще 72 часа перед тестированием на поведение избегания (рис. 3 G ). Мы обнаружили, что, когда функция miR-276a отключалась после эклозии (без перехода к разрешающей температуре), мухи, содержащие трансгена UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE , демонстрировали пониженное избегание наивного запаха по сравнению с UAS :: EGFP: : ЗАПИСАННЫЕ и elav / +; GAL80 ^ts / + контрольные животные. Это было верно для каждой из двух независимых «губок» по сравнению с «зашифрованными» трансгенами.Напротив, когда трансген UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE был отключен после развития (что позволило восстановить функцию miR-276a), мы наблюдали значительное восстановление наивного обонятельного избегания в группе с температурным смещением (рис. . 3 G ; ГУБКА № 1 , t ₍₂₂₎ = 4,65, p <0,05; ГУБКА № 2 , t ₍₂₂₎ = 2,71, p < 0,05). В контрольных скрещиваниях с трансгенами UAS :: EGFP :: SCRAMBLED не было существенной разницы между группами с температурным смещением и без температурного сдвига (рис.3 G ; SCRAMBLED # 1 , t ₍₆₎ = 0,73, незначительно; SCRAMBLED # 4, t ₍₆₎ = 0,68, несущественно). Эти находки демонстрируют, что острой (постразвитной) функции miR-276a достаточно для нормального наивного избегания запаха. Таким образом, этот поведенческий эффект вряд ли может быть вызван дефектами нервного развития.

miR-276a требуется в нейронах EB для нормальных наивных обонятельных ответов на MCH

.
Чтобы отобразить типы нейронных клеток, в которых требуется функция miR-276a, мы провели небольшой экран, на котором тестировался UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE в сочетании с набором линий GAL4, которые каждая опрашивала. отдельные подмножества известных цепей, которые лежат в основе обоняния или обонятельной памяти.Поскольку некоторые из этих линий GAL4 могут управлять умеренными уровнями экспрессии, мы объединили две линии трансформантов UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE для увеличения уровней экспрессии трансгена (Loya et al., 2009). Мы выбрали линии GAL4, которые экспрессируются в обонятельных сенсорных нейронах ( Or83b ), нейронах проекции лепестков антенны ( Gh246 ), локальных интернейронах лепестков антенны ( Gh398 ), MB ( OK107 и c747 ) и двух разных наборы нейронов EB ( c232 и c547 ) (рис.3 H , I ). В каждом случае мы тестировали наивные обонятельные ответы на MCH у животных, которые содержали как драйвер GAL4, так и два трансгена UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE , по сравнению с контролями, гетерозиготными по драйверам GAL4. Удивительно, но набор линий GAL4 ( Or83b , Gh246 , Gh398 , OK107 и c747 ), которые запрашивают основную обонятельную систему от нейронов обонятельных рецепторов до МБ, дали нормальное наивное поведение избегания (рис.3 I ; Or83b , t ₍₆₎ = 0,39, незначительно; Gh246 , t ₍₆₎ = 0,93, незначительно; Gh398 , t ₍₆₎ = 0,84, незначительно; OK107 , t ₍₆₎ = 1,81, незначительно; c747 , t ₍₆₎ = 0,06, несущественно). Напротив, только c547 , который маркирует подмножество нейронов R2 / R4m в EB (рис.3 J ), показали значительно меньшее наивное обонятельное избегание MCH (рис. 3 I ; t ₍₁₄₎ = 3,37, p <0,05). c232 , который маркирует нейроны R3 / R4d EB, не влиял на избегание обоняния (рис. 3 I ; c232, t ₍₆₎ = 0,92, несущественно). Обнаружение нейронов R2 / R4m, меченных c547 , было неожиданным, потому что нейроны EB находятся на несколько синапсов ниже первичных цепей, которые, как считается, кодируют обонятельные стимулы (Chiang et al., 2011) (База данных FlyCircuit: http://www.flycircuit.tw). Однако в нескольких исследованиях нейроны EB связаны с долговременной обонятельной памятью (Wu et al., 2007) и возбуждением от внешних раздражителей (Lebestky et al., 2009; Kong et al., 2010). Фенотипы возбуждения мутаций в гене DopR имеют особое значение, потому что они могут быть полностью устранены экспрессией DopR с использованием c547 GAL4, но не c232 GAL4 (Lebestky et al., 2009; Kong et al., 2010 ). Необходимость функции miR-276a в нейронах R2 / R4m EB, таким образом, направляла наши поиски функциональных мишеней для miR-276a.
Влияние miR-276a на наивное избегание MCH опосредуется
DopR
Мы использовали четыре опубликованных метода (Pictar: http://pictar.mdc-berlin.de/; TargetScanFly6.0: http://www.targetscan.org/fly/; ElMMo: http://www.mirz.unibas .ch / ElMMo2 /; и miRanda: http://www.microrna.org/microrna/home.do) (Enright et al., 2003; Grün et al., 2005; Ruby et al., 2007; Gaidatzis et al. ., 2007; Betel et al., 2010) для прогнозирования мРНК-мишеней miR-276a и получили список прогнозируемых генов-мишеней, которым мы установили приоритет на основе оценок прогноза каждого метода, известных паттернов экспрессии нервной системы и нейрональных или поведенческих функций ( Инжир.4 А ). Мы сосредоточили внимание на следующих генах: гомеодомен 2 пальца Zn ( zfh3 ), ответ на дефектное удлинение хоботка ( dpr ), DopR , Pinocchio ( Pino ; также известный как smi обесценен 21F ). и нейрофибромин 1 ( Nf1 ). Эти предсказанные гены-мишени имеют высокие рейтинги для всех методов предсказания и обладают установленными функциями, связанными с развитием нервной системы (Lundell and Hirsh, 1992), регулирующими возбуждение (Andretic et al., 2008; Лебесткий и др., 2009; Kong et al., 2010), опосредуя обонятельные реакции (Nakamura et al., 2002; Rollmann et al., 2005), а также обонятельное обучение и память (Kim et al., 2007a; Qin et al., 2012). Мы проверили, может ли снижение экспрессии miR-276a резко изменить прогнозируемую экспрессию целевого гена. Мы скрестили драйвер теплового шока GAL4 ( hs-GAL4 ) с трансгеном UAS :: miR-276a-4.7Kb , чтобы сверхэкспрессировать miR-276a посредством развития при 29 ° C, при температуре hs-GAL4 имеет утечку экспрессии. (Xia et al., 2005). После эклозии мы разделили потомство на две группы: одну непрерывно инкубировали при 29 ° C, а другую инкубировали при 18 ° C для снижения экспрессии, вызванной тепловым шоком (фиг. 4 B ). hs-GAL4 / + гетерозиготных животных использовали в качестве контроля. Мы использовали QPCR для сравнения уровней экспрессии каждого гена-кандидата-мишени в головах животных, которые содержались при 29 ° C, с теми, которые были переведены на 18 ° C, чтобы снизить трансгенную экспрессию miR-276a. В случае Zfh3 и DopR мы наблюдали значительное увеличение уровней экспрессии, когда трансген miR-276a подавлял (рис.4 C, D ; C , t ₍₄₎ = 4,32, p <0,05; D , t ₍₄₎ = 2,27, p <0,05). Для Pino и Nf1 не было обнаружено никаких изменений в экспрессии (фиг. 4 F , G ; несущественно). В случае dpr мы наблюдали тенденцию к увеличению экспрессии как в контрольных генотипах hs-GAL4 / UAS :: miR-276a-4.7Kb , так и в контрольных генотипах hs-GAL4 / +, что указывает на то, что температурный сдвиг сам по себе может влияют на уровни экспрессии dpr (рис.4 E ; t ₍₃₎ = 5,03, p = 0,02; t ₍₄₎ = 1,85, p = 0,06). Таким образом, два из пяти протестированных кандидатов показали miR-276a-зависимые изменения уровней транскриптов (см. Ниже уровень белка). Повышенная экспрессия Zfh3 и DopR , когда трансген miR-276a выключен, подтверждает идею о том, что miRNA обычно репрессирует эти два гена. В качестве второго теста этой регуляторной взаимосвязи мы использовали протокол острой индукции, в котором управляемый тепловым шоком трансген miR-276a отключали (18 ° C) во время развития, а затем резко индуцировали с помощью 40-минутного теплового сдвига (37 ° C) с последующим 4-часовым восстановлением.С помощью этого протокола острой индукции (рис. 4 H ) уровни Zfh3 и DopR были снижены (рис. 4 I, J ; I , t ₍₄₎ = 4,07, p <0,05; J , t ₍₄₎ = 4,46, p <0,05).
Рисунок 4.
miR-276a регулирует уровень экспрессии DopR . Предсказание цели , miR-276a было получено с помощью четырех опубликованных методов: Pictar, TargetScan, ElMMo и miRanda (Pictar: http: // pictar.mdc-berlin.de/; TargetScanFly6.0: http://www.targetscan.org/fly/; ЭлММо: http://www.mirz.unibas.ch/ElMMo2/; и miRanda: http://www.microrna.org/microrna/home.do) (Enright et al., 2003; Grün et al., 2005; Gaidatzis et al., 2007; Ruby et al., 2007; Betel et al., др., 2010). Мы выбрали несколько мишеней с известными нейрональными или обонятельными функциями, включая zfh3 , dpr , DopR, Pino и Nf1 (Nakamura et al., 2002; Rollmann et al., 2005; Kim et al., 2007b; Андретич и др., 2008; Лебесткий и др., 2009; Kong et al., 2010; Qin et al., 2012). B – G , Чтобы проверить, регулируется ли предсказанная экспрессия целевого гена с помощью miR-276a, мы использовали индуцируемую нагреванием линию hs-GAL4 в сочетании с UAS :: miR-276a-4.7Kb трансген сверхэкспрессирует miR-276a. Поскольку высокий уровень экспрессии нейронов в процессе развития является летальным (рис. 3 B ), мы использовали умеренно-температурный режим ( B ; см. Результаты, материалы и методы), чтобы обеспечить менее серьезную индукцию тепла во время развития.Затем мы проверили влияние на уровни транскриптов гена-мишени, переведя животных на более низкую температуру после развития. В группах с температурным смещением (от 29 до 18 ° C) мы видим значительно индуцированные уровни уровней транскриптов-мишеней для Zfh3 и DopR по сравнению с группами, поддерживающими температуру 29 ° C ( C и D . ; * p <0,05; N = ∼2–3). Уровни транскрипта Zfh3 и DopR не были затронуты температурным сдвигом у контрольных животных hs-GAL4 / + ( C и D ; n.с., не имеет значения; N = ∼2–3). С dpr мы наблюдали индукцию в группах с температурным сдвигом для животных hs-GAL4 / UAS :: miR-276a-4.7Kb и hs-GAL4 / +, что указывает на температурный сдвиг, но не miR-276a, может изменять уровни экспрессии dpr ( E ; * p <0,05; N = ∼2–3). Для Pino и Nf1 не наблюдалось изменений уровней транскриптов ни для одного генотипа или лечения ( F и G ; n.с., не имеет значения; N = ∼2–3). H – J . Другой режим температурного сдвига также использовался для проверки того, регулирует ли miR-276a экспрессию гена Zfh3 и DopR ( H ). 40-минутная индукция тепловым шоком экспрессии miR-276a при 37 ° C у взрослых hs-GAL4 / UAS :: miR-276a-4.7Kb животных вызвала значительное подавление уровней транскриптов Zfh3 и DopR . которые предположительно являются мишенями для miR-276a ( I и J ; * p <0.05; n.s., не имеет значения; N = 3).
DopR 3’UTR содержит по крайней мере один предполагаемый сайт связывания miR-276a, который является высококонсервативным у видов Drosophila (фиг. 5 A ). Хотя мы не можем быть уверены в том, что эффекты на DopR являются прямыми и опосредуются предполагаемым целевым мотивом, мы действительно наблюдаем негативный регуляторный эффект miR-276a на экспрессию DopR, как это предсказано для прямой мишени. В любом случае отрицательный знак взаимодействия предсказывает, что мутация miR-276a будет вызывать повышенную экспрессию DopR.Эта идея представляла особый интерес, потому что мы обнаружили, что miR-276a функционирует внутри R2 / R4m EB нейронов, меченных c547 . Функция DopR в этих нейронах играет важную роль в двух различных формах возбуждения (Lebestky et al., 2009; Kong et al., 2010), а мутации DopR демонстрируют доминирующее увеличение возбуждения, что свидетельствует о чувствительности к дозировке (Lebestky et al. ., 2009). В нашем случае мутации miR-276a приведут к увеличению экспрессии DopR , что должно вызвать снижение возбуждения.Поэтому мы проверили, может ли уменьшение количества копий DopR подавлять мутации miR-276a. Мы ввели копию аллеля DopR ^dumb2 в мутант miR-276a ^{D8 / Rosa} и протестировали наивное обонятельное избегание. Примечательно, что животные DopR ^{dumb2 / +}, miR-276a ^{D8 / Rosa} показали нормальное избегание (рис. р <0.05). Вместе с исследованиями экспрессии, описанными выше, этот эксперимент предоставляет убедительные доказательства того, что DopR является функциональным нижестоящим эффектором miR-276a в нейронах R2 / R4m EB и что эта регуляторная взаимосвязь влияет на наивные ответы на этот обонятельный стимул.
Фиг. 5.
DopR является мишенью нижестоящей miR-276a для наивных обонятельных ответов. A , затравочная последовательность miR-276a распознает высококонсервативный сайт-мишень из 6 нуклеотидов в 3’UTR транскрипта DopR .Предсказанный сайт связывания miR-276a (заштрихованные прямоугольники) консервативен в последовательностях 3’UTR транскриптов DopR от 12 различных видов Drosophila (TargetScanFly6.0). B , Удаление копии гена DopR путем введения сильного гипоморфного аллеля DopR (аллель DopR ^dumb2 ) было достаточным для полного подавления наивного дефекта избегания обоняния в 276353 mi19R-90 D8 / Rosa мутантных животных.* p <0,05; n.s., не имеет значения; N = ∼8–16.
miR-276a влияет на обонятельный LTM через эффекты на экспрессию DopR в MB
Помимо EB, DopR также экспрессируется в MB (Kim et al., 2007a; Lebestky et al., 2009; Fig. 6 A , B ), основной анатомической структуре, лежащей в основе обонятельной памяти и обучения в Drosophila . Мутации в гене DopR могут уничтожить кратковременную память и LTM, и восстановления экспрессии DopR в субпопуляции γ-нейронов MB достаточно для восстановления как кратковременной памяти, так и LTM (Kim et al., 2007a; Лебесткий и др., 2009; Qin et al., 2012). Поэтому мы задались вопросом, возникает ли та же самая регуляторная взаимосвязь miR-276a :: DopR в EB также в MB для модуляции уровней экспрессии DopR. Мы исследовали уровни экспрессии DopR с помощью иммуногистохимии в головном мозге, где UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE экспрессируется в нейронах MB, меченных OK107 . Мы обнаружили, что действительно наблюдается значительное повышение экспрессии DopR в МБ, когда мы запускаем трансген «губка» в МБ по сравнению с контрольными животными ( UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE / + гетерозиготные животные) (рис.6 C , D ). Эти результаты согласуются с эффектами на экспрессию DopR, наблюдаемыми при QPCR (фиг. 4).
Рисунок 6.

miR-276a регулирует DopR в MB для LTM. A , B , DopR экспрессируется в MB и EB мозга мух. C , D , Экспрессия трансгенов UAS :: EGFP :: miR276a SPONGE с линией GAL4 MB OK107 приводит к повышенной экспрессии DopR в MB ( D 35 по сравнению с D 35 по сравнению с ).Иммуногистохимия для контрольного ( C ) и экспериментального ( D ) головного мозга выполнялась параллельно, и изображения получали при идентичных конфокальных настройках. E – J , Экспрессия трансгенов UAS :: EGFP :: miR276a SPONGE с линией MB GAL4 OK107 вызывает снижение производительности LTM по сравнению с WT и гетерозиготными контролями ( E ; * p ; N = 8). Напротив, память, измеренная через 24 часа после 10 массовых тренировок ( F ), или кратковременная память, измеренная через 3 минуты после одной тренировки ( G ), каждая казалась нормальной ( F ; n .с., не имеет значения; N = 7; G , n.s., не имеет значения; N = 8). Как и в случае линии OK107 GAL4, экспрессия UAS :: EGFP :: miR276aSPONGE с c747 , второй MB-экспрессирующей линией GAL4 приводила к значительному снижению производительности LTM. Дефект LTM может быть полностью подавлен в присутствии одной копии сильного мутантного аллеля DopR ^dumb1 ( H ; * p <0.05; n.s., не имеет значения; N = 14). Острота обоняния и шоковая реактивность оказались нормальными, когда трансгена UAS :: EGFP :: miR276aSPONGE были экспрессированы с OK107 ( I ; n.s. не значимо; N = 4-8). Паттерны экспрессии OK107 и c747 показаны в J и K . L , вставка PiggyBac (PBac) в DopR продуцирует аллель DopR ^dumb2 , который является дефектным при формировании LTM (* p <0.05; N = 8). Эта вставка PBac содержит элемент UAS-энхансера, который может управлять экспрессией DopR, когда присутствует Gal4. Экспрессия DopR в OK107 -меченных нейронах MB посредством элемента UAS, содержащегося в этом PBac, достаточна для восстановления как кратковременной памяти, так и LTM (Qin et al., 2012). Чтобы исследовать эффекты более высоких уровней сверхэкспрессии DopR в нейронах MB, меченных OK107 , мы протестировали эффекты комбинированной экспрессии от дополнительного трансгена UAS :: DopR и линии вставки PBac.Добавление трансгена UAS :: DopR приводит к дефекту LTM. * p <0,05; N = 8. M . Индукция функции miR-276a после развития была достигнута с помощью трансгена GAL80 ^ts . Животных выращивали при 29 ° C, чтобы обеспечить экспрессию UAS :: EGFP :: miR276aSPONGE под контролем линии c747 GAL4. После развития животных либо поддерживали при 29 ° C, либо переводили на 18 ° C в течение 3 дней, чтобы позволить функции miR-276a вернуться.Последующие 10-кратные тренировочные занятия для эксперимента LTM проводились при 25 ° C. Дрессированные животные содержались при 18 ° C перед тестированием на 24 часа памяти при 25 ° C (слева; подробности см. В разделе «Результаты и материалы и методы»). Дефект LTM, возникающий в результате экспрессии UAS :: EGFP :: miR276aSPONGE , может быть полностью восстановлен в группе с температурным сдвигом, в которой функция miR-276a была снова включена после развития. Работа LTM в контроле была нормальной GAL80 ^ts / +; OK107 / + животные (справа; * p <0.05; n.s., не имеет значения; N = 8).

Открытие, что miR-276a регулирует DopR в MB, предполагает роль в обонятельной памяти. В случае животных-мутантов miR-276a ^{D8 / Rosa} дефект в реакции на наивный запах не позволил сделать выводы о производительности памяти как таковой, потому что процесс кондиционирования включает в себя реакции на эти же запахи. Но различные эффекты на наивное избегание запаха специфической для клеточного типа экспрессии «губки» в EB и MB предполагают, что мы могли бы отделить эффекты на память от эффектов на наивные реакции запаха.Экспрессия UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE в МБ с использованием линии драйвера GAL4 OK107 на самом деле не вызвала дефектов в наивном обонятельном избегании любого из трех испытанных запахов или избегании шока (Рис. 3 I , 6 I ; BA, F _(2,9) = 2,13, не значимо; OCT, F _(2,9) = 0,47, незначительно; шок, F _{( 2,19)} = 0,39, незначительно). Поскольку избегание запаха и шоковая реактивность были нормальными при экспрессии «губки» miR-276a в МБ, это предоставило средства для значимого тестирования роли в памяти без предостережений, связанных с дефектами сенсомоторных реакций, связанных с задачей.Поэтому мы проверили влияние на память и обучение экспрессии губки в МБ с двумя линиями GAL4 (рис. 6 E – H , J , K ). Хотя реакции на все три испытанных запаха кажутся нормальными при экспрессии «губки», управляемой МБ, мы выбрали ОКТ и ВА для этих экспериментов по различению обонятельного кондиционирования, потому что дефекты наивной реакции на эти запахи мягкие по сравнению с МСН даже для случая, когда miR-276a функция нарушена у всего животного (рис.1 I ). С линией OK107 GAL4 мы наблюдали значительно сниженную производительность памяти, измеренную через 24 часа после интервальных повторяющихся тренировок (LTM) (Рис.6 E ; F _(3,28) = 11,49, p < 0,05), но не после повторяющейся массированной тренировки или сразу после одной тренировки (Рис.6 F, G ; F , t ₍₁₂₎ = 0,08, незначительно; G , t ₍₁₆₎ = 2.67, не имеет значения). Таким образом, дефект, по-видимому, специфичен для LTM, который требует синтеза нового белка (Tully et al., 1994). LTM аналогично сокращается с линией GAL4 c747 , которая также маркирует нейроны MB (рис. 6 H ; F _(2,39) = 6,60, p <0,05).

Мы задались вопросом, опосредуется ли функция miR-276a в MB для LTM регуляцией экспрессии DopR , как это было в случае EB для наивных обонятельных ответов на MCH. Мы ввели копию сильного аллеля DopR животным, которые также экспрессируют UAS :: EGFP :: miR-276aSPONGE в МБ.Поскольку в этом эксперименте использовался GAL4 для управления трансгеном губки, мы использовали аллель DopR ^dumb1 , а не DopR ^dumb2 , потому что последний аллель содержит GAL4-чувствительный элемент UAS перед кодирующей областью DopR . (см. ниже). Мы обнаружили, что удаления одной копии гена DopR было достаточно для полного подавления эффектов на обонятельную память, вызванных экспрессией доминантно-отрицательной «губки» miR-276a. Дефектный LTM обнаружен в UAS :: EGFP :: SPONGE # 1 / c747; UAS :: EGFP :: SPONGE # 2 / + животные полностью перевернуты в UAS :: EGFP :: SPONGE # 1 / c747; UAS :: EGFP :: SPONGE # 2 / +, DopR ^{dumb1 / +} животных (рис.6 H ). Этот эксперимент согласуется с идеей, что miR-276a обычно контролирует уровни DopR в МБ. Когда функция miRNA снижена, уровни DopR увеличиваются (фиг. 4, 5, 6, C , D ), и удаление одной копии гена DopR подавляет эффект. Прогноз этой гипотезы чувствительности к дозировке состоит в том, что избыточная экспрессия DopR в MB выше и выше обычно наблюдаемых уровней также должна поставить под угрозу LTM. Чтобы проверить эту идею, мы сравнили влияние на LTM экспрессии трех разных уровней DopR в МБ.Во-первых, гомозиготная мутация DopR ^dumb2 имеет очень низкую экспрессию DopR и приводит к крайне недостаточной производительности LTM (Qin et al., 2012). Аллель DopR ^dumb2 обусловлен вставкой Р-элемента в вышележащую область (Kim et al., 2007b). Поскольку этот P-элемент содержит реагирующий на GAL4 энхансер UAS, дефекты памяти могут быть устранены при сочетании с сильной линией MB-GAL4, такой как OK107, которая управляет экспрессией фланкирующего гена DopR на каждом из двух DopR ^dumb2 аллелей у гомозиготного мутанта (Kim et al., 2007b; Qin et al., 2012). Чтобы управлять еще более высокими уровнями DopR в нейронах MB, мы протестировали эффекты добавления третьего UAS-чувствительного трансгена ( UAS :: DopR ). Это приводит к дефекту LTM, который является таким же серьезным, как и тот, который наблюдается у гомозиготного мутанта с сильной потерей функции (рис.6 L ; F _(3,28) = 19,66, p <0,05). .

Острая функция miR-276a достаточна для нормальной обонятельной памяти

Функция miR-276a после развития достаточна для восстановления наивного дефекта обонятельной реакции у мутантных животных miR-276a (рис.3 G ). Чтобы проверить, достаточно ли острой экспрессии miR-276a для восстановления нормального LTM, мы снова ввели копию термочувствительного GAL80 ^ts . Животные, содержащие трансгены SPONGE, линию OK107 GAL4 и GAL80 ^ts ( UAS :: EGFP :: SPONGE # 1 / GAL80 ^ts; UAS :: EGFP :: SPONGE # 2 / + ; OK107 / +), а контрольные группы, которые содержали GAL80 ^ts и OK107 GAL4 line ( GAL80 ^ts / + ;; OK107 / +), каждую из которых поднимали при ограничительной температуре (29 ° C) для сохранения индуцированного трансгена «губки» и блокирования функции miR-276a в нейронах МБ, меченных OK107 , во время развития.После эклозии мы разделили потомство от каждого скрещивания на две группы: одну непрерывно инкубировали при рестриктивной температуре (29 ° C), где функция miR-276a оставалась отключенной в МБ, а другую инкубировали при разрешающей температуре (18 ° C). C) разрешение повторного включения функции miR-276a в МБ. Обе группы инкубировали еще 72 часа перед тестированием на LTM. Мы обнаружили, что активации функции miR-276a в МБ после развития было достаточно для поддержания полностью нормальной работы LTM (рис.6 M ; F _(3,28) = 4,35, p <0,05). В контрольных группах не было значительных различий между группами с температурным сдвигом и без температурного сдвига. Т.о., как и в случае с наивными ответами избегания обоняния, постразвитие функции miR-276a также достаточно для поддержки LTM.

В совокупности наши находки подтверждают вывод о том, что каждая наивная и условная реакция запаха требует функции miR-276a, но в разных нервных цепях. Более того, в каждом случае DopR является функциональной нижестоящей регуляторной мишенью.Наши данные подтверждают модель (рис. 7), в которой уровни DopR настраиваются с помощью miR-276a в каждой из этих двух нейронных цепей.

Рисунок 7.
Модель, в которой miR-276a настраивает уровни DopR в EB и MB для наивной реакции обонятельного возбуждения и LTM. Определенные дофаминергические волокна иннервируют EB и MB соответственно. В EB, DA модулирует пороги возбуждения посредством активации DopR. В γ-нейронах MB выброс DA передает безусловное стимульное усиление, которое опосредуется DopR. Слишком много или слишком мало экспрессии DopR (красные точки) внутри EB или MB достаточно, чтобы нарушить нормальные ответы на внешние стимулы и образование LTM.Уровни DopR обычно настраиваются miR-276a для обеспечения оптимального баланса. Интригующая гипотеза состоит в том, что длительная пластичность уровней DopR внутри EB может влиять на восстановление LTM, изменяя возбуждение запаха CS +, такого как MCH.
Обсуждение
Было предположено, что
MiRNAs обеспечивают устойчивость генным регуляторным сетям (Herranz and Cohen, 2010; Peláez and Carthew, 2012), но они также могут действовать как судьба клетки или переключатели развития (Flynt and Lai, 2008). В головном мозге нарушения биогенеза miRNA имеют большое влияние на развитие, нейродегенерацию (Giraldez et al., 2005; Kim et al., 2007a; Schaefer et al., 2007; Бердник и др., 2008; Cuellar et al., 2008; Davis et al., 2008), а также поведения, такого как циркадные ритмы и память. Напр., Нарушение у мышей фермента, обрабатывающего miRNA, Dicer усиливает синаптическую пластичность и память о страхе (Konopka et al., 2010). Тип-специфическое нарушение клеточного типа dicer-1 у Drosophila также нарушает циркадное поведение (Kadener et al., 2009). Поскольку такие нарушения биогенеза miRNA и эффекторного аппарата влияют на продукцию или функцию всех или большинства miRNAs, неудивительно, что фенотипические эффекты являются повсеместными и плейотропными.
Исследования профиля
MiRNA в головном мозге на самом деле демонстрируют, что разные типы нейрональных клеток экспрессируют разные популяции miRNA, а некоторые из нейрональных miRNA распределяются по разным субклеточным локализациям (Lagos-Quintana et al., 2002; Krichevsky et al., 2003; Kim et al. ., 2004, 2007a; Miska et al., 2004; Sempere et al., 2004; Kaern et al., 2005; Kye et al., 2007; Landgraf et al., 2007; Edbauer et al., 2010; Natera- Naranjo et al., 2010; Miñones-Moyano et al., 2011; He et al., 2012).Более того, каждый ген miRNA в принципе может регулировать множество различных мишеней для разных типов клеток, и каждая мРНК в принципе может быть нацелена на несколько miRNA. Таким образом, специфичные для клеточного типа манипуляции с отдельными miRNAs в контексте in vivo необходимы для расшифровки основных механизмов и функционально значимых мишеней. В серии недавних исследований было показано участие отдельных генов miRNA в развитии мозга, нейродегенерации, пластичности и поведении (Cheng et al., 2007; Karres et al., 2007; Cayirlioglu et al., 2008; Чандрасекар и Дрейер, 2009; Каденер и др., 2009; Rajasethupathy et al., 2009; Gao et al., 2010; Hansen et al., 2010; Magill et al., 2010; Нудельман и др., 2010; Kye et al., 2011; Lin et al., 2011; Mellios et al., 2011; Лю и др., 2012; Луо и Сегал, 2012). Некоторые из этих исследований намекают на идею, что для данного фенотипа несколько miRNA могут сходиться на общей мишени, и есть несколько случаев, когда фенотипические эффекты могут быть опосредованы в значительной степени через одну общую мишень (Cayirlioglu et al., 2008; Юн и др., 2011; Луо и Сегал, 2012). В случае памяти и синаптической пластичности есть некоторые свидетельства конвергенции miRNA (и Piwi-взаимодействующих РНК) на CREB в качестве мишени (Rajasethupathy et al., 2009, 2012; Gao et al., 2010; Yang et al. , 2012). Но все еще существует относительно немного случаев, когда функция гена miRNA была установлена в нервных цепях для специфического поведения, а архитектура последующих регуляторных эффектов miRNAs на функцию мозга в целом и на память в частности плохо изучена.
Мы использовали преимущества как классических, так и современных генетических подходов Drosophila для манипулирования функцией miR-276a в определенных нервных цепях с временной специфичностью. Начиная с гипоморфного аллеля, идентифицированного при прямом мутагенезе (Dubnau et al., 2003), мы сконструировали нулевую мутацию, точные вырезания, спасательные трансгены BAC, GAL4-чувствительные трансгены и GAL4-чувствительный доминантный негативный трансген «губка». Метод «губки» (Loya et al., 2009; Ebert and Sharp, 2010), в частности, предоставил средства для манипулирования функцией miR-276a in vivo с типом клеток и временной специфичностью трансактиваторной системы GAL4.Доказательство принципиальных экспериментов с «губками» для miR-7, miR-8 и miR-9a в соответствующих тканях дает сравнимые фенотипы развития, как классические мутантные аллели с потерей функции (Loya et al., 2009).
Аналогичным образом, «губка» miR-276a, использованная в этом исследовании, была способна фенокопировать эффекты, наблюдаемые у мутантных животных miR-276a . Комбинирование этой доминантно-отрицательной «губки» с реагентами GAL4 / GAL80 ^ts предоставило средства для разделения функции miR-276a пост-развития, лежащей в основе двух разных поведенческих фенотипов, на отдельные нейронные цепи.Это первый пример, в котором функция гена miRNA демонстрируется на поведении животных как с клеточной, так и временной специфичностью. Отдельно тестируя эффекты манипуляции miR-276a в двух разных типах нервных клеток, мы обнаружили различные эффекты на два родственных обонятельного поведения. Когда губка использовалась для вмешательства в функцию miR-276a во всех нейронах, мы наблюдали дефектные реакции на запахи у наивных животных. Это помешало провести полноценный тест на выполнение задачи обонятельной памяти.Удивительно, но экспрессия губки в каждом из основных типов клеток основной обонятельной системы не влияла на обонятельные реакции, но когда мы использовали губку для блокирования функции miR-276a в нейронах EB, мы воспроизвели дефект наивных ответов на MCH. Напротив, экспрессия губки в нейронах МБ не влияла на наивные ответы, что дало возможность проверить обонятельную память без искажений, возникающих из-за дефектов реакции на запах. Клеточная специфичность функции miR-276a в c547 -меченых R2 / R4m EB нейронах для наивных ответов на MCH и во внутренних нейронах MB для LTM также указывает на функционально значимую нижестоящую мишень среди тех, которые были предложены предсказаниями биоинформатики и QPCR. проверки.
Мы сосредоточились на DopR как потому, что он содержит консервативный сайт связывания miR-276a, так и потому, что, как и miR-276a, функция DopR была сопоставлена с МБ для памяти и с EB для наивных ответов (запахи для miR-276a; этанол и поразительный ответ для DopR). Мы смогли подтвердить, что экспрессия DopR регулируется miR-276a как на уровне транскрипта в ответ на индукцию трансгенной miR-276a, так и на уровне белка внутри MB в ответ на экспрессию «губки». Хотя мы не можем быть уверены, что регулирование DopR является прямым, знак эффекта такой же, как и предсказано для прямой цели.Что еще более важно, регулирующие отношения имеют биологическое значение. Оба поведения полностью подавляются при удалении одной копии гена DopR . Это подтверждает вывод, что сверхэкспрессия DopR вносит вклад в оба поведенческих дефекта, наблюдаемые у мутантов miR-276a. Фактически сверхэкспрессии трансгенного DopR в MB было достаточно, чтобы вызвать дефект LTM.
Вместе с литературными данными эти результаты предлагают модель, в которой уровни экспрессии DopR чувствительны к дозе как для LTM, так и для наивных поведенческих реакций.Мы предполагаем, что в физиологических условиях регуляторный модуль miRNA :: DopR регулирует уровни DopR в нервных цепях, лежащих в основе наивных обонятельных ответов и обонятельного LTM (Fig. 5). В случае LTM мутации с потерей функции (Qin et al., 2012) или избыточная экспрессия DopR, вызванная MB (рис. 4 E ), каждая приводит к снижению производительности памяти, аналогичному тому, что наблюдается при экспрессии miR в MB. -276a «губка». Сходным образом эффекты «губки» miR-276a, управляемой EB, спасаются за счет уменьшения количества копий DopR .Эта дозовая чувствительность согласуется с тем фактом, что потеря даже одной копии DopR у животных miR-276a ^{+ / +} вызывает повышенное возбуждение, опосредованное испугом (Lebestky et al., 2009).
Дофаминергическая передача сигналов также, как было продемонстрировано, устанавливает пороги для нескольких типов возбуждения (Van Swinderen and Andretic, 2011). В то время как роль DopR в этих различных формах возбуждения сложна, эффекты на индуцированное этанолом и повторяющееся возбуждение, индуцированное испугом, также были картированы на нейроны R2 / R4m EB, меченные c547 .Таким образом, мы интерпретируем снижение наивной реакции запаха с c547 -управляемой miR-276a «губкой» как результат сниженного обонятельного возбуждения, хотя это еще предстоит проверить. Также следует отметить, что мы проверили влияние губки, управляемой c547-EB, на наивную реакцию только на один запах, MCH.
Потенциальная связь между EB-опосредованным возбуждением и MB-опосредованной обонятельной памятью интригует. Функция рецептора NMDA фактически необходима в этих же нейронах EB для нормального образования LTM (Wu et al., 2007). Таким образом, типы клеток EB, в которых miR276a функционирует для наивного избегания MCH, также являются частью схемы для LTM. Одна привлекательная возможность состоит в том, что поведенческий опыт модулирует функциональные уровни DopR в MB и EB. В этом случае наблюдаемая роль EB в обонятельной LTM может происходить из долговременных изменений CS + возбуждения, опосредованных регуляторным механизмом miR-276a :: DopR.
Сравнение коммерчески доступного приложения для сегментации простаты с традиционными методами увеличения и бипроксимации эллипсоида для измерения объема простаты
Abstract
Обоснование и цели два метода объема эллипсоида с использованием Т2-взвешенной магнитно-резонансной томографии (МРТ).
Материалы и методы Это ретроспективное одобренное IRB исследование 146 пациентов, случайно выбранных из 1600 последовательных мужчин, направленных на Т2-взвешенную МРТ. Все измерения были выполнены одним экспертом-старшим радиологом. Общий объем простаты был рассчитан с использованием автоматического программного обеспечения DynaCAD ^® (RCAD), вручную настроенного DynaCAD ^® (ACAD), традиционного метода эллипсоида (TE) и нового альтернативного метода двупроксимативного эллипсоида (BE). Результаты оценивались с помощью дисперсионного анализа и линейной регрессии.
Результаты Средние объемы для RCAD, ACAD, BE и TE составили 61,5, 58,4, 56 и 53,2 соответственно. ANOVA не показал различия средних значений (p> 0,05). Линейная регрессия показала коэффициент детерминации (r ²) между ACAD и TE, равным 0,92, и между ACAD и BE, равным 0,90. Используя сегментированный ACAD на основе планиграфии в качестве «золотого» стандарта, RCAD завысил объем продаж на 5%. TE и BE занижали объем простаты на 4% и 9% соответственно. Время обработки ACAD — 4.От 5 до 9,5 минут (среднее значение = 6,6 минуты) по сравнению с 1,5 до 3,0 минут (среднее значение = 2,3 минуты) для методов вытянутого эллипсоида.
Заключение Т2-взвешенная сегментация МРТ, скорректированная вручную, вероятно, является наиболее точным измерителем общего объема простаты. DynaCAD, похоже, выполняет эту функцию, но необходима ручная настройка автоматического несовмещения границ. ACAD и RCAD лучше всего подходят для исследовательских целей. Эллипсоидные методы быстрее, удобнее, почти так же точны и практичнее для клинического использования.
Заявление о конкурирующем интересе
Авторы заявили об отсутствии конкурирующего интереса.
Клиническое исследование
NA
Отчет о финансировании
Внешнее финансирование не использовалось.
Заявления авторов
Я подтверждаю, что были соблюдены все соответствующие этические принципы и получены все необходимые разрешения IRB и / или комитета по этике.
Да
Подробная информация об IRB / надзорном органе, предоставившем одобрение или исключение для описанного исследования, приводится ниже:
Институциональный IRB и комитет по этике (Ethsirb) 2018 одобрен.
Получено все необходимое согласие пациента / участника, а соответствующие институциональные формы заархивированы.
Да
Я понимаю, что все клинические испытания и любые другие проспективные интервенционные исследования должны быть зарегистрированы в одобренном ICMJE реестре, таком как ClinicalTrials.gov. Я подтверждаю, что любое такое исследование, указанное в рукописи, было зарегистрировано и предоставлен идентификатор регистрации испытания (примечание: при публикации проспективного исследования, зарегистрированного ретроспективно, просьба предоставить заявление в поле идентификатора испытания, объясняющее, почему исследование не было зарегистрировано заранее) .
Да
Я выполнил все соответствующие инструкции по составлению отчетов об исследованиях и загрузил соответствующие контрольные списки отчетов по исследованиям сети EQUATOR и другие соответствующие материалы в качестве дополнительных файлов, если применимо.
Да
13,5 Законы движения планет Кеплера
Цели обучения
К концу этого раздела вы сможете:
Опишите конические сечения и их отношение к орбитальному движению
Опишите, как орбитальная скорость связана с сохранением углового момента
Определите период эллиптической орбиты от ее большой оси
Используя точные данные, собранные Тихо Браге, Иоганн Кеплер тщательно проанализировал положения на небе всех известных планет и Луны, обозначив их положения через равные промежутки времени.На основе этого анализа он сформулировал три закона, которые мы рассматриваем в этом разделе.
Первый закон Кеплера
Во времена Кеплера преобладала точка зрения, что все планетные орбиты были круговыми. Данные о Марсе представляли собой величайшую проблему для этой точки зрения, и это в конечном итоге побудило Кеплера отказаться от популярной идеи. Первый закон Кеплера гласит, что каждая планета движется по эллипсу, причем Солнце находится в фокусе эллипса. Эллипс определяется как набор всех точек, так что сумма расстояний от каждой точки до двух фокусов является постоянной.(Рисунок) показывает эллипс и описывает простой способ его создания.
Рис. 13.16 (a) Эллипс — это кривая, на которой сумма расстояний от точки кривой до двух фокусов [латекс] ({f} _ {1} \, \ text {и} \, { f} _ {2}) [/ latex] — это константа. Из этого определения вы можете видеть, что эллипс можно создать следующим образом. Поместите булавку в каждый фокус, затем оберните петлю вокруг карандаша и булавок. Удерживая натянутую струну, перемещайте карандаш по полному кругу.Если два фокуса занимают одно и то же место, результатом будет круг — частный случай эллипса. (b) Для эллиптической орбиты, если [латекс] m \ ll M [/ latex], то m следует по эллиптическому пути с M в одном фокусе. Точнее, и m, и M движутся по собственному эллипсу вокруг общего центра масс.
Для эллиптических орбит точка наибольшего сближения планеты с Солнцем называется перигелием . На рисунке она обозначена точкой A . Самая дальней точка — это афелий , обозначенная на рисунке точкой B .Для орбиты Луны вокруг Земли эти точки называются перигеем и апогеем соответственно.
Эллипс имеет несколько математических форм, но все они являются частным случаем более общего уравнения для конических сечений. Есть четыре различных конических сечения, все из которых задаются уравнением
.
[латекс] \ frac {\ alpha} {r} = 1 + e \ text {cos} \ theta. [/ латекс]
Переменные r и [latex] \ theta [/ latex] показаны на (Рисунок) в случае эллипса. Константы [latex] \ alpha [/ latex] и e определяются полной энергией и угловым моментом спутника в данной точке.Константа e называется эксцентриситетом. Значения [latex] \ alpha [/ latex] и e определяют, какая из четырех конических секций представляет путь спутника.
Рис. 13.17 Как и раньше, расстояние между планетой и Солнцем равно r, а угол, отсчитываемый от оси x, которая проходит вдоль большой оси эллипса, равен [latex] \ theta [/ latex].
Один из настоящих триумфов закона всемирного тяготения Ньютона с силой, обратной величине квадрата расстояния, заключается в том, что в сочетании с его вторым законом решение для пути любого спутника представляет собой коническое сечение.Каждый путь, пройденный м. , является одним из четырех конических участков: окружность или эллипс для ограниченных или замкнутых орбит, парабола или гипербола для неограниченных или открытых орбит. Эти конические сечения показаны на (Рисунок).
Рисунок 13.18 Все движения, вызываемые силой, обратной квадрату, представляют собой одну из четырех конических секций и определяются энергией и направлением движущегося тела.
Если полная энергия отрицательная, то [латекс] 0 \ le e <1 [/ latex], а (Рисунок) представляет собой ограниченную или замкнутую орбиту эллипса или круга, где [latex] e = 0 [/ латекс].[Из (Рисунок) видно, что для [latex] e = 0 [/ latex], [latex] r = \ alpha [/ latex], и, следовательно, радиус постоянен.] Для эллипсов эксцентриситет связан с тем, как появится продолговатый эллипс. Круг имеет нулевой эксцентриситет, тогда как очень длинный вытянутый эллипс имеет эксцентриситет около единицы.
Если полная энергия точно равна нулю, тогда [latex] e = 1 [/ latex] и путь представляет собой параболу. Напомним, что спутник с нулевой полной энергией имеет именно убегающую скорость. (Парабола образуется только путем разрезания конуса параллельно касательной вдоль поверхности.) Наконец, если полная энергия положительна, то [latex] e> 1 [/ latex] и путь представляет собой гиперболу. Эти последние два пути представляют собой неограниченные орбиты, где м проходит мимо M один раз и только один раз. Эта ситуация наблюдалась для нескольких комет, которые приближаются к Солнцу, а затем уходят прочь, чтобы никогда не вернуться.
Мы ограничились случаем, когда меньшая масса (планета) вращается вокруг гораздо большей и, следовательно, стационарной массы (Солнца), но (рисунок) также применяется к любым двум гравитационно взаимодействующим массам.Каждая масса образует коническое сечение той же формы, что и другая. Эта форма определяется полной энергией и угловым моментом системы, при этом центр масс системы находится в фокусе. Отношение размеров двух путей обратно отношению их масс.
Орбитальные передачи
С тех пор, как они были открыты, люди мечтали о путешествии к другим планетам нашей солнечной системы. Но как мы можем это сделать лучше всего? Самый эффективный метод был открыт в 1925 году Вальтером Хоманном, вдохновленным популярным научно-фантастическим романом того времени.Теперь этот метод называется передачей Хомана . В случае путешествия между двумя круговыми орбитами перемещение происходит по эллипсу «перехода», который идеально пересекает эти орбиты в афелии и перигелии эллипса. (Рисунок) показывает случай полета с орбиты Земли на орбиту Марса. Как и раньше, Солнце находится в фокусе эллипса.
Для любого эллипса большая полуось определяется как половина суммы перигелия и афелия. На (Рисунок) большая полуось — это расстояние от начала координат до обеих сторон эллипса по оси x , или только половина самой длинной оси (называемой большой осью).Следовательно, для перемещения с одной круговой орбиты с радиусом [латекс] {r} _ {1} [/ latex] на другую круговую орбиту с радиусом [латекс] {r} _ {2} [/ latex] афелий переноса эллипс будет равен значению большей орбиты, а перигелий — меньшей орбите. Большая полуось, обозначенная a , поэтому задается как [латекс] a = \ frac {1} {2} ({r} _ {1} + {r} _ {2}) [/ latex].
Рис. 13.19 У переносного эллипса есть перигелий на орбите Земли и афелий на орбите Марса.
Давайте возьмем случай путешествия с Земли на Марс. На данный момент мы игнорируем планеты и предполагаем, что мы одни на орбите Земли и хотим перейти на орбиту Марса. Из (Рисунок) выражения для полной энергии мы можем видеть, что полная энергия для космического корабля на большей орбите (Марс) больше (менее отрицательно), чем для меньшей орбиты (Земля). Чтобы перейти на эллипс перехода с орбиты Земли, нам нужно будет увеличить нашу кинетическую энергию, то есть нам потребуется увеличение скорости.Самый эффективный метод — это очень быстрое ускорение по круговой орбитальной траектории, которая также проходит по траектории эллипса в этой точке. (Фактически, ускорение должно быть мгновенным, чтобы круговая и эллиптическая орбиты совпадали во время ускорения. На практике конечное ускорение достаточно короткое, чтобы разница не принималась во внимание.) Как только вы вышли на орбиту Марса, вам понадобится еще один прирост скорости, чтобы перейти на эту орбиту, иначе вы останетесь на эллиптической орбите и просто вернетесь в перигелий, с которого начали.Для обратного пути вы просто выполняете обратный процесс с ретро-ускорением в каждой точке пересадки.
Чтобы перейти на эллипс переноса, а затем снова выключиться, нам нужно знать каждую круговую орбитальную скорость и скорости переходной орбиты в перигелии и афелии. Требуемый прирост скорости — это просто разница между скоростью на круговой орбите и скоростью на эллиптической орбите в каждой точке. Мы можем найти круговые орбитальные скорости из (Рисунок). Чтобы определить скорости для эллипса, мы заявляем без доказательства (поскольку это выходит за рамки данного курса), что полная энергия для эллиптической орбиты составляет
[латекс] E = — \ frac {Gm {M} _ {\ text {S}}} {2a} [/ латекс]
, где [latex] {M} _ {\ text {S}} [/ latex] — масса Солнца, а a — большая полуось.Примечательно, что это то же самое, что (рисунок) для круговых орбит, но со значением большой полуоси, заменяющим радиус орбиты. Поскольку мы знаем потенциальную энергию из (Рисунок), мы можем найти кинетическую энергию и, следовательно, скорость, необходимую для каждой точки эллипса. Мы оставляем задачу найти эти скорости переноса для полета с Земли на Марс.
Мы заканчиваем это обсуждение указанием на несколько важных деталей. Во-первых, мы не учли гравитационную потенциальную энергию Земли и Марса или механику приземления на Марс.На практике это должно быть частью расчетов. Во-вторых, время решает все. Вы же не хотите прибыть на орбиту Марса и обнаружить, что его там нет. Мы должны покинуть Землю точно в правильное время, чтобы Марс оказался в афелии нашего переносного эллипса, как только мы прибудем. Такая возможность появляется каждые 2 года. И возвращение также требует правильного времени. Общая поездка займет чуть менее 3 лет! Есть и другие варианты, которые обеспечивают более быстрый транзит, в том числе облет Венеры с помощью гравитации.Но эти другие варианты сопряжены с дополнительными затратами энергии и опасны для космонавтов.
Второй закон Кеплера
Второй закон Кеплера гласит, что планета сметает равные площади за равное время, то есть площадь, разделенная во времени, называемая пространственной скоростью, постоянна. Рассмотрим (рисунок). Время, необходимое планете, чтобы переместиться из позиции A в B , выметая область [латекс] {A} _ {1} [/ latex], — это как раз время, необходимое для перемещения из позиции C в D , подметание [латекс] {A} _ {2} [/ latex], и переход от E к F , подметание [латекс] {A} _ {3} [/ латекс].Эти области одинаковы: [латекс] {A} _ {1} = {A} _ {2} = {A} _ {3} [/ latex].
Рисунок 13.20 Показанные заштрихованные области имеют равные площади и представляют один и тот же временной интервал.
Сравнивая площади на рисунке и расстояние, пройденное по эллипсу в каждом случае, мы видим, что для того, чтобы площади были равными, планета должна ускоряться по мере приближения к Солнцу и замедляться по мере удаления. . Такое поведение полностью соответствует нашему уравнению сохранения (рисунок).Но мы покажем, что второй закон Кеплера на самом деле является следствием сохранения углового момента, которое справедливо для любой системы, имеющей только радиальные силы.
Вспомните определение углового момента из Angular Momentum, [latex] \ overset {\ to} {L} = \ overset {\ to} {r} \, × \, \ overset {\ to} {p} [/ latex ]. В случае орбитального движения [latex] \ overset {\ to} {L} [/ latex] — это угловой момент планеты относительно Солнца, [latex] \ overset {\ to} {r} [/ latex] — вектор положения планеты, отсчитываемый от Солнца, а [latex] \ overset {\ to} {p} = m \ overset {\ to} {v} [/ latex] — мгновенный линейный импульс в любой точке орбита.Поскольку планета движется по эллипсу, [latex] \ overset {\ to} {p} [/ latex] всегда касается эллипса.
Мы можем разделить импульс на две составляющие: радиальную составляющую [латекс] {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {rad}} [/ latex] вдоль линии к Солнцу и составляющую [латекс] {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {perp}} [/ latex] перпендикулярно [латексу] \ overset {\ to} {r} [/ latex]. Перекрестное произведение для углового момента может быть записано как
[латекс] \ overset {\ to} {L} = \ overset {\ to} {r} \, × \, \ overset {\ to} {p} = \ overset {\ to} {r} \, × \, ({\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {rad}} + {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {perp}}) = \ overset {\ to} {r} \, × \, {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {rad}} + \ overset {\ to} {r} \, × \, {\ overset {\ to} { p}} _ {\ text {perp}} [/ latex].
Первый член справа равен нулю, потому что [latex] \ overset {\ to} {r} [/ latex] параллельно [latex] {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {rad} } [/ latex], а во втором члене [latex] \ overset {\ to} {r} [/ latex] перпендикулярно [latex] {\ overset {\ to} {p}} _ {\ text {perp }} [/ latex], поэтому величина перекрестного произведения уменьшается до [latex] L = r {p} _ {\ text {perp}} = rm {v} _ {\ text {perp}} [/ latex] . Обратите внимание, что угловой момент , а не , зависит от [latex] {p} _ {\ text {rad}} [/ latex].Поскольку сила тяжести действует только в радиальном направлении, она может изменяться только [латекс] {p} _ {\ text {rad}} [/ latex], но не [латекс] {p} _ {\ text {perp}} [ /латекс]; следовательно, угловой момент должен оставаться постоянным.
Теперь рассмотрим (рисунок). Небольшая треугольная область [латекс] \ text {Δ} A [/ latex] выметается во времени [латекс] \ text {Δ} t [/ latex]. Скорость идет вдоль пути и составляет угол [латекс] \ тета [/ латекс] с радиальным направлением. Следовательно, перпендикулярная скорость определяется как [латекс] {v} _ {\ text {perp}} = v \ text {sin} \ theta [/ latex].Планета перемещается на расстояние [латекс] \ text {Δ} s = v \ text {Δ} t \ text {sin} \ theta [/ latex] в направлении, перпендикулярном r . Так как площадь треугольника равна половине основания ( r ), умноженной на высоту [латекс] (\ text {Δ} s) [/ latex], для небольшого смещения площадь определяется как [латекс] \ текст {Δ} A = \ frac {1} {2} r \ text {Δ} s [/ latex]. Подставляя вместо [latex] \ text {Δ} s [/ latex], умножая на m в числителе и знаменателе и переставляя, получаем
[латекс] \ text {Δ} A = \ frac {1} {2} r \ text {Δ} s = \ frac {1} {2} r (v \ text {Δ} t \ text {sin} \ theta) = \ frac {1} {2m} r (mv \ text {sin} \ theta \ text {Δ} t) = \ frac {1} {2m} r (m {v} _ {\ text {perp} } \ text {Δ} t) = \ frac {L} {2m} \ text {Δ} t.[/ латекс]
Рисунок 13.21 Элемент области [latex] \ text {Δ} A [/ latex] выметается во времени [latex] \ text {Δ} t [/ latex], когда планета движется под углом [latex] \ text {Δ} \ varphi [/ латекс]. Угол между радиальным направлением и [латексом] \ overset {\ to} {v} [/ latex] равен [latex] \ theta [/ latex].
Площадная скорость — это просто скорость изменения площади во времени, поэтому мы имеем
[латекс] \ text {поверхностная скорость} = \, \ frac {\ text {Δ} A} {\ text {Δ} t} = \ frac {L} {2m}.[/ латекс]
Так как угловой момент постоянен, то должна быть постоянна и пространственная скорость. Это в точности второй закон Кеплера. Как и первый закон Кеплера, Ньютон показал, что это естественное следствие его закона всемирного тяготения.
Третий закон Кеплера
Третий закон Кеплера гласит, что квадрат периода пропорционален кубу большой полуоси орбиты. В работе «Спутниковые орбиты и энергия» мы вывели третий закон Кеплера для частного случая круговой орбиты.{3} [/ латекс]
Мы изменили массу Земли на более общую M , поскольку это уравнение применимо к спутникам, вращающимся вокруг любой большой массы.
Пример
Орбита кометы Галлея
Определите большую полуось орбиты кометы Галлея, учитывая, что она достигает перигелия каждые 75,3 года. Если перигелий составляет 0,586 а.е., что такое афелий?
Стратегия
Нам дан период, поэтому мы можем переставить (рисунок), решив для большой полуоси.{12} \, \ text {m} [/ latex] или 17,8 а.е. для большой полуоси.
Большая полуось составляет половину суммы афелия и перигелия, поэтому мы имеем
[латекс] \ begin {array} {} \\ \ hfill a & = \ hfill & \ frac {1} {2} (\ text {aphelion} + \ text {perihelion}) \ hfill \\ \ hfill \ text { aphelion} & = \ hfill & 2a- \ text {перигелий}. \ hfill \ end {array} [/ latex]
Подставляя значения, которые мы нашли для большой полуоси, и значение, данное для перигелия, мы находим, что значение афелия составляет 35.0 AU.
Значение
Эдмонд Галлей , современник Ньютона, первым заподозрил, что три кометы, о которых сообщалось в 1531, 1607 и 1682 годах, на самом деле были одной и той же кометой. До того, как Тихо Браге провел измерения комет, считалось, что это были одноразовые события, возможно, возмущения в атмосфере, и что на них не влияло Солнце. Галлей использовал новую механику Ньютона, чтобы предсказать возвращение своей одноименной кометы в 1758 году.
Проверьте свое понимание
Почти круговая орбита Сатурна имеет средний радиус около 9.5 а.е. и имеет период 30 лет, тогда как Уран в среднем составляет около 19 а.е. и имеет период 84 года. Согласуется ли это с нашими результатами для кометы Галлея?
Показать решение
Большая полуось для высокоэллиптической орбиты кометы Галлея составляет 17,8 а.е. и является средним значением перигелия и афелия. Это находится между радиусами орбиты Сатурна и Урана 9,5 и 19 а.е. соответственно. Радиус круговой орбиты такой же, как и у большой полуоси, и поскольку период увеличивается с увеличением большой полуоси, ожидается, что период Галлея находится между периодами Сатурна и Урана.
Сводка
Все орбитальные движения соответствуют траектории конической секции. Связанные или замкнутые орбиты представляют собой круг или эллипс; неограниченные или открытые орбиты — это либо парабола, либо гипербола.
Поверхностная скорость любой орбиты постоянна, что является отражением сохранения углового момента.
Квадрат периода эллиптической орбиты пропорционален кубу большой полуоси этой орбиты.
Концептуальные вопросы
Являются ли законы Кеплера чисто описательными или они содержат причинную информацию?
На приведенной ниже диаграмме для спутника на эллиптической орбите с гораздо большей массой укажите, где его скорость наибольшая, а где наименьшая.Какой закон сохранения диктует такое поведение? Укажите направления силы, ускорения и скорости в этих точках. Нарисуйте векторы для тех же трех величин в двух точках, где пересекаются оси y (вдоль малой полуоси), и на основе этого определите, увеличивается ли скорость с уменьшением или с максимальным / минимальным значением.
Показать решение
Скорость наибольшая, когда спутник находится ближе всего к большой массе, и наименьшая, где дальше — в периапсисе и апоапсисе, соответственно.Этой зависимостью управляет сохранение углового момента. Но это также можно понять из закона сохранения энергии: кинетическая энергия должна быть наибольшей там, где гравитационная потенциальная энергия наименьшая (наиболее отрицательная). Сила и, следовательно, ускорение всегда направлены к M на диаграмме, а скорость всегда касается пути во всех точках. Вектор ускорения имеет тангенциальную составляющую вдоль направления скорости в верхнем положении на оси y; следовательно, спутник набирает скорость.{30} \, \ text {кг} [/ латекс]; Значения такие же в пределах 0,05%.
Ио вращается вокруг Юпитера со средним радиусом 421 700 км и периодом 1769 дней. Исходя из этих данных, какова масса Юпитера?
«Средний» орбитальный радиус, указанный для астрономических объектов, вращающихся вокруг Солнца, обычно не является интегрированным средним значением, а рассчитывается таким образом, чтобы он давал правильный период при применении к уравнению для круговых орбит. Учитывая это, каков средний радиус орбиты с точки зрения афелия и перигелия?
Показать решение
Сравните (рисунок) и (рисунок), чтобы увидеть, что они отличаются только тем, что радиус окружности r заменен большой полуосью a .{11} \, \ text {m} [/ latex])? ( Подсказка: Вы можете использовать закон сохранения энергии или углового момента, но последнее намного проще.)
Перигелий кометы Лагерквист составляет 2,61 а.е. с периодом 7,36 года. Покажите, что афелий этой кометы составляет 4,95 а.е.
Показать решение
Большая полуось 3,78 а.е. находится из уравнения для периода. Это половина суммы афелия и перигелия, что дает афелийное расстояние 4,95 а.е.
Каково отношение скорости в перигелии к скорости в афелии у кометы Лагерквист в предыдущей задаче?
У Эроса эллиптическая орбита вокруг Солнца с расстоянием в перигелии, равным 1.13 а.е. и афелийное расстояние 1,78 а.е. Каков период его обращения?
Глоссарий
афелий
самая дальняя точка вращающегося тела от Солнца; соответствующий термин для самой дальней точки Луны от Земли — апогей
Первый закон Кеплера
Закон
, гласящий, что каждая планета движется по эллипсу, при этом Солнце находится в фокусе эллипса
Второй закон Кеплера
закон, гласящий, что планета сметает равные площади в равное время, что означает, что она имеет постоянную пространственную скорость
Третий закон Кеплера
закон, гласящий, что квадрат периода пропорционален кубу большой полуоси орбиты
перигелий
точка наибольшего сближения орбитального тела с Солнцем; соответствующий термин для наиболее близкого сближения Луны с Землей — перигей
Датмы, проекции и системы координат
Грунтовка по геодезии
Геодезия — это наука об измерении и мониторинге размера и формы Земли.Хотя это область науки, с которой большинство людей никогда не сталкивается в академическом смысле, в практическом смысле она затрагивает всех. Без геодезии …
• Мы не смогли точно определить, где мы находимся
• Было бы невозможно составить точные карты
• GPS-навигация сбьет вас с пути
• … и прочая гадость
Способность точно определять местоположения на поверхности Земли является фундаментальной для ГИС и GPS, и это достигается с помощью различных датумов, картографических проекций и систем координат.При работе с Land Mapper или любыми географическими данными важно иметь базовое понимание этих концепций.
Обсуждение ниже даст вам базовое понимание основных концепций геодезии. Чтобы узнать больше, обратитесь к Справочной библиотеке ArcGIS.
Datum — Что это такое?
Проще говоря, датум — это набор чисел, которые определяют форму, размер и положение эллипсоида, который наилучшим образом приближается к истинной поверхности Земли, локально или глобально.
Хорошо, а что такое эллипсоид?
Рассмотрим шар для боулинга. Это сфера. То есть его экваториальный радиус 4,25 дюйма совпадает с его полярным радиусом. Если бы вы могли вращать шар для боулинга с такой скоростью, чтобы центробежная сила могла деформировать шар, его экваториальный радиус был бы немного больше 4,25 дюйма, а его полярный радиус будет немного меньше, чем 4,25 дюйма. В результате сфера будет выглядеть сжатой, как если бы вы сжали ее с обеих сторон одновременно.Эта уплощенная форма называется эллипсоидом (в основном трехмерным эллипсом). Пример деформации вращающегося шара для боулинга — это именно то, что происходит с Землей — его вращение вокруг полярной оси вызывает экваториальную выпуклость, что приводит к сглаживанию полюсов. Эта форма представляет собой эллипсоид (также часто называемый сфероидом — эти два термина можно считать эквивалентными).
Земля в виде эллипсоида
(масштаб сильно преувеличен)
Итак, что такое «набор чисел, определяющих размер, форму и положение эллипсоида»?
Математически эллипсоид можно описать четырьмя параметрами: большой полуосью (экваториальный радиус), малой полуосью (полярный радиус), степенью уплощения и положением эллипсоида относительно центра Земли.Например, вот параметры для нескольких датумов, которые обычно используются в США:
Датаум
NAD27
NAD83
WGS84
Название эллипсоида
Кларк 1866
ГРС 1980
WGS 1984
Большая полуось (метры)
6 378 206.400
6 378 137 000
6 378 137 000
Малая полуось (метры)
6 356 583 800
6 356 752 314
6 356 752 314
Обратное сплющивание
0.00339008
0,00335281
0,00335281
Квадрат эксцентриситета
0,00676866
0,00669438
0,00669438
Тип базы
Местный (Н.Америка)
Местный (Северная Америка)
Глобальный
Вы можете видеть небольшие различия в значениях (выделены жирным шрифтом). Положение эллипсоида относительно центра Земли (обозначенное эксцентриситетом) также варьируется в зависимости от системы координат. Эллипсоиды Clarke 1866 и GRS 1980 расположены так, что поверхность эллипсоида лучше соответствует североамериканскому континенту.Это локальные системы отсчета, поскольку они оптимизированы для использования только в определенной части мира. И наоборот, эллипсоиды глобальных систем отсчета, таких как WGS84, расположены ближе к центру Земли, что дает наилучшее приближение к поверхности Земли в глобальном масштабе.
Иллюстрация различий между локальными и глобальными системами отсчета. Эллипсоид для глобальной системы отсчета
имеет размер и расположение, чтобы лучше всего отображать поверхность Земли в глобальном масштабе.Местные точки отсчета
У
эллипсоиды по размеру и расположению лучше соответствуют конкретному региону Земли.
Значит, эллипсоиды разные. Почему это важно?
Все географические координаты (широта и долгота) производятся от эллипсоида. А поскольку эллипсоиды имеют разные числовые значения, значения широты и долготы для определенных данных не будут иметь одинаковое значение в разных данных. Рассмотрим следующий пример:
Датаум
NAD27
NAD83
WGS84
Долгота
134 ° 21 ‘49.21 «
134 ° 21 ‘55,59 «
134 ° 21 ‘55,66 «
Широта
58 ° 22 ‘3.30 «
58 ° 22 ‘2,13 «
58 ° 22 ‘2,15 «
Все три координаты, указанные выше, определяют одну и ту же физическую точку на поверхности Земли, но значение секунд варьируется.Это связано с разными эллипсоидами, связанными с датумами. Причина, по которой это имеет значение, заключается в том, что если вы не знаете, в каких данных находятся ваши данные, вам или кому-то еще придется угадывать, в каких данных находятся данные, и это значительно увеличивает вероятность позиционных ошибок при импорте данных в Land Mapper или ГИС.
Картографическая проекция — что это?
Картографическая проекция — это просто метод преобразования или проецирования трехмерной поверхности Земли на двухмерную плоскость (например, лист бумаги или компьютерный монитор) с целью создания карты и / или или выполнение вычислений расстояния, направления и площади.Существует множество проекций, каждая из которых оптимизирована для определенной цели. Например, проекция Меркатора лучше всего подходит для морской навигации, потому что направления правильные, а другие качества, такие как площадь, искажены. И наоборот, проекция Mollweide дает точные области, а направления искажаются. Приведенные ниже примеры иллюстрируют различия между этими двумя прогнозами.
Проекция Меркатора. Проезд
точно, но область сильно искажена
Проекция Моллвейде.Площади
точно, но направление искажено
Система координат
— что это такое?
Система координат — это способ описания положения на поверхности Земли. Координаты точки могут быть выражены несколькими способами — в виде широты и долготы, а также в метрах или футах. Координаты широты и долготы используются для обозначения точек в географической системе координат, такой как NAD27 или WGS84. Метры или футы используются с системами координат проекции, такими как коническая равноплощадь Аляски Альберса.
Вопрос на $ 64 000 — зачем мне все это знать?
Простой ответ: если вы не знаете, на какие данные и проекцию ссылаются ваши данные, очень высока вероятность того, что ваши данные не будут правильно согласованы с другими функциями при просмотре в Land Mapper или ГИС. Если вы, как владелец ваших данных, не знаете, на какие данные они ссылаются, другим, кто попытается их использовать, придется угадывать, что, вероятно, приведет к неверным результатам.
Итог — Как правильно ссылаться на географические координаты
При документировании ваших данных или при передаче координат другим лицам вы всегда должны указывать датум и проекцию данных.Например:
Датаум
Проекция
Координата
NAD27
Географический
134 ° 21 ‘49.21 «запад.
58 ° 22 ‘3.30 «северной широты
WGS84
Географический
134 ° 21 ‘55.66 «Запад
58 ° 22 ‘2,15 «северной широты
NAD83
Аляска Альберс Коник
125000 метров на восток
2 570 000 метров на север
Знай свои X и Y…
В приведенных выше примерах точка на Земле отмечена как координата XY. X и Y относятся к местоположениям в декартовой системе координат, где X определяет положение по горизонтальной (X) оси, а Y определяет положение по вертикальной (Y) оси.
• В географической системе координат долгота выражается значением X, а широта — значением Y.
• В системе координат проекции восточное положение выражается значением X, а северное положение выражается значением Y.
… и знай свои знаки
Для географических систем координат критически важно понимать, как север, юг, восток и запад представлены значениями координат. Алгебраические знаки, плюс (+) и минус (-) используются для обозначения направлений по компасу, как таковые:
• Северная широта представлена как положительное значение (+)
• Южная широта представлена отрицательным значением (-)
• Восточная долгота представлена как положительное значение (+)
• Западная долгота отображается как отрицательное значение (-)
Преобразование между форматами широты и долготы
Широта и долгота могут быть выражены в нескольких различных форматах, например:
• 45 ° 24 ‘13.4 «(градусы, минуты, секунды)
• 45 ° 24,223 (градусы и десятичные минуты)
• 45,40372222 ° (десятичные градусы)
Все три приведенных выше примера эквивалентны, то есть идентифицируют одно и то же место на Земле. Вы можете столкнуться с ситуациями, когда вам необходимо указать значения широты и долготы в определенном формате. Например, у вас могут быть координаты широты и долготы в формате градусов, минут и секунд, но программа, с которой вы работаете, может потребовать от вас ввода широты и долготы в формате десятичных градусов.Для этого вам нужно конвертировать из одного формата в другой. Вы можете сделать это с помощью онлайн-конвертера широты и долготы. В Интернете доступно множество таких конвертеров, но вот один очень простой в использовании:
http://rumkin.com/tools/gps/degrees.php
Этот сайт преобразует любой из трех форматов в любой из трех других.
Широта + Долгота + Датум = Полная координата, также известная как LLD = Без проблем!
Случайное использование координат широты и долготы обычно не связано с привязкой к системе отсчета, к которой привязаны широта / долгота.Однако при работе с ГИС требуется более высокий уровень точности, поэтому значения широты и долготы всегда должны включать связанные данные.
Записывая координаты широты / долготы или сообщая кому-либо координаты широты / долготы, вы всегда должны сообщать датум, который используется в координатах. Без информации о системе координат пользователю придется угадывать, в какой точке находятся ваши координаты широты и долготы, и это часто приводит к смещению объектов. Ниже приведены несколько примеров правильного указания координат широты и долготы:
• 45.50, -150.25, NAD27
• 45,50 N, 150,25 Вт, NAD83
• 45 ° 30 ’00 «северной широты, 150 ° 15′ 00» западной долготы, WGS84
Обратите внимание, что для каждого примера указана база данных. Координаты широта и долгота никогда не должны покидать ваш стол без указания точки отсчета. Помните: LLD = Без проблем!
Картограф региона 7 был разработан и поддерживается Службой охраны рыболовства и дикой природы США, Регион 7, Отдел недвижимости.