Он тоже относится к незаменимым аминокислотам, которые получает наш организм извне. Очень важно, чтобы с самого детства поставки этиго вещества было на хорошем уровне. Малыши, которые были по каким-то причинам рано отлучены от материнской груди, могут иметь дефицит изолейцина, что сказывается на физическом и интеллектуальном уровне. Аминокислота принимает участие в восстановлении мышечных тканей, поэтому очень полезна спортсменам и людям с усиленным физическим напряжением. Изолейцин влияет на регуляцию некоторых гормонов, среди которых гормон роста соматотропин и ответственный за усвоение глюкозы — инсулин. Аминокислота актуальна в ежедневном меню людей, придерживающихся любой диеты, даже без мяса или рыбы. И для веганов есть хорошая новость — изолейцин есть в составе многих продуктов растительного происхождения — в киноа, орехах, ржи, бобовых (больше всего в сое и чечевице). Потребляя регулярно блюда из амаранта, вы тоже будете получать эту важную аминокислоту в хорошо усваиваемой форме.

Алифатическая аминокислота любит спортсменов и людей с активным образом жизни. И они должны ее искренне любить и постоянно употреблять, чтобы выдерживать сложные нагрузки и наращивать мышечную массу. Лейцин участвует в синтезе белка, поэтому так нужен тем, кто постоянно посещает спортзал или работает, к примеру, на своем приусадебном участке. Эта аминокислота запускает синтез белка, поэтому способствует увеличению выносливости и силы. Вещество делает чудеса и для пожилых людей — помогает им поддерживать мышцы в хорошем состоянии, а не заплывать лишним жирком. Лейцин сегодня можно принимать и отдельно, как биологически активную добавку к рациону. Но ничто не сравнится с лейцином природного происхождения. Амарант тоже содержит лейциновый незаменимый ингредиент и должен входить в меню современного человека, чтобы держать в надлежащем состоянии мышечную систему.

5. Аспарагиновая кислота

Одна из известных 20 протеиногенных аминокислот может поступать в тело человека вместе с пищей, а также при определенных биологических обстоятельств образовываться самостоятельно. Это — одна из самых важных аминокислот, отвечающая за деятельность эндокринной и нервной системы. Химическое соединение улучшает психическое состояние, важное при депрессивных состояниях, улучшает память, регулирует нервное состояние у здоровых людей и предупреждает заболевания сердечно-сосудистой системы. Важный компонент в мужском здоровье, потому как учавствует в синтезе тестостерона. Продукты с содержанием аспарагиновой кислоты обязательные в меню мужчин после 40 лет. Данная аминокислота — неотъемлемая составляющая в борьбе с гипертонией и при склонности к атеросклерозу. Так, как она помогает в синтезе иммуноглобулинов, то способствует защите организма и лучшему выздоровлению в периоды сезонных вирусных заболеваний. Врачи рекомендуют не злоупотреблять искусственным вариантом аспарагиновой кислоты, а получать ее из доступных источников питания. Суточная норма этого вещества равна 240 граммам амаранта. Аспарагиновая кислота содержится во многих продуктах растительного происхождения: амарант, соя, овсяная каша, бобы, орехи, проросшие семена, чечевица, картофель и другие. У вас есть возможность получать ее в нужном объеме, употребляя что либо из этого ряда продуктов.

Это — известная многим аминокислота с ноотропным действием, то есть успокаивающим. Глицин также есть в амарантовой крупе, свежих листьях и в амарантовом сыродавленном масле . Пожалуй, это одно из самых известных лекарств, которое используют для улучшения умственной деятельности у подростков и взрослых. Но нам известно, что аминокислоты и другие биологические вещества лучше усваиваются без ущерба организму, если они попадают в желудок в составе вкусного обеда. Если бы глицин умел говорить, он бы нам сказал: «не спеши, наслаждайся жизнью». С одной стороны эта аминокислота настраивает нервную систему не обращать внимание на стресс, а с другой — помогает нам в критических ситуациях быстрее решать интеллектуальные задачи. Нервная система успокаивается — мозг работает стабильно и результативно. Поэтому употребление продуктов из амаранта, содержащих глицин (полторы суточной нормы в 100грм) — процесс медитативный и информационно-познавательный в прямом и переносном смысле.

Имея в своем меню амарантовые вкусности, вы будете получать удовольствие и исключительную пользу для всех органов вашего тела. Интеллект, энергия, сила, уравновешенность и стабильное обновления — вот что дают эти аминокислоты нам с вами. Химический состав амаранта невероятно богатый и на другие вещества, кроме этих жизненно необходимых компонентов. Это тот продукт, о котором на 100 процентов можно сказать «наша пища должна быть нашим лекарством». 

7. Лизин.

Одна из важнейших незаменимых протеиногенных аминокислот, которая играет большую роль для растущего организма. Лизин участвует в формировании костей, поэтому продукты с его содержанием должны быть в детском рационе. Кроме этого, лизин становится ценной составляющей при борьбе с вирусными инфекциями. Он помогает противостоять сезонным респираторным заболеваниям. В фармацевтике его назначают для борьбы с герпесом и против проявлений остеопороза. Лизин участвует в создании антител, ферментов и улучшает химический состав крови. Эта аминокислота — один из факторов омоложения человеческих органов, и в частности, кожи — потому что предотвращает недостаточную выработку коллагена. После долгих тренировок спортсмены должны употреблять продукты с высоким соотношением этого химического компонента для быстрого восстановления мышц. Наше тело впитывает лизин из животных продуктов, таких как рыба, красное мясо и яйца. Присутствует он и в растительной пище — соя, картофель и амарант. Суточная норма лизина для людей — от 1 до 3 граммов. Как раз столько его содержится в 170-400 граммах амарантовой крупы.

8. Фенилаланин

Он также относится к незаменимым аминокислотам и, конечно, принимает участие в синтезе белков и нейромедиаторов. Поэтому продукты, содержащие фенилаланин, нужно употреблять для формирования мышечных тканей, для укрепления памяти и при различных видах интеллектуального труда. Эта аминокислота положительно влияет на психическое состояние, поэтому искусственные препараты фенилаланина назначают при депрессиях, и апатии. Легкий обезболивающий эффект дает возможность преодолевать боли, возникающие в результате психосоматических нарушений. Такую сложную задачу фенилаланин выполняет, потому что учавствует в производстве гормона счастья — дофамина. А когда человек чувствует себя более жизнерадостным, то и самочувствие улучшается. Результаты оптимального поступления аминокислоты радует особенно тех, кто имеет хронические болезни. Амарантовое зерно, кроме большого набора полезных химических микроэлементов, имеет и эту замечательную аминокислоту — около 0,5 г на 100 грм. Достаточно высокий показатель, хотя традиционными источниками фенилаланина считают рыбу, красную икру, молочные продукты и твердые сыры. Есть гипотеза, которая еще нуждается в дополнительных научных исследованиях, что это вещество ускоряет метаболизм и способствует уменьшению аппетита у людей, активно занимающихся физическими упражнениями.

9. Аргинин

Эта аминокислота еще известна под названием L-аргинин и очень известна среди врачей, которые назначают искусственные аналоги для решения различных проблем со здоровьем у своих пациентов. Несмотря на доступность биологических добавок «L-аргинин», человеческий организм может получать его из многих продуктов питания: мясо, яйца, грецкие орехи, молоко, рисовая, бобовые, гречневая и пшеничная крупы и, конечно — амарантовое зерно. Суточная норма аминокислоты колеблется — относительно возраста, физической и ментальной нагрузок, сезонных периодов года, когда возрастает расход энергии для борьбы иммунитета с вирусными инфекциями и перепадами температуры. Но в любом случае, взрослый человек должен получать до 6 граммов аргинина ежедневно. Считать наличие аргинина, упортребляя блюда из амаранта очень легко — на каждые 100 грм крупы, листья или масла приходится примерно 1 грм аргинина. Химическое соединение улучшает: выносливость при занятиях спортом; состояние людей с проблемами скачков давления — нормализует кровоток; умственное и физическое развитие детей; общее состояние у беременных; в критические моменты, связанные с травмами и различными заболеваниями, даже повышает спортивные результаты на соревнованиях. Интересный факт: L-аргинин является условно незаменимой аминокислотой, потому что в сложное для организма время, клетки самостоятельно синтезирует это уникальное вещество, чтобы заполнить его резкий дефицит.

10. Глутаминовая кислота

(S) -2-аминопентандиоева кислота — такое химическое название полезного и вкусного ингредиента. И эта кислота, пожалуй, известна, каждой хозяйки на кухне, а не только химикам, врачам или студентам, изучающим биологию. Ведь во многие приправы добавляется соединение «глутамат натрия», который является традиционным усилителем вкуса. При производстве продуктов питания часто добавляется искусственно созданный аналог глутаминовой кислоты, поэтому, наверное, ее современное человечество получает в больших количествах. Но и потребность в ней тоже немаленькая: 16 граммов в сутки ждет наш организм этого биологического компонента, или — 25% от всех необходимых аминокислот. Есть глутаминовая кислота и в амарантовый крупе, хлопьях, зелени и в амарантовом масле холодного отжима. Это вещество нужно почти всем системам человеческого тела, но больше всего — для плазмы крови, мозгу, мышцам и нервной системе. Кислота стимулирует окислительно-восстановительные процессы в головном мозге, принимает участие в нормализации обмена веществ, является профилактическим средством при гипоксии, выводит наружу лишний аммиак и совершает еще очень много других важных функций.

11. Серин

Также весьма важное химическое соединение. Оно участвует в создании белков и относится к алифатическим оксимоноаминокарбоновым кислотам в общей классификации аминокислот. Следует отметить, что серин распадается при нагревании, поэтому его лучше употреблять в продуктах, не требующих варки. Чтобы получить из амаранта эту аминокислоту, добавляйте его листья в салаты или употребляйте свежее амарантовое масло. Серин производится организмом и самостоятельно при условии достаточного количества белков в рационе человека. Это многофункциональный компонент, выполняющий уникальные задачи для нашего организма: отвечает за передачу нервных импульсов в мозг; действует, как легкое обезболивающее и вообще улучшает интеллектуальные способности; принимает участие в усвоении витаминов и других микроэлементов в кишечнике; в синтетической форме применяется для лечения психических заболеваний и нарушений; восстанавливает кожу и костные ткани; имеет антивозрастной эффект. Так как серин предлагается фармацевтическими производителями, то имеет иногда противопоказания. Потому лучше его получать из натуральных источников питания, которыми, в первую очередь, и являются амарантовые продукты.

         Чтобы выяснить объективную информацию, мы обратились к известному в мире порталу, предоставляющему объективные и проверенные цифры о содержании различных веществ в продуктах питания. Информация исследована и предоставлена Американским департаментом сельского хозяйства (U.S. DEPARTMENT OF AGRICULTUREUSDA). Она предназначена, в первую очередь, для фермеров и научных работников Соединенных Штатов. Так, что есть все причины доверять этим данным, ведь они публикуются после тщательных исследований и проверок работниками этого государственного учреждения. Не обошел этот сервис и наш целебный амарант, за что создателям большой поклон и благодарность. Приводим состав химических компонентов амаранта на основе нешлифованный крупы. Естественно, что эти вещества в различных пропорциях переходят в другие продукты, которые производятся на основе собранного урожая зерна.

Химический состав амарантового зерна:

Калорийность — 371 ккал,
Вода — 11,29 грм,
Протеин — от 12,62 до 15,01 грм,
Масло — от 6,3 до 8,41 грм,
Зола — 2,88 грм,
Углеводы — 65,25 грм,
Клетчатка — от 6,3 до 7,4 грм,
Сахара — от 1,4 до 1,95 грм,
Сахароза — от 1,12 до 1,65 грм,
Глюкоза (декстроза) — от 0,23 до 0,3 грм,
Фруктоза — 0,01 грм,
Мальтоза — 0,01 грм,
Крахмал — от 50,13 до 61 грм,
Сквален — от 0,4 до 6,8 грм (или 6-8% в масле)
Кальций — от 129 до 211 мг,
Железо — от 5,96 до 8,61 мг,
Магний — от 216 до 294 мг,
Фосфор — от 502 до 649 мг,
Калий — от 478 до 537 мг,
Натрий — 4 мг,
Цинк — от 2,66 до 3,07 мг,
Медь — от 0,411 до 0,636 мг,
Марганец — от 2,79 до 3,73 мг,
Селен — от 2,2 до 46,5 мг,
Тиамин — от 0,015 до 0,21 мг,
Рибофлавин — от 0,137 до 0,24 мг,
Ниацин — от 0,883 до 0,948 мг,
Пантотеновая кислота — от 1,25 до 1,61 мг,
Витамин B-6 — от 0,518 до 0,654 мг,
Витамин Е (альфа-токоферол) — от 0,37 до 2,02 мг,
Каротин, beta — 1 мг,
Бетаин — 67,6 мг,
Токоферол, beta — 1,94 мг,
Токоферол, gamma — от 0,01 до 0,39 мг,
Токоферол, delta — 1,18 мг,
Токотриенолы, beta — 0,96 мг,
Токотриенолы, gamma — 0,87 мг.

Аминокислоты:

Триптофан — 0,181 грм,
Треонин -0,558 грм,
Изолейцин — 0,582 грм,
Лейцин — 0,879 грм,
Лизин — 0,747 грм,
Метионин — 0,226 грм,
Цистин — 0,191 грм,
Фенилаланин — 0,542 грм,
Тирозин — 0,329 грм,
Валин — 0,679 грм,
Аргинин — 1,06 грм,
Гистидин — 0,389 грм,
Аланин — 0,799 грм,
Аспарагиновая кислота — 1,261 грм,
Глутаминовая кислота — 2,259 грм,
Глицин — 1,636 грм,
Пролин — 0,698 грм,
Серин — 1,148 грм.

Как видим, химический анализ этой культуры очень разнообразен и амарант становится крайне необходимым для диетического и сбалансированного питания. Не секрет, что рацион современных людей обеднел за последнее столетие. Ученые также отмечают, что наша микрофлора страдает от антибиотиков, большого количества углеводов и однообразия пищи. От этого ослабевает иммунитет, главные системы органов недополучают жизненно важные микроэлементы, витамины и аминокислоты (целых 18 видов!). Это сказывается не только на нашем физическом самочувствии, но и на эмоциональном состоянии. Большинство населения сосредоточено в городах и вынуждено получать набор нужных компонентов из стандартного набора продуктов животного или растительного происхождения. Несмотря на то, что в последние годы в наших супермаркетах мы уже можем купить больше видов зелени и экзотических фруктов, меню все равно оставляет желать лучшего. Амарант — современный суперфуд, то есть полезная культура, которая может обеспечить нужными веществами человеческий организм в разные периоды жизни. Один амарант своей питательностью и большим перечнем макро и микроэлементов заменяет десятки различных овощей, фруктов, разных видов круп и, что главное — становится альтернативой животного белка.

Критические аминокислоты, ответственные за преобразование специфичности белков и за усиление эволюции ферментов, расположены вокруг потенциалов β-поворота: прогноз на основе данных

Незаменимые аминокислоты — обзор

F Сохранение пищевых продуктов и производство пищевых и кормовых ингредиентов

Ферментация — это экономичный процесс консервирования пищевых продуктов, который также может улучшить вкус, аромат и текстуру пищи, улучшить ее питательные качества усвояемость, детоксикация загрязненных пищевых продуктов, сокращение времени приготовления и потребности в топливе (Liu et al ., 2011б). Во многих развивающихся странах ферментированные продукты являются важными составляющими рациона и производятся в основном в домашних хозяйствах и деревнях. Таким образом, большинство мелкомасштабных ферментаций основано на спонтанных процессах, возникающих в результате деятельности различных микроорганизмов, связанных с сырьем пищевым материалом и окружающей средой. Большинство ферментированных продуктов в Африке производится путем спонтанной ферментации, например, Cingwada (ферментированная маниока) в Восточной и Центральной Африке, Kenkey (ферментированная кукуруза) в Гане и Owoh (ферментированные семена хлопка) в Западной Африке (FAO, 2011e). .Однако ограничения включают усиленную лаг-фазу роста микробов, связанную с заражением конкурирующими микроорганизмами, то есть более высокую вероятность порчи, изменчивое качество продукта и более низкий выход продукта (Holzapfel, 2002).

Заквасочные культуры — это препараты живых микроорганизмов, которые добавляют для инициирования и / или ускорения процессов ферментации (FAO, 2011e). Заквасочная культура может быть получена посредством практики обратного отваивания (добавление образца из предыдущей успешной партии ферментации) или может быть «определенной заквасочной культурой», состоящей из одного или нескольких штаммов, обычно получаемых путем поддержания чистой культуры и размножения в асептических условиях. (ФАО, 2011e).Примеры ферментированных пищевых продуктов, произведенных с использованием обратного отваливания, включают ферментированные злаки и зерно в Африке и ферментированные рыбные соусы и овощи в Азии (FAO, 2011e). Штаммы, отобранные для определенных заквасок, должны обладать несколькими желательными метаболическими характеристиками, не обладать токсикогенной активностью, а также подходить для крупномасштабного производства (Gänzle, 2009). Определенные заквасочные культуры позволяют стандартизировать процесс вместе с пониженным риском для здоровья и часто включают дополнительные культуры для подавления патогенных организмов или организмов, вызывающих порчу пищевых продуктов, а также для улучшения качества продукции (Mendoza et al ., 2011; Сеттанни и Москетти, 2010).

Молочнокислые бактерии являются преобладающими микроорганизмами в пищевых ферментациях. Они превращают углеводы либо в молочную кислоту, либо в углекислый газ и этанол в дополнение к молочной кислоте и отвечают за многие продукты, такие как ферментированные колбасы, все ферментированное молоко, маринованные овощи и хлеб из кислого теста (Flores and Toldra, 2011; Liu et al. al ., 2011b; Steinkraus, 2002). Бактерии уксусной кислоты играют важную роль в пищевой промышленности из-за их способности окислять сахара и спирты в органические кислоты и используются в производстве уксуса, а также в ферментациях какао и кофе (Sengun and Karabiyikli, 2011).Третья группа бактерий, принадлежащих к роду Bacillus , гидролизует белки до аминокислот и пептидов и выделяет аммиак. Такая щелочная ферментация семян растений, а также бобовых дает богатые белком приправы, особенно в Африке и Азии (Parkouda et al ., 2009). Ферментация дрожжей, обычно с участием вида Saccharomyces , приводит к образованию этанола и углекислого газа из сахара и широко используется для производства квасного хлеба и сброженных напитков, таких как вино и пиво (Sicard and Legras, 2011).

Ферментация, ведущая к обогащению традиционных пищевых продуктов питательными веществами, может иметь огромное влияние на рацион людей в развивающихся странах, которые в значительной степени зависят от одного основного продукта, такого как маниока, кукуруза или рис, для существования. Например, ферментация риса для производства ленточного кетана в Индонезии приводит к удвоению содержания белка и обогащению лизином, незаменимой аминокислотой. Точно так же пульке, производимая ферментацией сока агавы в Мексике, богата витаминами, такими как тиамин, рибофлавин, ниацин, биотин и пантотеновая кислота (Steinkraus, 2002).

Незаменимые аминокислоты, образующиеся при микробной ферментации, также используются в качестве добавок в корма для домашнего скота на основе зерна, как для повышения продуктивности, так и для уменьшения выделения азота животными в окружающую среду (FAO, 2011c). В настоящее время ежегодное глобальное использование l-лизина, первой ограничивающей аминокислоты для свиней и второй ограничивающей аминокислоты после метионина для птицы, оценивается в 900 000 тонн, за которыми следуют 65 000 тонн для l-треонина и 1900 тонн для l-триптофана. (Ким, 2010).L-валин кормового качества продается в ЕС, в то время как l-глутамин, также производимый в процессе ферментации, доступен в Южной Америке и некоторых странах Азии (Kim, 2010). Кроме того, в корма для животных все чаще включаются экзогенные микробные ферменты. Дополнительная фитаза, наиболее широко используемый кормовой фермент, улучшает использование фосфора, а также других минералов у свиней и домашней птицы и может снизить выведение фосфора на 50% (Singh et al ., 2011b).Фитаза недавно также была одобрена для использования в кормах для лососевых в ЕС. ¹⁸⁴ Другими экзогенными ферментами, используемыми в качестве кормовых добавок для улучшения пищеварения, являются ксиланазы, глюканазы, протеазы и амилазы (FAO, 2011c).

Микробные ферменты, полученные путем ферментации в контролируемых условиях, обычно используются в пищевой промышленности. Например, α-амилазы применяются для превращения крахмала в сиропы фруктозы и глюкозы (Souza and Magalhães, 2010), протеазы, такие как химозин, используются в сыроделии, пектиназы используются для экстракции, осветления и концентрирования фруктовых соков, а также танназы. используются для производства растворимого чая (Aguilar et al ., 2008). Микроорганизмы также используются для создания летучих ароматизаторов, которые обладают желательными свойствами, такими как антимикробная и антиоксидантная активность в дополнение к сенсорным свойствам, и более 100 ароматических химикатов доступны на рынке (Berger, 2009). В последние годы растет интерес к использованию процессов микробной ферментации для производства биоэтанола и биодизеля (Cheng and Timilsina, 2010; Demain, 2009; Ruane et al ., 2010; Shi et al ., 2011).

Незаменимые аминокислоты — обзор

7.3.2 Незаменимые аминокислоты

Хотя NEAA могут синтезироваться в организме рыб, сообщалось, что их пищевые добавки могут улучшать, а могут и не улучшать продуктивность рыб, физиологические функции и иммунный ответ в зависимости от вида рыб (Gaye-Siessegger et al., 2007). Было проведено всего несколько исследований влияния NEAA на показатели тилапии. Mambrini и Kaushik (1994) обнаружили, что замена 25% пищевого белка аланином, глутаматом или глицином в рационах с нильской тилапией приводила к 10% снижению роста рыб.Замена 50% смесью трех NEAA привела к заметному снижению роста, более низкому удержанию азота и более высокой экскреции азота. Аналогичные результаты были получены Gaye-Siessegger et al. (2007), где использование синтетических аминокислот нильской тилапией было низким.

В последнее время большое внимание уделяется таурину как пищевой добавке для выращиваемой рыбы и моллюсков (El-Sayed, 2014). Таурин, или 2-аминоэтансульфоновая кислота, является конечным продуктом метаболизма серосодержащих аминокислот.Это нейтральная β-аминокислота, в которой могут быть ионизированы как аминогруппа, так и сульфоновая группа (Jacobsen and Smith, 1968). Несмотря на то, что таурин не включается в белки и не разлагается тканями млекопитающих (Kuzmina et al., 2010), это самая распространенная свободная аминокислота в тканях животных, составляющая 30–50% от всего пула аминокислот, в зависимости от по видам животных (Якобсен и Смит, 1968).

Исторически таурин не считался важным питательным веществом для рыб. Однако недавние исследования показали, что таурин условно необходим, когда этим рыбам дают пищу на основе растительного белка с дефицитом метионина и / или цистеина.Необходимость таурина для выращиваемой рыбы зависит от вида и размера рыбы, естественных привычек питания и предыдущей истории кормления рыб (Takagi et al., 2008; Kuzmina et al., 2010; El-Sayed, 2014). Таурин участвует во многих физиологических функциях, включая развитие мышечной и нервной систем, антиокисление и детоксикацию, модуляцию иммунного ответа, транспорт кальция, развитие сетчатки, метаболизм желчных кислот, осмотическую регуляцию и эндокринные функции (El-Sayed, 2014).

Несколько недавних исследований оценивали влияние дополнительного таурина на рост и репродуктивную способность нильской тилапии.Gonçalves et al. (2011) обнаружили, что дополнительный таурин необходим для оптимальной продуктивности личинок нильской тилапии ( O. niloticus ). Аналогичные результаты были получены Al-Feky et al. (2016a). Личинки нильской тилапии, получавшие рацион на основе SBM с добавлением экзогенного пищевого таурина, показали значительно лучший рост, выживаемость и эффективность кормления, чем те, которые получали рацион без таурина. Для оптимальной производительности требовалось около 9,7 г / кг диетического таурина ^-1 . Аль-Феки и др. (2016b) также обнаружили, что показатели нереста, включая частоту нереста, общее количество нерестов на аквариум, количество нерестов на самку и абсолютную плодовитость, были значительно улучшены с увеличением диетического таурина до 0.8%. Яйца, полученные от маточного стада, скармливаемого 8,3 г таурина ^-1 кг, показали значительно более высокую выводимость и требовали более короткого времени для вылупления и всасывания желточного мешка, а также приводили к более высокому весу личинок, чем при других уровнях таурина в рационе. Эти данные продемонстрировали неспособность нильской тилапии синтезировать таурин и предполагают, что экзогенный таурин необходим для оптимального роста и репродуктивной способности этих рыб. Взаимодействие между диетическим таурином и метионином в рационе на основе растительного белка, получавшего нильскую тилапию, также было продемонстрировано Michelato et al.(2018). Корм для рыб с добавлением метионина, таурина или их смеси демонстрировал сходные показатели роста. Это указывает на то, что добавление таурина в рацион оказывает щадящее влияние на потребность нильской тилапии в метионине.

Ограничение незаменимых аминокислот определяет системный метаболический ответ на разбавление диетического белка

Влияние протеина / незаменимых аминокислот и силовых тренировок на гипертрофию скелетных мышц: пример сывороточного протеина | Питание и обмен веществ

Артикул Google ученый

CAS Статья Google ученый

CAS Статья Google ученый

уроков из системы моделирования дрожжей

Abstract

VopK, эффекторный белок типа III, вовлечен в патогенез штаммов Vibrio cholerae , принадлежащих к различным серогруппам. Эктопическая экспрессия этого белка проявляет сильную токсичность в модельной системе дрожжей. Чтобы картировать критические остатки в VopK, мы сканировали первичную последовательность, руководствуясь доступными данными о различных токсинах и эффекторных белках.Наш in silico анализ VopK показал присутствие предсказанного домена серинпептидазы MCF1-SHE (SHxxxE) в С-концевой области белка. Замена каждого из предсказанных остатков каталитической триады, а именно Ser ³¹⁴ , His ³⁵³ и Glu ³⁵⁷ на аланин, приводила к получению рекомбинантных белков VopK с различной летальностью, как было оценено в модельной системе дрожжей. Мы наблюдали, что замена глутамата ³⁵⁷ на аланин вызывает полную потерю токсичности, в то время как замены серина ³¹⁴ и гистидина ³⁵³ на аланин демонстрируют частичную потерю токсичности, не влияя на стабильность вариантов.Кроме того, замена другого консервативного остатка серина в положении 354 (S ³⁵⁴ ) в предсказанном S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ не влияла на токсичность VopK. По сути, объединенный in silico и сайт-направленный мутагенез, мы идентифицировали критические аминокислоты, способствующие летальной активности VopK в модельной системе дрожжей.

Образец цитирования: Bankapalli LK, Mishra RC, Singh B, Raychaudhuri S (2015) Идентификация критических аминокислот, вызывающих летальность в VopK, эффекторном белке типа III Vibrio cholerae : Уроки из системы моделей дрожжей.PLoS ONE 10 (10): e0141038. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038

Редактор: Эрик Каскалес, Национальный центр научных исследований, Университет Экс-Марсель, ФРАНЦИЯ

Поступила: 21 августа 2015 г .; Одобрена: 28 сентября 2015 г .; Опубликовано: 21 октября 2015 г.

Авторские права: © 2015 Bankapalli et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах бумага.

Финансирование: Эта работа поддержана грантами институциональных проектов OLP-80, надинституционального проекта (SIP-BSC0210E) и GENESIS-CSIR. Лила Кришна Банкапалли и Рахул Чандра Мишра выражают признательность Департаменту биотехнологии (DBT India) и Совету по научным и промышленным исследованиям (CSIR-India) (проект UNSEEN-CSIR) соответственно за их стипендии. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Vibiro cholerae , возбудитель опасного для жизни диарейного заболевания, холеры, обладает множеством факторов, связанных с вирулентностью, коллективное действие которых помогает организму стать успешным патогеном. В последнее время система секреции типа III (T3SS) и несколько эффекторных белков, которые доставляются этим специализированным транспортным механизмом, были вовлечены в патогенез штаммов Vibrio cholerae , принадлежащих к различным серогруппам [1].В последние годы был достигнут значительный прогресс в характеристике различных эффекторных белков T3SS Vibrio cholerae . Из них VopF получил большое внимание. Используя дрожжи, тканевые культуры и модельные системы на животных, было собрано много важных фактов о структурных и функциональных аспектах VopF [2-7]. Помимо VopF, существование дополнительных 11 эффекторных белков было обнаружено в островке T3SS штамма Vibrio cholerae AM-19226 [5]. Из них VopX и VopK проявляют сильную летальность в модельной системе дрожжей [5].Используя систему модели дрожжей, было показано, что VopX взаимодействует с компонентами пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) целостности клеточной стенки. Интересно, что VopK (номер локуса A33_1699) имеет гомологию с Mcf (делает гусениц гибкими), инсектицидным токсином Photorhabdus luminescens , также известным как McfV [8].

В последние годы T3SS и эффекторные белки (T3Es), доставляемые таким экспортным механизмом непосредственно в цитозоль хозяина, привлекают большое внимание.Как следствие, большая работа была приписана получению структурных и функциональных представлений о многочисленных эффекторных белках. В настоящее время есть убедительные доказательства того, как эволюция включила эукариотические мотивы и домены во многие эффекторные белки и токсины [9, 10], тем самым позволяя патогенам узурпировать клеточный аппарат хозяина, используя такие специализированные факторы вирулентности.

До сих пор в литературе имеется ограниченная информация о структурных и функциональных аспектах VopK.В этой работе мы хотели исследовать наличие функциональной единицы и оценить ее вклад в токсическую активность VopK. VopK демонстрирует некоторую гомологию (29% идентичности, 45% положительных результатов) с областью из 136 аминокислот, предшествующей домену Bh4 в Mcf, инсектицидном токсине [8]. Недавно Аравинд и соавторы идентифицировали новый каталитический центр серинпептидазы, иначе известный как домен MCF1-SHE в токсине Mcf [9]. Как показано, каталитическое ядро ​​MCF1-SHE состоит из двух изогнутых спиралей, которые связаны с консервативным серином и мотивом HxxxE [9].Между прочим, этот домен часто наблюдается на крайнем С-конце многих полиморфных токсинов (например, энтомотоксинов из Pseudomonas fluorescens ), а также секретируемых белков различных внутриклеточных и внеклеточных патогенов, что еще больше усиливает его роль в токсической активности таких токсинов [ 9, 11]. Вооружившись доступной информацией, мы просканировали первичную последовательность VopK. Наш in-silico анализ предсказал наличие домена MCF1-SHE и остатков каталитической триады (Ser ³¹⁴ / His ³⁵³ / Glu ³⁵⁷ ) в VopK.Кроме того, мы также идентифицировали другой консервативный остаток серина в положении 354 в пределах предсказанного домена SHE (Ser ³¹⁴ / His ³⁵³ / Glu ³⁵⁷ ). Комбинированный сайт-направленный мутагенез и система модели дрожжей помогли нам оценить вклад этих остатков в предсказанный домен MCF1-SHE VopK, где замена глутамата аланином в положении 357 (Glu ³⁵⁷ Ala) полностью поставила под угрозу функцию, тогда как замены серин и гистидин в положениях 314 и 353 соответственно привели к частичной потере токсичности этого эффекторного белка.Замена серина в положении 354 на аланин не влияла на функциональность VopK.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и среды

Штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Escherichia coli Nova blue (Novagen) использовали для общих целей клонирования. Модель E . Штамм coli размножали при 37 ° C в жидкости с перемешиванием или на твердом (1,5% агар) в бульоне Лурия, если не указано иное. Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) использовали для сверхэкспрессии белка. Saccharomyces cerevisiae штамм BY4741 ( MATa; his3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ 0; ura3Δ 0 ), использованный в этом исследовании (Таблица 1), был выращен в YPD (1% (мас. / Об.) Дрожжевого экстракта, 2% (мас. / v) пептон, 2% (мас. / об.) глюкозы) бульон или агар (2%).

Построение штаммов и мутагенез замещения аланина предполагаемой каталитической триады SHE VopK

Ген vopK амплифицировали из геномной ДНК штамма Vibrio cholerae SC110 с использованием праймеров XhoI VopK и NheI VopK.После проверки фрагмента секвенированием его клонировали в сайты XhoI / NheI pESC-LEU (Agilent Technologies) под контролем промотора GAL1. Согласно инструкциям производителя, ORF, клонированная в этом векторе, будет экспрессироваться как меченый белок с N-концевой Myc-меткой. Положительные клоны были дополнительно подтверждены секвенированием и сохранены в E . coli клеток штамма NovaBlue. Выбранная конструкция, обозначенная как pESC-LEU-VopK, была трансформирована в S . cerevisiae штамм BY4741. Полученный штамм был обозначен как BY4741-LEU-VopK.

Рекомбинантную плазмиду pESC-LEU-VopK использовали в качестве матрицы для реакций мутагенеза аланина. Замещение аланином S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ остатков выполняли с использованием набора Stratagene для одностадийного мутагенеза. Все конструкции были полностью секвенированы для подтверждения клонов и желаемых мутаций в соответствующих положениях. Определенные плазмиды далее трансформировали в BY4741 для получения серии рекомбинантных S . cerevisiae штаммов (таблица 1). Кроме того, мы также клонировали VopK дикого типа и варианты аланина S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ S ³⁵⁴ в сайтах BamHI / SmaI pGMh20, вектора с низким числом копий (RIKEN) под контролем Промотор GAL1 (таблица 1). Согласно инструкциям производителя, ORF, клонированная в этом векторе, также будет экспрессироваться как меченый белок с C-концевой Myc-меткой. Положительные клоны были дополнительно подтверждены секвенированием и сохранены в E . coli клеток штамма NovaBlue. Желаемая конструкция, обозначенная как pGMh20-VopK, была повторно трансформирована в S . cerevisiae штамм BY4741. Полученный штамм был обозначен как BY4741-h20-VopK.

Очистка и протеолитический анализ VopK

VopK очищали хроматографией на Ni ²⁺ -нитрилотриуксусной кислоте (Ni ²⁺ -NTA) в соответствии с опубликованным протоколом [12]. Ген дикого типа клонировали в сайт NdeI-BamHI вектора pET15b (Novagen) для получения N-концевого слитого белка His ₆ -VopK.Клон был подтвержден секвенированием и трансформирован в E . coli BL21 (DE3). После индукции 0,4 мМ IPTG (изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид) белок VopK очищали на колонке Qiagen Ni ²⁺ -NTA. Очищенный белок диализовали в течение ночи в растворе буфера А, содержащем 10 мМ Трис, pH 7,9, 100 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT, 5% глицерин. Анализ протеазы проводили, как описано ранее [13].

Анализ роста дрожжей

Дикий тип и соответствующие производные аланина S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ S ³⁵⁴ остатка VopK были преобразованы в S . cerevisiae штамм BY4741. Трансформированные штаммы дрожжей (таблица 1) выращивали в синтетической селективной среде (SC), содержащей 0,17% (мас. / Об.) Азотистого основания дрожжей без аминокислот, 0,5% (мас. / Об.) Сульфата аммония, 2% (мас. / Об.) Глюкозы. и был дополнен соответствующими аминокислотами и основаниями нуклеиновых кислот. SC ^Gal и SC ^Raf были средой SC, содержащей 2% (мас. / Об.) Галактозы или рафинозы, соответственно, вместо глюкозы. Все рекомбинантные штаммы дрожжей подвергали эксперименту по индукции галактозы, по существу, как описано ранее [4] с модификацией [4, 14].Вкратце, ночные культуры всех рекомбинантных штаммов в среде SC ^Raf разбавляли и снова выращивали в среде SC ^Raf при 30 ° C до экспоненциальной фазы до тех пор, пока OD ₆₀₀ не стала 0,8–1,0. Влияние экспрессии производных VopK и аланина на рост S . cerevisiae BY4741 исследовали путем нанесения равного количества клеток на планшеты SC и SC ^Gal , не содержащие соответствующих ауксотрофных маркеров для поддержания плазмид. За ростом наблюдали через 60-70 часов при 30 ° C и фотографировали соответственно.Анализ роста жидкости проводили, как описано ранее [7, 15]. Вкратце, ночные культуры рекомбинантных штаммов дрожжей, несущих дикий тип и аланиновые варианты VopK, выращенные в рафинозе, снова разбавляли до OD ₆₀₀ 0,05 в 25 мл указанной среды с соответствующими добавками аминокислот. Поглощение измеряли при 600 нм в течение установленного периода.

Приготовление дрожжевых экстрактов и иммуноблот-анализ

Иммуноблот-анализ в основном проводился с использованием опубликованного протокола [7].Все рекомбинантные дрожжевые клетки выращивали в среде SC ^Raf при 30 ° C до середины логарифмической фазы. Затем культуры разводили непосредственно в индукционной среде (SC ^Gal ). После 6 часов индукции культуры осаждали в охлаждаемой центрифуге. Клетки лизировали в 150 мкл разрушающего буфера (50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10% глицерин, 1% тритон X-100, 0,1% SDS, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 1 мМ ортовандат натрия, 50 мМ β-глицеринфосфат, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и смесь ингибиторов протеазы 1X путем интенсивного перемешивания с 0.Стеклянные бусины 3 мм (Sigma)). Экстракты клеток отделяли от стеклянных шариков и клеточного дебриса, собирали в новой центрифужной пробирке центрифугированием и дополнительно осветляли вращением 13000 x g в течение 15 минут при 4 ° C. Концентрацию белка в супернатантах измеряли с помощью набора для анализа белков BCA (Pierce). Пробы белка равной концентрации фракционировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле с использованием 12% полиакриламидных гелей и переносили на мембрану для переноса Immobilon-P (Millipore).Мембраны зондировали либо моноклональным антителом против myc (Thermo Scientific), либо моноклональным антителом против актина (Millipore). Первичное антитело детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена антикроличьего антитела с помощью системы обнаружения Millipore.

Результаты и обсуждение

Экспрессия VopK смертельна для модельной системы дрожжей

В настоящее время растет понимание полезности Saccharomyces cerevisiae , почкующихся дрожжей в качестве модельной системы, не относящейся к млекопитающим, для идентификации и оценки функциональности различных наборов факторов вирулентности [14, 16–21].Ранее наша группа также использовала эту систему модели дрожжей для сбора функциональной информации о другом эффекторном белке Vibrio cholerae [4, 7]. Чтобы изучить летальность VopK, мы экспрессировали VopK эктопически под контролем промотора GAL в S . cerevisiae штамм BY4741 из pESC-LEU, вектора с высоким числом копий (таблица 1). Дрожжевые клетки, трансформированные pESC-LEU-VopK (таблица 1), давали сильный летальный фенотип в условиях индуцирования (рис. 1A).Наши данные по обнаружению также согласуются с предыдущими наблюдениями, сделанными Дзейманом и его коллегами [5]. Мы также наблюдали слабое ингибирование роста в условиях подавления (глюкоза) (рис. 1А). Это можно объяснить с точки зрения неплотной экспрессии промотора GAL1 вектора pESC-LEU. Проблема утечки экспрессии, связанная с промотором GAL1 / 10 из разных векторов, также была задокументирована в более ранних исследованиях [20–22].

Рис. 1. Анализ ингибирования роста дрожжей.

Рост дрожжевого штамма BY4741, экспрессирующего белки дикого типа и мутантные белки VopK под контролем промотора GAL1 из pESC-LEU (A) или pGMh20 (B).Клетки, трансформированные одним пустым вектором, использовали в качестве отрицательного контроля. Указанные штаммы выращивали в течение ночи на неиндуцирующей селективной синтетической среде (SC ^raf ), содержащей 2% рафинозы в качестве источника углерода. Равное количество клеток было нанесено при 10 ° и трех последовательных разведениях: 10 ^-2 , 10 ^-3 и 10 ^-4 (слева направо) на SC ^Glu (левая панель, репрессия) и SC ^{. Гал} (индукционный) агар. Приведенные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038.g001

Более ранние исследования ясно продемонстрировали, что низкий уровень экспрессии эффекторных белков увеличивает специфичность, тогда как высокий уровень экспрессии способствует чувствительности к ингибированию в модельной системе дрожжей [20]. Как видно, некоторые эффекторные белки проявляют токсичность только при высоком уровне экспрессии [20]. В некоторых случаях также предполагается, что высокий уровень экспрессии может приводить к неспецифическим токсическим эффектам [23].Мы хотели выяснить, сохраняет ли низкий уровень экспрессии VopK аналогичную токсичность, представленную в предыдущем разделе, ген, кодирующий VopK дикого типа, был клонирован в pGMh20, векторе с низким числом копий (таблица 1). Дрожжевые клетки, трансформированные pGMh20-VopK (таблица 1), давали летальный фенотип только в условиях индукции (фиг.1B).

Идентификация предсказанного домена MCF1-SHE в VopK

Недавнее множество статей дало богатый сбор данных, из которых видно, как различные бактериальные эффекторные белки эволюционировали с эукариотическими доменами и мотивами, что позволило патогенам захватить и ускользнуть от системы наблюдения за хозяином [10].Чтобы оценить, содержит ли VopK (McfV) какую-либо функциональную единицу, способствующую его летальности, мы провели анализ последовательности с помощью PSI-BLAST (параметры по умолчанию), используя VopK в качестве запроса. Впоследствии множественное выравнивание VopK с полиморфными токсинами и эффекторными белками T3SS обнаруживает присутствие домена MCF1-SHE в VopK (Рис. 2). Предсказанный домен MCF1-SHE в VopK имеет консервативные остатки Ser ³¹⁴ , His ³⁵³ и Glu ³⁵⁷ , где His ³⁵³ и Glu ³⁵⁷ образуют характерный мотив HxxxE (фиг. 2).Дальнейший анализ вторичной структуры также подтверждает, что позиционное распределение этих остатков сходно с таковым в известном домене MCF1-SHE, содержащем токсины и эффекторные белки (Рис. 2, [9]). Мы также заметили остаток глицина (Gly ³¹⁵ ) в непосредственной близости от остатка серина (Ser ³¹⁴ ) (рис. 2), критерий для удовлетворения присутствия каталитической триады сериновой протеазы [24].

Рис. 2. Множественное выравнивание последовательностей белков домена MCF1-SHE.

Выравнивание VopK вместе с другими полиморфными токсинами и эффекторными белками, как проводилось с использованием T-coffee [36].Консервативный и предсказанный мотив SHE отмечен звездочкой ( _* ). Идентичные и похожие области выделены красным и синим цветом соответственно. Спирали во вторичной структуре VopK, предсказанные PSI-PRED [37, 38], показаны как цилиндры (красный и белый градиент), а катушки — как линии (черные). Вторичные элементы VopK перекрываются с элементами других белков, как показано Arvind с коллегами [9]. Номера доступа следующие: ACU77352, Caci_8529 [ Catenulispora acidiphila DSM 44928]; ACY13938, Hoch_1384 [ Haliangium ochraceum DSM 14365]; EEA94476, HopT1-2 [ Pseudovibrio sp.JE062]; EEB62143, hopT1-2 [ Pseudomonas syringae pv . томат Т1]; EDN16474, VopK A33_1699 [ Vibrio cholerae AM-19226]; AAM88787, Токсиновый белок [ Photorhabdus luminescens ].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038.g002

Как показано в предыдущем разделе, VopK содержит каталитические триады, что побудило нас оценить протеазную активность белка в условиях in vitro. В связи с этим рекомбинантный VopK очищали хроматографией на Ni ⁺² -нитрилоуксусной кислоте (Ni-NTA) и подвергали протеазному анализу с использованием азоказеина в качестве субстрата, как описано в другом месте [13].Вопреки нашим ожиданиям, в этом состоянии протеазная активность не была обнаружена с VopK (рис. 3). Аналогичное наблюдение было также замечено Нимчаком и его коллегами, где эффекторные белки семейства HopX, несмотря на сильную гомологию и консервативность каталитических триад, подобных PNGase, не проявляли какой-либо детектируемой ферментативной активности на обычно тестируемых субстратах в условиях in vitro [25]. Это также подтверждается другими исследованиями, что многочисленные эффекторы типа III, принадлежащие к семейству цистеиновых протеаз и протеинкиназ, становятся ферментативно активными в условиях in vitro только в присутствии мишени-хозяина in vivo, или таким ферментам требуется процессинг, чтобы стать активными, или и то, и другое [11 , 26–29].До сих пор мы предположили, что домен сериновой пептидазы MCF1-SHE был предсказан и что в VopK были идентифицированы связанные с ним остатки каталитической триады (Ser ³¹⁴ / His ³⁵³ / Glu ³⁵⁷ ). Основываясь на нашем анализе протеазы in vitro, мы пришли к выводу, что протеазная активность VopK может потребовать присутствия субстратов in vivo и / или активаторов хозяина.

Рис. 3. Анализ протеазы.

Очищенный белок VopK в различных количествах подвергали протеолитической активности с использованием азоказеина в качестве субстрата.Протеиназа К в качестве контроля (1, 2). 1: протеиназа К 50 мкг; 2: протеиназа К 100 мкг; 3: ВоК 50 мкг; 4: ВоК 100 мкг

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038.g003

Роль предсказанных остатков каталитической триады Ser

Чтобы определить значимость S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ остатков в функционировании VopK, выбранные аминокислоты были заменены остатками аланина, и соответствующие варианты аланина были преобразованы в S . cerevisiae штамм BY4741. Штаммы рекомбинантных дрожжей подвергали анализу с нанесением пятен на твердый агар на SC и SC ^Gal . Рост каждого рекомбинантного штамма дрожжей в анализе пятен при разведении используется в качестве маркера для оценки степени функционального изменения каждого варианта аланина VopK-SHE. Это было сделано согласно опубликованному протоколу [7]. Например, любой рекомбинантный штамм дрожжей с вариантом белка VopK, который демонстрирует рост при самом высоком разведении, а также показатели восстановления роста, равные или превышающие 70% по сравнению с векторным контролем (рассчитанные на основе средней плотности площади по сравнению с векторный контроль) считается демонстрирующим полное восстановление роста.Напротив, это указывает на полную потерю летальности соответствующего варианта белка VopK, содержащегося в этом рекомбинантном штамме дрожжей. Если процент восстановления роста попадает в диапазон 30–70%, считается, что наблюдается частичное восстановление роста, что дополнительно предполагает частичную потерю токсичности соответствующего варианта белка VopK. Наши данные предполагают, что замена глутамата ³⁵⁷ на аланин привела к полной потере токсичности VopK, в то время как замена гистидина ³⁵³ и серина ³¹⁴ на аланин показала частичную потерю летальности, что оценивалось по росту рекомбинантных штаммов дрожжей в соответствии с параметры, описанные ранее (рис. 1А, [7]).

Чтобы исследовать, обладают ли аланиновые варианты триад SHE (Ser ³¹⁴ Ala / His ³⁵³ Ala / Glu ³⁵⁷ Ala) VopK токсичностью, аналогичной показанной в предыдущем разделе (рис. 1A) при низком уровне экспрессии, мы реконструировали рекомбинантные клоны вариантов аланина SHE в pGMh20, векторе с низким числом копий (таблица 1). Все рекомбинантные клоны в этом векторе впоследствии трансформировали в S . cerevisiae штамм BY4741 и подвергали анализу пятен на твердом агаре.Мы наблюдали аналогичную картину роста, при которой VopK проявлял свою сильную летальность, в то время как замена глутамата в положении 357 на аланин полностью отменяла токсичность варианта VopK-E357A, и как VopK-S314, так и VopK-h453 сохраняли частичную токсичность, как указано в опубликованном методе (рис. 1B, [7]).

Как указано в документации, некоторые эффекторы проявляют измененную токсичность в условиях твердого и жидкого анализа роста в модельной системе дрожжей [18, 20, 30]. Для оценки мы подвергли наши рекомбинантные штаммы дрожжей, несущие производные дикого типа и аланина (Ser ³¹⁴ Ala / His ³⁵³ Ala / Glu ³⁵⁷ Ala) VopK, клонированные как с низкой копией (pGMh20), так и с высокой копией (pESC- LEU) векторов в жидком тесте роста, как описано в других источниках [7, 15].В случае рекомбинантных штаммов дрожжей, несущих дикий тип и мутанты аланина на фоне вектора pGMh20, мы наблюдали согласие между результатами анализа твердого и жидкого роста, где VopK показал свою высокую летальность, а вариант VopK-E357A был нелетальным. С другой стороны, VopK-S314A и VopK-h453A сохранили частичную потерю токсичности (фиг. 1B и 4A). В случае рекомбинантных штаммов дрожжей, несущих дикого типа и аланиновые варианты фона вектора pESC-LEU, мы заметили, что данные совпадают для VopK и VopK-E357A варианта как в твердых, так и в жидких условиях роста (рис. 1A и 4B).Но частичная потеря токсичности VopK-S314A и VopK-h453A несопоставима в этих условиях. В анализе на рост в жидкости VopK-S314A и VopK-h453A показали немного большую летальность, чем при нанесении пятен на твердый агар (рис. 1A и 4B). Несоответствие паттернов летальности вариантов VopK-S314A и VopK-h453A на фоне pESC-LEU (вектор с высоким числом копий) в твердых и жидких условиях роста можно объяснить уровнем экспрессии в разных условиях роста, как было показано ранее [18, 20 , 30].

Рис. 4. Анализ роста жидкости.

Кривые экспоненциального роста демонстрируют влияние белков дикого типа и мутантных белков VopK из pGMh20 (A) или pESC-LEU (B) на BY4741. Культуры выращивали в среде SC (неиндуцированной, левая панель) и среде SC ^Gal (индуцированная, правая панель). OD ₆₀₀ трех технических повторов отслеживались. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение от среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038.g004

Можно предположить, что потеря летальности (полная и частичная) у различных конгенеров аланина VopK (Ser ³¹⁴ Ala / His ³⁵³ Ala / Glu ³⁵⁷ Ala) может быть результатом нестабильности рекомбинантных белков в условиях in vivo .Чтобы гарантировать стабильность in vivo всех конгенеров аланина VopK, вестерн-блоттинг-анализ рекомбинантных штаммов дрожжей, несущих варианты аланина дикого типа и SHE (Ser ³¹⁴ Ala / His ³⁵³ Ala / Glu ³⁵⁷ Ala) VopK в векторе pESC-LEU проводили с использованием антител против myc, как описано ранее [7]. Наши данные вестерн-блоттинга ясно показали, что все производные аланина, такие как VopK-S314A, VopK-h453A и VopK-E357A, были стабильны в условиях in vivo (фиг. 5).Следует отметить, что стабильность белка дикого типа относительно ниже, чем у соответствующих вариантов аланина. Подобное наблюдение также было зарегистрировано ранее, когда мутанты оказались более стабильными, чем дикий тип [14, 22, 25].

Рис. 5. Вестерн-блоттинг.

Экспрессия белков, меченных myc, в высококопийном векторе, подтвержденная иммуноблот-анализом лизатов цельных клеток, собранных после индукции галактозы, зондированных моноклональными антителами против myc. Антитела против актина использовали в качестве контроля загрузки (нижняя панель).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141038.g005

Изучить важность другого консервативного остатка серина в положении 354 в летальности VopK

Интересно, что существует другой консервативный серин в положении 354 в пределах предсказанной области S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ (фиг. 2). Чтобы установить вклад остатка серина ³⁵⁴ в токсичность VopK, был проведен мутагенез с заменой аланина с использованием pGMh20-VopK в качестве матрицы, а функциональность соответствующего варианта аланина была исследована в модельной системе дрожжей.Мы обнаружили, что токсичность варианта VopK-S354A остается неизменной по сравнению с белком VopK дикого типа, что позволяет предположить отсутствие вклада серина в положении 354 в летальность VopK. Результат пятнистости твердого агара был дополнительно подтвержден анализом роста жидкости, в котором наблюдалась аналогичная картина ингибирования роста (фиг. 4A). Эти данные дополнительно подтверждают важность серина в положении 314 в обеспечении летальности VopK (рис. 1B).

По сути, настоящее исследование показывает: i) идентификацию предсказанного домена MCF1-SHE и родственных каталитических триад в VopK; ii) Отсутствие протеазной активности in vitro можно объяснить отсутствием надлежащих субстратов in vivo или факторов хозяина; iii) Мутагенез с заменой аланина подчеркивает важность S ³¹⁴ H ³⁵³ E ³⁵⁷ в летальности VopK в модельной системе дрожжей, где глутамат в положении 357 в значительной степени участвует в функции VopK.Производное аланина другого консервативного серина (Ser ³⁵⁴ ) в пределах предсказанного домена SHE не влияло на токсичность VopK.

Множество линий сходящихся доказательств ясно подтверждают, как эволюция вносит свой вклад в микробный патогенез за счет включения уникальных функциональных доменов и мотивов в несколько детерминант бактериальной вирулентности [10, 31]. Интеграция уникальных доменов и мотивов наделяет эффекторные белки разнообразными биохимическими активностями, включая (де-) фосфорилирование, (де-) убиквитинилирование, аденилатциклазу, AMPylation, рибозилирование, лиазную реактивность, O-GlcNAцилирование и протеолиз [32].В настоящее время растет понимание эволюции нескольких эффекторных белков (YopJ, YopT, VopA, AvrA, SseL и т.д.) и полиморфных токсинов (таких как MCF1, FitD и HopT1-1) как протеаз, в которых, как было доказано, играют роль остатки каталитической триады. ключевую роль в функционировании таких эффекторов и крупных токсинов [9–11]. Как упоминалось в предыдущем разделе, несколько полиморфных токсинов имеют новый домен сериновой пептидазы, названный доменом MCF1-SHE, имеющий каталитическое ядро, которое включает остатки серина, гистидина и глутамата [9].Следует отметить, что каждый остаток в каталитическом ядре функционирует по-разному в разных протеазах. Например, химотрипсин, трипсин и субтилизин содержат триаду Ser / His / Asp, где вклад остатков серина и гистидина отличается от вклада аспарагиновой кислоты в катализ [33, 34]. В случае протеазы аспартилдипептидазы Salmonella typhimurium можно заметить вариацию традиционной триады Ser / His / Asp, в которой остаток аспартата заменен глутаматом [35].Интересно, что мутагенез остатка глутамата приводит к снижению активности в 100 раз, тогда как мутагенез остатка аспартата в случае традиционной триады (Ser / His / Asp) приводит к снижению активности в 10 000 раз [33, 34]. В случае VopK мы наблюдали полную потерю токсичности VopK-E357A по сравнению с другими производными аланина (например, VopK-S314A и VopK-h453A), что указывает на дифференциальный вклад триадных остатков в функциональность VopK при оценке с использованием дрожжей. модельная система.Кроме того, дрожжевая модель VopK определенно поможет идентифицировать клеточный путь (пути), на который нацелен этот эффекторный белок, который может быть дополнительно оценен в соответствующей системе-хозяине млекопитающего. Такая модель также полезна для скрининга низкомолекулярных ингибиторов против этой эффекторной молекулы. Для решения этих проблем необходимы дополнительные исследования.

Благодарности

Мы благодарим Дипака Бхатта и сотрудников нашей лаборатории за запуск установки для секвенирования и за критические предложения, соответственно.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SR LKB. Проведены эксперименты: LKB RCM. Проанализированы данные: SR LKB RCM BVS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SR LKB. Написал статью: СР ЛКБ. В голову пришла идея: SR. Провел все эксперименты: ЛКБ. Повторили все эксперименты: RCM. Проведенный биоинформатический анализ: BVS. Прочитал и одобрил рукопись: LKB RCM BVS SR.

Список литературы

1. 1. Dziejman M, Serruto D, Tam VC, Sturtevant D, Diraphat P, Faruque SM, et al (2005) Геномная характеристика не-O1, не-O139 Vibrio cholerae выявляет гены для системы секреции типа III.Proc Natl Acad Sci USA 102: 3465–3470. pmid: 15728357
2. 2. Tam VC, Serruto D, Dziejman M, Brieher W, Mekalanos JJ (2007) Система секреции типа III в Vibrio cholerae перемещает нуклеатор актина, подобный гибриду формин / спайр, для стимулирования кишечной колонизации. Клеточный микроб-хозяин 1: 95–107. pmid: 18005688
3. 3. Tam VC, Suzuki M, Coughlin M, Saslowsky D, Biswas K, Lencer WI и др. (2010) Функциональный анализ активности VopF, необходимой для колонизации в Vibrio cholerae .мБио 1: 1–10.
4. 4. Tripathi R, Singh Naorem S, Dureja C, Haldar S, Mondal AK, Raychaudhuri S (2010) VopF, эффекторный белок типа III из штамма не-O1, не-O139 Vibrio cholerae , демонстрирует токсичность в Saccharomyces cerevisiae модель. J Med Microbiol 59: 17–24. pmid: 19779031
5. 5. Alam A, Miller KA, Chaand M, Butler JS, Dziejman M (2011) Идентификация Vibrio cholerae эффекторных белков системы секреции типа III.Заражение иммунной 79: 1728–1740. pmid: 21282418
6. 6. Pernier J, Orban J, Avvaru BS, Jegou A, Romet-Lemonne G, Guichard B и др. (2013) Димерные домены Wh3 в Vibrio VopF способствуют открытию зазубренных концов актиновых филаментов и вспомогательному удлинению. Nat Struct Mol Biol 20: 1069–1076. pmid: 23

   6

7. 7. Tripathi R, Kaithwas V, Dureja C, Raychaudhuri S (2013) Аланин-сканирующий мутагенез Wh3 доменов VopF выявляет остатки, важные для придания летальности в модели Saccharomyces cerevisiae .Ген 525: 116–123. pmid: 23680644
8. 8. Shin OS, Tam VC, Suzuki M, Ritchie JM, Bronson RT, Waldor MK и др. Секреция типа III важна для быстро смертельного диарейного заболевания, вызванного не-O1, не-O139 Vibrio cholerae . mBio 2011, 2: e00106–00111. pmid: 21673189
9. 9. Zhang D, De Souza FR, Anantharaman V, Iyer LM, Aravind L (2012) Системы полиморфных токсинов: всесторонняя характеристика способов торговли, обработки, механизмов действия, иммунитета и экологии с использованием сравнительной геномики.Биол Директ 7: 1–76.
10. 10. Дин П. (2011) Функциональные домены и мотивы эффекторных белков бактериального типа III и их роль в инфекции. FEMS Microbiol Ред. 1-26.
11. 11. Agarwar S, Agarwal S, Biancucci M, Satchell KJF (2015) Индуцированная автопроцессинг цитопатического вещества делает гусеницы гибким эффекторным доменом токсина Vibrio vulnificus MARTX. Cell Microbiol, 23 апреля.
12. 12. Донгре М., Сингх Н.С., Дуреджа С., Педда Н., Соланки А.К., Ашиш и др. (2011) Доказательства того, как консервативный глицин в шарнирной области HapR регулирует его способность связывания ДНК: уроки из естественного варианта.J Biol Chem 286 (17): 15043–9. pmid: 21383015
13. 13. Parente JA, Salem-Izacc SM, Santana JM, Pereira M, Borges CL, Bailao AM и др. (2010) Секретируемая сериновая протеаза Paracoccidioides brasiliensis и ее взаимодействия с грибковыми белками. BMC Microbiol 10: 1–10
14. 14. Calder T, Kinch LN, Fernandez J, Salomon D, Grishin NV, Orth K (2014) Эффектор VPA1380 Vibrio типа III связан с доменом цистеиновой протеазы крупных бактериальных токсинов.PLos One 9: 1–8
15. 15. Trosky JE, Mukherjee S, Burdette DL, Roberts M, McCarter L, Siegel RM и др. (2004). Ингибирование сигнальных путей MAPK с помощью VopA из Vibrio parahaemolyticus . Дж. Биол. Хим. . 279, 51953–51957.
16. 16. Valdivia RH (2004) Моделирование функции факторов вирулентности бактерий в Saccharomyces cerevisiae . Эукариотическая клетка 3: 827–834. pmid: 15302815
17. 17. Sisko JL, Spaeth K, Kumar Y, Valdivia RH (2006) Многофункциональный анализ генов, специфичных для хламидий, в системе экспрессии дрожжей.Мол микробиол 60: 51–66. pmid: 16556220
18. 18. Kramer RW, Slagowski NL, Eze NA, Giddings KS, Morrison MF, Siggers KA, et al (2007) Функциональный геномный скрининг дрожжей приводит к идентификации роли бактериального эффектора в регуляции врожденного иммунитета. Plos Pathog 3: 0179–0190.
19. 19. Siggers KA, Lesser CF (2008) Дрожжи Saccharomyces cerevisiae : универсальная модельная система для идентификации и характеристики белков вирулентности бактерий.Клеточный микроб-хозяин 4: 8–15. pmid: 18621006
20. 20. Slagowski NL, Kramer RW, Morrison MF, LaBaer J, Lesser CF (2008) Функциональный скрининг геномных дрожжей для выявления патогенных бактериальных белков. PLos Pathog 4: 0096–0107.
21. 21. Стирлинг FR, Эванс Т.Дж. (2006) Эффекты секретируемого типа III псевдомонального токсина ExoS в дрожжах Saccharomyces cerevisiae . Микробиология 152: 2273–2285. pmid: 16849794
22. 22. Белый Ю., Тартаковская Д., Таис А., Фитцке Э., Цивелекидис Т., Янк Т. и др. (2012) Фактор элонгации 1А является мишенью ингибирования роста дрожжей, вызываемого глюкозилтрансферазой Lgt1 Legionella pneumophila .J Biol Chem 287: 26029–26037. pmid: 22685293
23. 23. Salomon D, Bosis E, Dar D, Nachman I, Sessa G (2012). Экспрессия эффекторов Pseudomonas шприц типа III в дрожжах в стрессовых условиях показывает, что HopX1 ослабляет активацию пути глицерин-МАП-киназы высокой осмолярности. Microbiol 158: 2859–2869.
24. 24. Гупта В., Удая Пракаш Н.А., Лакшми В., Бупати Р., Джеекантан Дж., Велмуруган Д. и др. (2010) Распознавание активных и неактивных каталитических триад: подход на основе шаблонов.Intl J Biol Macro 46: 317–323.
25. 25. Nimchuk ZL, Fisher EJ, Desveaux D, Chang JH, Dangl JL (2007) Семейство Hopx (AvrPphE) эффекторов Pseudomonas syringae типа III требует каталитической триады и нового N-концевого домена для функционирования. Мол, взаимодействие растений и микробов 20: 346–357. pmid: 17427805
26. 26. Juris SJ, Rudolph AE, Huddler D, Orth K, Dixon JE (2000) Отличительная роль протеинкиназы Yersinia: связывание актина, активация киназы и разрушение цитоскелета.Proc Natl Acad Sci 97: 9431–9436. pmid: 10
    8
27. 27. Axtell MJ, Chisholm ST, Dahlbeck D, Staskawicz BJ (2003) Генетические и молекулярные доказательства того, что шприц Pseudomonas шприц типа III эффекторный белок AvrRpt2 является цистеиновой протеазой. Мол микробиол 49: 1537–1546. pmid: 12950919
28. 28. Shao F, Golstein C, Ade J, Stoutemyer M, Dixon JE, Innes R (2003) Расщепление Arabidopsis PBS1 бактериальным эффектором типа III. Наука 301: 1230–1233. pmid: 12947197
29. 29.Coaker G, Falick A, Staskawica B (2005) Активация фитопатогенного бактериального эффекторного белка эукариотическим циклофилином. Наука 308: 548–550. pmid: 15746386
30. 30. Irena A, Biancucci M, Satchell JFK (2014) Цитотоксичность эффектора токсина Vibrio vulnificus MARTX DUF5 связана с субдоменом C2A. Белки
31. 31. Salomon D, Orth K (2013) Какие патогены научили нас посттрансляционным модификациям. Клеточный микроб-хозяин 14: 269–279.pmid: 24034613
32. 32. Ruter C, Hardwidge PR (2014) «Лекарства от насекомых»: бактериальные эффекторные белки как многообещающие биологические (иммунные) терапевтические средства. FEMS Microbiol Rev 351: 126–132.
33. 33. Ekici DO, Paetzel M, Dalbey ER (2008) Нетрадиционные сериновые протеазы: вариации каталитической конфигурации триады Ser / His / Asp. Prot Sci 17: 2023–2037.
34. 34. Картер П., Уэллс Дж. А. (1988) Анализ каталитической триады сериновой протеазы. Природа 332: 564–568.pmid: 3282170
35. 35. Hakansson K, Wang AH, Miller CG (2000) Структура аспартилдипептидазы обнаруживает уникальную складку с каталитической триадой Ser-His-Glu. Proc Natl Acad Sci USA 19: 14097–102.
36. 36. Notredame C, Higgins DG, Heringa J (2000) T-Coffee: новый метод быстрого и точного выравнивания множественных последовательностей. J Mol Biol 302 (1): 205–17. pmid: 10964570
37. 37. Jones DT (1999) Прогнозирование вторичной структуры белка на основе матриц балльной оценки, зависящих от положения.J Mol Biol 292: 195–202. pmid: 10493868
38. 38. Buchan DWA, Minneci F, Nugent TCO, Bryson K, Jones DT (2013) Масштабируемые веб-сервисы для инструмента анализа белков PSIPRED. Nucleic Acid Res 41: W340 – W348.

Потребление Amino LP7, особой комбинации незаменимых аминокислот, может подавлять развитие деменции, показывает исследование, проведенное в Японии — ScienceDaily

Деменция — состояние, сопровождающееся крайней потерей когнитивной функции, — вызывается различными причинами. расстройства, в том числе болезнь Альцгеймера.По оценкам Всемирной организации здравоохранения, примерно у 10 миллионов человек во всем мире ежегодно развивается деменция, что свидетельствует о высоком психологическом и социальном воздействии этого состояния. Деменция в основном поражает пожилых людей, и до сих пор простые и эффективные стратегии предотвращения этого состояния оставались труднодостижимыми.

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Science Advances , японские исследователи показали, что диета с низким содержанием белка может ускорить дегенерацию мозга на мышах, моделирующих болезнь Альцгеймера.Что еще более важно, они обнаружили, что Amino LP7 — добавка, содержащая семь определенных аминокислот — может замедлять дегенерацию мозга и развитие деменции у этих животных. Их работа расширяет предыдущие исследования, которые продемонстрировали эффективность Amino LP7 в улучшении когнитивных функций.

Доктор Макото Хигучи из Национального института квантовых наук и технологий, один из ведущих ученых, участвовавших в исследовании, объясняет: «У пожилых людей диета с низким содержанием белка связана с плохим поддержанием функции мозга.Аминокислоты — это строительные блоки белков. Итак, мы хотели понять, могут ли добавки с незаменимыми аминокислотами защитить мозг пожилых людей от деменции, и если да, то какие механизмы будут способствовать этому защитному эффекту ».

Во-первых, исследователи изучили, как низкобелковая диета влияет на мозг на мышиных моделях болезни Альцгеймера, которые обычно демонстрируют нейродегенерацию и аномальные белковые агрегаты, называемые агрегатами «тау» в мозгу. Они обнаружили, что мыши, потребляющие диету с низким содержанием белка, не только демонстрировали ускоренную дегенерацию мозга, но также имели признаки плохой нейронной связи.Интересно, что эти эффекты были обращены вспять после добавления Amino LP7, что указывает на то, что комбинация семи конкретных аминокислот может ингибировать повреждение мозга.

Затем группа исследователей изучила, как Amino LP7 влияет на различные признаки дегенерации мозга в модели Альцгеймера. Необработанные мыши демонстрировали высокие уровни прогрессирующей дегенерации мозга, но лечение Amino LP7 подавляло гибель нейронов и, таким образом, уменьшало дегенерацию мозга, даже несмотря на то, что агрегаты тау-белка оставались.По словам доктора Акихико Китамуры, который также руководил этим исследованием, «тау-бляшки в мозге характерны для болезни Альцгеймера, и большинство методов лечения нацелены на них. Однако мы показали, что можно преодолеть отложение тау-белка и предотвратить атрофию мозга с помощью добавок с Амино LP7. »

Затем, чтобы понять, как Amino LP7 защищает мозг, исследователи всесторонне проанализировали изменения на уровне генов, вызванные Amino LP7. Их выводы были весьма обнадеживающими. Они заметили, что Amino LP7 уменьшает воспаление головного мозга, а также предотвращает попадание кинуренина, индуктора воспаления, в мозг, тем самым предотвращая атаку воспалительных иммунных клеток на нейроны.Они также обнаружили, что Amino LP7 снижает гибель нейронов и улучшает нейронные связи, улучшая функцию мозга.

«Эти результаты показывают, что незаменимые аминокислоты могут помочь поддерживать баланс в головном мозге и предотвращать его ухудшение. Наше исследование — первое, в котором сообщается, что определенные аминокислоты могут препятствовать развитию деменции», — говорят д-р Хидеаки Сато и д-р Юхей Такадо. , оба из которых внесли большой вклад в исследование. «Хотя наше исследование проводилось на мышах, оно вселяет надежду на то, что потребление аминокислот может также изменить развитие деменции у людей, включая болезнь Альцгеймера», — добавляют они.

Исследование, проведенное этой исследовательской группой, открывает несколько возможностей для лучшего понимания того, как возникают деменции и как их можно предотвратить. Учитывая, что Amino LP7 улучшает функцию мозга у пожилых людей без когнитивных нарушений, их результаты показывают, что он также может быть эффективен у людей с когнитивной дисфункцией.

Действительно, эта добавка, на которую подана заявка на патент, однажды может помочь миллионам людей во всем мире жить улучшенной жизнью без деменции.