Содержание

Белок, гастробистро в Новосибирске на метро Красный проспект — отзывы, адрес, телефон, фото — Фламп

Дубль два или попытка #NumberTwo

Пронюхав отзывы в инстаграм что нынче едят и какие блюда жалуют, захотелось и мне. Отправилась в гастробистро дать ему ещё один шанец.

На первых порах как было — заведение без сайта, а меню в хайлайтс. Те, у кого нет инстаграм — крепитесь, настало не ваше время и вы останетесь за бортом цивилизации. Я за…

Показать целиком

Дубль два или попытка #NumberTwo

Пронюхав отзывы в инстаграм что нынче едят и какие блюда жалуют, захотелось и мне. Отправилась в гастробистро дать ему ещё один шанец.

На первых порах как было — заведение без сайта, а меню в хайлайтс. Те, у кого нет инстаграм — крепитесь, настало не ваше время и вы останетесь за бортом цивилизации. Я за информативный сайт и не испытываю любови любовной к инстаграм. А теперь Ковид диктует свои правила, хочешь крутиться в общепите — готовь плюсом навынос и подключай доставку на кухни в том числе ковид-диссидентов.

Так и родился сайт с меню на доставку.

С прошлого своего посещения и отзыва в этот раз я закрыла глаза на простреленный летник (благо, не сезон), который даже кто-то нахваливает! Но крючок в туалете всё же проверила на выносливость.

Поразительно, но вывороченный крючок так и норовит окончательно и бесповоротно вывалиться — примус не починяется, зато композиция из лаванды прекрасно себе красуется. Здесь про высокую авторскую еду, скажете вы, какие крючки, плюнь и размажь😆

Основное меню отныне отпечатано четко на приятной ламинированной бумаге. «Специальное» и «новинки» как и прежде на бумаге не четко пропечатаны.

Подают воду, что очень кстати в таком месте. Чтобы что-то эдакое распробовать и не забивались вкусовые сосочки.

🍴Одно из нашумевших блюд — крем-брюле из печени цыпленка с абрикосовым джемом. Сочетание соленого и сладкого, необычно точно и непривычно однозначно. Паштет отныне не намазывается на краюшку хлеба, а набирается в ложечку и закусывается тостом со сладким джемом и ягодами.

Любопытство удовлетворила, дух захватило, но эксперимент не повторю.

🍴Ещё одно интригующее блюдо — оленина, подкопченная на щепе. Эффектное блюдо. Мясо вынесли на камне и только что готовым с запахом костерка… (дам вам время воспроизвести этот неизбывный аромат)! Мясо оленя было со спецефическим привкусом — то ли от старости, то ли ещё от чего (знаете как у возрастной баранины бывает). Грибной соус, ещё похоже луковый конфитюр. А как приготовлен и оформлен картофель в виде гратена! Сложносочиненное блюдо всё же рекомендую откушать.

🍴И классика десертного жанра в исполнении крем-брюле с подожженой сахарной корочкой — сладко и вкусно!

🍹Появились лимонадики! Вот это я понимаю😌 Я пила базиликовый на основе сиропа, этот лимонад уместнее было бы украсить листиком базилика, хотя почему бы и нет так.

Понравились музыкальные треки, я поприслушивалась и в то же время покайфовала.

Заведение общепита — это прежде всего его сердце — кухня, но не только, это и другие органы-составные единого организма. Крючок-колхоз, веранда в решето… разгильдяйство.

Приходите для гастрономических утех, испытать нетривиальные свежие вкусы, а на всё остальное предлагается закрыть глаза😌

Приходите бюджет сэкономить, уберечь его от ресторанной экономики и вкусить высокой кухни, а заодно попробовать наесться, может получится😉

Альфа-фетопротеин (альфа-ФП)

Эмбриональный белок, который указывает на состояние плода во время беременности и является онкомаркером для взрослого человека.

Синонимы русские

АФП.

Синонимы английские

Alfa-Fetoprotein, AFP, Maternal Serum Alpha-Fetoprotein (MS-AFP), AFP Tumor Marker.

Метод исследования

Твердофазный хемилюминесцентный иммуноферментный анализ («сэндвич»-метод).

Диапазон определения: 0,5 — 50000 МЕ/мл.

Единицы измерения

МЕ/мл (международная единица на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Альфа-фетопротеин – гликопротеин, который вырабатывается в эмбриональном желточном мешке, печени и эпителии кишечника плода. Молекулярная масса белка – около 70 000 дальтон, период его полураспада составляет 5-7 дней. В организме плода он выполняет функции альбумина взрослого человека: осуществляет транспорт некоторых веществ, необходимых для развития плода, связывает эстрогены, ограничивая их влияние на развивающийся организм, и защищает от негативного воздействия иммунной системы матери.

Альфа-фетопротеин принимает активное участие в полноценном развитии плода, и его уровень должен соответствовать гестационному возрасту (возрасту плода с момента оплодотворения). Максимальное содержание данного белка в крови и амниотической жидкости плода отмечается на 13-й неделе, а в крови матери оно постепенно увеличивается с 10-й недели беременности и достигает максимума на 30-32-й неделях. Через 8-12 месяцев после рождения содержание АФП в крови ребенка снижается до следового количества, как у взрослых.

Альфа-фетопротеин проникает в организм матери через плаценту. Его уровень зависит от состояния желудочно-кишечного тракта, почек плода и плацентарного барьера. В связи с этим АФП используется как неспецифический маркер состояния плода и акушерской патологии. Совместные тесты на АФП, хорионический гонадотропин и эстриол (так называемый тройной тест) на 15-20-й неделях беременности применяются для проверки плода на дефекты развития и хромосомные аномалии, но не являются абсолютными показателями патологии или нормального развития плода. При этом очень важно точно знать гестационный возраст плода, так как уровень АФП в крови отличается на разных неделях беременности.

В организме взрослого человека альфа-фетопротеин отсутствует или обнаруживается в минимальных количествах. Умеренное повышение его уровня может быть вызвано патологией печени, а значительное – низкодифференцированной опухолью – это связано с тем, что некоторые раковые новообразования приобретают свойства эмбриональных тканей и, соответственно, способность к синтезу белков, которые характерны для ранних этапов развития организма.

Резкое повышение АФП преимущественно выявляется при раке печени и половых желез.

При первичной гепатоцеллюлярной карциноме повышение АФП у половины больных можно обнаружить на 1-3 месяца раньше клинических проявлений заболевания. Хотя размеры опухоли, интенсивность роста, стадия процесса и степень злокачественности не пропорциональны количеству альфа-фетопротеина в крови. При прогрессирующей герминогенной несеминоме (опухоли половых желез) определение уровня АФП и хорионического гонадотропина является важным для оценки шансов выживания больных.

Для чего используется исследование?

  • Для пренатальной диагностики патологий развития плода: нарушения закладки нервной трубки, анэнцефалии (тяжелый порок развития, при котором у плода отсутствует часть головного мозга), хромосомных аномалий.
  • Для выявления первичной гепатоцеллюлярной карциномы (рака печени).
  • Для выявления тератобластомы яичка (герминогенной несеминомы).
  • Для диагностики низкодифференцированных опухолей.
  • Для диагностики метастазов опухолей различных локализаций в печень.
  • Для оценки эффективности лечения некоторых онкологических заболеваний и для наблюдения за их течением.

Когда назначается исследование?

  • При обследовании пациента с высоким риском развития опухоли (при циррозе печени, хроническом гепатите, дефиците альфа-антитрипсина).
  • При подозрении на метастазирование опухолей в печень.
  • При обследовании пациента с новообразованием половых желез.
  • До, во время и после лечения некоторых раковых заболеваний.
  • При наблюдении за состоянием в послеоперационный период больных, которым была удалена опухоль.
  • Во втором триместре беременности (между 15-й и 21-й неделями гестации).
  • При обследовании беременных, у которых проводились амниоцентез и биопсия хориона в ранний период беременности.

Что означают результаты?

Референсные значения

Пол

Возраст

Фаза цикла/неделя беременности

Референсные значения, МЕ/мл

Мужской

0 — 13600

1-12 мес.

0 — 23,5

> 1 года

0 — 5,8

Женский

0 — 15740

1-12 мес.

0 — 64,3

> 1 года

Не беременные

0 — 5,8

Беременность (до 12 нед.)

0 — 15

Беременность (12-15 нед.)

15 — 60

Беременность (15-19 нед.)

15 — 95

Беременность (19-24 нед. )

27 — 125

Беременность (24-28 нед.)

52 — 140

Беременность (28-30 нед.)

67 -150

Беременность (30-32 нед.)

100 — 250

Причины повышения уровня альфа-фетопротеина

Онкологические заболевания:

  • гепатоцеллюлярная карцинома (рак печени) (в 70-95 % случаев),
  • герминогенная несеминома (рак яичек),
  • метастазы печени (в 9 %),
  • опухоли других локализаций (рак легкого, кишечника, желудка, почки, молочной железы, поджелудочной железы),
  • эмбриональные опухоли (тератомы).

Другие патологические состояния:

  • острый или хронический активный гепатит (умеренное и непродолжительное увеличение показателя),
  • первичный билиарный цирроз,
  • алкогольная болезнь печени,
  • травмы печени (или хирургические операции),
  • врождённая тирозинемия,
  • атаксия-телеангиэктазия,
  • синдром Вискотта – Олдрича.

Акушерская патология:

  • дефекты нервной трубки плода (расщепление позвоночника, анэцефалия) (80-90 %),
  • нарушение развития мочевыделительной системы (врождённый нефроз, поликистоз почек, отсутствие почки, обструкция),
  • атрезия пищевода или кишечника,
  • пупочная грыжа,
  • гастрошизис (дефект передней брюшной стенки),
  • фетальная тератома,
  • кистозная гигрома,
  • гидроцефалия,
  • дистресс плода,
  • угрожающий аборт,
  • патология плаценты,
  • многоплодная беременность,
  • незавершенный остеогенез.

Причины понижения уровня альфа-фетопротеина:

  • синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме),
  • синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме),
  • синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме),
  • внутриутробная гибель плода,
  • пузырный занос,
  • ожирение беременной.

Снижение уровня АФП после удаления опухоли считается благоприятным признаком и говорит об эффективности лечения.

Что может влиять на результат?

  • Прием пациентом препаратов моноклональных антител может изменить результат анализа.
  • У представителей негроидной расы материнский АФП на 10-15 % выше среднестатистических показателей, у монголоидов – ниже.
  • Инсулин-зависимый диабет приводит к снижению АФП в крови беременной.

Важные замечания

  • Для использования теста в диагностике акушерской патологии необходимо точно знать гестационный возраст плода. Уровень альфа-фетопротеина отдельно не может служить критерием диагностики нарушений развития плода. При обнаружении отклонений уровня АПФ необходимо комплексно обследовать беременную с использованием ультразвуковой диагностики и других лабораторных методов.
  • При повышенном уровне АФП у беременной и отсутствии патологических изменений на УЗИ и амниоцентезе необходимо иметь в виду большую вероятность развития нарушений (например, преждевременные роды, низкая масса тела ребенка при рождении, гибель плода).
  • Не рекомендовано использование АФП для скрининга онкологических заболеваний в общей популяции.
  • Пациенты, принимающие высокие дозы биотина (> 5 мг/день), должны сдавать анализ не раньше 8 часов после употребления препарата.

Твердый белок, переваренный желток. 9 ошибок при варке яиц | Мастер-классы | Кухня

Сварить яйцо для салата — очень простое действие, каждый из нас совершал его множество раз. Тем не менее при варке яиц мы тоже допускаем ошибки. И результат оказывается несколько хуже, чем мог бы быть. Рассказываем, как сделать варку яиц более качественной и безопасной.

Ошибка № 1. Мыть яйца

Точнее, мыть яйца сразу после покупки или заранее, за пару часов до варки. Дело в том, что на яйцах есть природная защитная пленка, а в скорлупе есть поры. И эта пленка не дает бактериям проникать через эти поры внутрь, в яйцо. Если яйцо помыть, то пленка смоется, поэтому бактерии от других яиц, из холодильника, с других продуктов и упаковок могут попасть на яйцо. Кстати, мы можем не смыть сразу все бактерии, которые были на яйцах, вместе с пленкой. И они попадут внутрь.

Так что мыть яйцо нужно непосредственно перед приготовлением, перед тем как вы кладете его в кастрюлю или разбиваете на сковороду.

Ошибка № 2. Горячая вода

Яйца нужно опускать в холодную воду, чтобы они не треснули. Дело в том, что холодное яйцо испытывает температурный стресс при попадании в кипяток, а в холодной воде яйцо согревается постепенно, вместе с водой, и вероятность трещины уменьшается.

Ошибка № 3. Налить мало воды

Если часть яйца не покрыта водой, то оно получится недоваренным. Когда будете чистить, увидите, что бочок яйца жидкий. Нужно, чтобы вода покрывала яйца более чем на один палец, так как она будет быстро выкипать.

Ошибка № 4. Яйца из холодильника

Если вы берете холодные яйца, то они могут не успеть согреться вместе с водой в кастрюльке и в результате треснуть. Поэтому лучше всего достать яйца из холодильника за полчаса-час до варки.

Ошибка № 5. Сильное бурление

После того как яйца закипели, лучше всего убавить огонь до среднего, чтобы вода не бурлила слишком сильно, а яйца не бились друг о друга и стенки кастрюли, ведь они все еще могут треснуть.

Ошибка № 6. Переварить

Когда мы разрезаем яйцо, сваренное вкрутую, то часто можно видеть, что желток покрылся легким серо-синим налетом. Это признак того, что яйцо переварили. Такой желток приобретет не слишком интенсивный, но все же неприятный запах сероводорода, который начинает выделяться при долгой варке. К тому же такое переваренное яйцо теряет свои полезные свойства. Поэтому после закипания нужно варить яйцо не больше 8-10 минут: тогда оно получится крутым, но не переваренным.

Ошибка № 7. Забыть

Это опасно, так как через некоторое время вода в кастрюльке с яйцами просто выкипает, они начинают гореть, неприятно пахнуть, скорее всего, их придется выкинуть. Еще скорлупу яиц может разорвать, и они испачкают кухню. Так что лучше всего поставить таймер, например, на телефоне, чтобы не пропустить момент, когда нужно снять яйца с плиты.

Ошибка № 8. Оставить в воде

Часто мы просто выключаем огонь после того, как время варки истекло, и занимаемся другими делами. А яйца остывают сами. Это не слишком правильно. Во-первых, яйца в горячей воде перевариваются (см. пункт № 6 ), а во-вторых, они будут плохо чиститься.

Ошибка № 9. Чистить горячими

Если времени очень мало, хочется только что сваренные яйца быстро очистить и нарезать. Это плохая идея. Горячие яйца очень плохо чистятся. Пленки под скорлупой прилипли к ней и отрываются от яйца вместе с кусочками белка. Чтобы скорлупа легко отходила, яйцо нужно остудить в холодной воде.

Салат с крабовыми палочками в яйце

Фото: Shutterstock.com
  • 6 яиц
  • 1 упаковка крабовых палочек
  • 1 огурец
  • Майонез
  • Несколько веточек укропа

Шаг 1. Яйца отварить вкрутую, остудить, очистить.

Шаг 2. Яйца разрезать пополам, отделить желтки от белков, делать это очень аккуратно, так, чтобы не повредить белок.

Шаг 3. Крабовые палочки и огурец нарезать очень мелко, перемешать, раскрошить туда же 5 желтков.

Шаг 4. Очень мелко нарезать укроп, все перемешать, заправить майонезом.

Шаг 5. Посолить и поперчить, если нужно.

Шаг 6. Разложить салат по половинкам белка.

Шаг 7. Яйца выложить на блюдо, раскрошить сверху оставшиеся желтки, можно посыпать зеленью.

Вегетарианские фаршированные яйца

Фото: Shutterstock.com
  • 6 яиц
  • ¼ болгарского перца
  • 2-3 веточки кинзы
  • 4-5 кружочков цукини или кабачка
  • 1 зуб. чеснока
  • Масло рафинированное
  • Горчица
  • Соль
  • Паприка

Шаг 1. Яйца отварить, охладить, очистить. Разрезать пополам.

Шаг 2. Цукини обжарить в масле, снять на бумажное полотенце, чтобы убрать лишнее масло, потом посыпать нарубленным чесноком и зеленью. Посолить. 

Шаг 3. Жареный цукини нарезать небольшими ломтиками.

Шаг 4. Мелко нарезать перец и обжарить в масле из-под цукини.

Шаг 5. Желтки растереть с 1 ч. л. растительного масла и горчицей на кончике ножа (можно взять майонез). 

Шаг 6. Добавить в желтки обжаренные овощи. 

Шаг 7. Начинить смесью яйца. Посыпать паприкой.

город в Великобритании «терроризировала» белка (фото)

По информации журналистов, белка нападала на детей, пенсионеров и домашних питомцев. Ей дали прозвище Полоска в честь злого персонажа из фильма «Гремлины».

В небольшом городке в Уэльсе случилось ЧП. Белка начала атаковать людей. За двое суток ей удалось покусать 18 человек, а потом грызуна поймали, сообщает Mailonline.

Читайте лучшие материалы раздела на странице «Фокус. Мир» в Facebook

Отмечается, что животное нападало на детей, пенсионеров, а также домашних питомцев в городке Бакли на северо-востоке Уэльса. Кроме того, белку прозвали по прозвищу Полоска в честь злого персонажа из фильма «Гремлины».

В конце концов, грызуна словили и передали в Королевское общество по предотвращению жестокого обращения с животными, которое является благотворительной организацией, работающей в Англии и Уэльсе. Интересно, что женщина, которая словила зверя, также была покусана. Как сообщалась позже, белку усыпили, так как ее нельзя было вернуть в условия дикой природы по закону.

Белка по кличке «Полоска» покусала 18 человек [+–]

Оказывается, в 2019 году в Уэльсе был принят закон, который запретил выпускать серых белок в дикую природу.

Ранее стало известно, что в Британии планировалось накормить серых белок оральным контрацептивом, так как их развелось слишком много.

Напомним, что данный вид белок был привезен в Великобританию из Северной Америки. Сейчас в Британии обитают около 2,5 миллиона серых белок.

Ранее мы сообщали, что на острове Рождества крабы совершили ежегодную миграцию, а местные жители постили в соцсети фотографии крабов на дверях домов, в классах, магазинах и на кухнях.

Канадские кролики, которые болеют сифилисом вымирают от другого редкого заболевания.

Фотопротеин — обзор | ScienceDirect Topics

Зеленый флуоресцентный белок из медузы и его применение

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) был впервые обнаружен в 1960-х и 1970-х годах вместе с люминесцентным белком aequorin из Aequorea victoria (Shimomura et al., 1962). Флуоресценция GFP возникает, когда эккорин взаимодействует с ионами Ca 2+ , что вызывает синее свечение, и часть этой люминесцентной энергии передается GFP, таким образом преобразуя общий цвет в зеленый. Возможности GFP оказались в центре внимания, когда Дуглас Прашер клонировал и секвенировал ген GFP дикого типа в 1992 году. GFP — это белок, состоящий из 238 аминокислотных остатков, который проявляет ярко-зеленую флуоресценцию в синем и ультрафиолетовом свете. Многие морские организмы производят подобную зеленую флуоресценцию, но в этом случае белок изолирован от медузы Aequorea victoria . Это чрезвычайно важно, так как в клеточной и молекулярной биологии он часто используется в качестве репортера для экспрессии генов путем введения гена зеленой флуоресценции во многие бактерии, дрожжи и другие грибы, клетки рыб, растений, мух и млекопитающих, которые будут использоваться. в качестве биосенсоров (Soboleski et al., 2005).

Чтобы увеличить потенциальное использование, разные исследователи сконструировали разные мутанты GFP. Одноточечная мутация улучшила спектральные характеристики GFP, что привело к увеличению флуоресценции, фотостабильности, сдвигу основного пика экстинкции, который соответствует спектральным характеристикам общедоступных наборов фильтров FITC, тем самым увеличивая практическую полезность GFP. Многие другие мутанты также были сконструированы для развития различной окраски, в частности, синий флуоресцентный белок (EBFP), голубой флуоресцентный белок (ECFP), производные желтого флуоресцентного белка (YFP) и производные BFP.Генетически кодируемые репортеры FRET, чувствительные к клеточным сигнальным молекулам, таким как кальций или глутамат, состоянию фосфорилирования белков, комплементации белков, димеризации рецепторов и другим процессам, обеспечивают высокоспецифичные оптические считывания клеточной активности в реальном времени (Чудаков и др., 2010). GFP содержит типичную β-цилиндрическую структуру, состоящую из одного β-листа с α-спиралью, содержащей ковалентно связанный хромофор 4- (п-гидроксибензилиден) имидазолидин-5-он (HBI), который проходит через центр.В отсутствие правильно свернутого каркаса GFP HBI не является флуоресцентным; это существует в основном в неионизированной фенольной форме в GFP дикого типа, что достигается посттрансляционной модификацией, называемой созреванием. Таким образом, сетка водородных связей и взаимодействия электронов с этими боковыми цепями влияют на цвет, интенсивность и фотостабильность GFP и его многочисленных производных. Защита флуоресценции хромофора от тушения водой достигается за счет плотной упаковки цилиндра, исключающего молекулы растворителя (Fei and Hughes, 2001).

GFP широко используются в природе в биологии и других биологических дисциплинах. Другие флуоресцентные белки токсичны по своей природе при использовании в живых системах, но естественно флуоресцентные молекулы, такие как GFP, нетоксичны при освещении в живых клетках. GFP широко используются для маркировки сперматозоидов различных организмов с целью идентификации, как в случае Drosophila melanogaster , где экспрессия GFP может использоваться в качестве маркера определенных характеристик.GFP также могут использоваться в различных структурах, позволяющих различать морфологические особенности. В других случаях гены GFP могут быть встроены в геном организмов в области ДНК, которая кодирует целевые белки, которые контролируются теми же регуляторными последовательностями. Комбинирование нескольких спектральных вариантов GFP — полезный трюк для анализа схем мозга, а также датчиков мембранного потенциала нейрона. GFP могут быть полезным анализом для обнаружения жизнеспособных клеток в криобиологии.

Биолюминесценция в море: фотопротеиновые системы

Фотобелки являются первичными реагентами светоизлучающих реакций различных биолюминесцентных организмов.Фотобелок излучает свет пропорционально своему количеству, как люциферин, но его светоизлучающая реакция не требует люциферазы. Существует около двух десятков типов биолюминесцентных организмов, о которых в настоящее время доступны обширные биохимические знания, и около одной трети из них связаны с фотобелками. Большинство фотобелков содержится в морских организмах. Существуют различные типы фотопротеинов: фотопротеины кишечнополостных, гребневиков и радиолярий нуждаются в Ca 2+, чтобы вызвать их люминесценцию; фотобелки двустворчатого моллюска Pholas и чешуйчатого червя, по-видимому, вовлекают супероксидные радикалы и O2 в свои светоизлучающие реакции; фотобелок креветок эвфаузиид излучает свет только в присутствии специального флуоресцентного соединения; фотобелок многоножки Luminodesmus, единственный известный пример земного происхождения, требует, чтобы АТФ и Mg2 + испускали свет. Чувствительные к Ca2 + фотобелки кишечнополостных наиболее часто изучаются и наиболее широко используются. Поэтому они чрезвычайно популярны по сравнению с другими типами. Все кишечнополостные фотобелки, включая экуорин, галистаурин, обелин и фиалидин, имеют относительную молекулярную массу, близкую к 20000, содержат идентичные функциональные группы и излучают синий свет в водном растворе при добавлении следовых количеств Ca2 + в присутствии или отсутствии молекулярных масс. кислород. Экворин содержит оксигенированную форму целентеразина в своей функциональной группе.Когда добавляется Са2 +, экворин распадается на три части, то есть апо-экворин, целентерамид и СО2, сопровождаясь испусканием света. Апо-экворин может быть преобразован в активный эккорин, неотличимый от исходного образца, путем инкубации с избытком целентеразина в буфере, содержащем 5 мМ-ЭДТА и следы 2-меркаптоэтанола, даже при 0 ° C. фотобелки можно многократно люминесцировать и перезаряжать. Регенерация кишечнополостных фотобелков подобным образом, вероятно, происходит in vivo с использованием накопленного коэлентеразина. Фотобелки кишечнополостных и их химически модифицированные формы полезны для измерения и мониторинга ионов кальция в биологических системах, особенно в отдельных клетках.

Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Фото-лейцин и фото-метионин позволяют идентифицировать белок-белковые взаимодействия в живых клетках

Синтез и биосинтетическое включение в белки

Мы синтезировали три новые аминокислоты (рис.1a и дополнительное примечание онлайн), которые по структуре напоминают изолейцин, лейцин и метионин, но содержат фотоактивируемое диазириновое кольцо, которое дает реактивный карбен после индуцированной светом потери азота. Все три аминокислоты были синтезированы α-бромированием 16 соответствующих азикарбоновых кислот с последующим аминолизом азибромкарбоновых кислот. Хотя фото-Leu и фото-Met были получены в количествах, составляющих несколько граммов, фото-Ile было получено из того же количества исходного материала в 20 раз меньше.В случае фото-Met синтез Strecker 17 , начиная с 4,4′-азипентаналя, также давал желаемый продукт, но аналогичные попытки синтезировать фото-Leu и фото-Ile оказались безуспешными. Ферментативное разрешение энантиомеров давало чистый L-фото-Leu, L-фото-Met и D-фото-Met (рис. 1b). Мы не делали попыток разделить энантиомеры и диастереомеры фото-Иле. DL-фото-Met, меченный 14 C, был получен синтезом Штрекера с использованием [ 14 C] NaCN (фиг. 1b).

Рисунок 1: Новые фотореактивные аминокислоты включены в белки.

( a ) Структуры трех новых аминокислот, фото-Ile, фото-Leu и фото-Met (слева), показаны рядом со структурами природных аминокислот изолейцина, лейцина и метионина (справа). ( b ) Смеси DL или чистые энантиомеры (как указано) разделяли с помощью тонкослойной хроматографии на хиральной пластине. Начало и фронт растворителя находятся внизу и вверху изображения соответственно.Аминокислоты определяли окрашиванием нингидрином (дорожки 1-7) или авторадиографией (дорожка 8). ( c ) Клетки COS7 выращивали в отсутствие (дорожки 2 и 4) или в присутствии (дорожки 1 и 3) [1- 14 C] фото-Met. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE, а затем детектировали окрашиванием кумасси синим (дорожки 1 и 2) и флюорографией (дорожки 3 и 4). ( d ) Осажденные белки переваривали проназой. Добавляли избыток немеченого глутамина и фото-Met, и образцы нагревали с 7 н. HCl.Аминокислоты разделяли хроматографией на Dowex 50WX8. Фракции колонки анализировали на наличие радиоактивности, фото-Met (обнаруживаемого по поглощению при 350 нм) и аминогрупп (обнаруживаемого с помощью анализа флуоресцимина). Значения скорректированы по фону и нормализованы до наиболее интенсивного пика. Общее восстановление радиоактивности в элюате колонки составило 85%.

Чтобы продемонстрировать биосинтетическое включение фото-Met в белки, мы культивировали фибробластоподобные клетки COS7 млекопитающих в присутствии [1- 14 C] фото-Met.Чтобы уменьшить конкуренцию за активацию тРНК синтетаз, мы использовали культуральную среду, лишенную структурно родственных аминокислот лейцина и метионина (LM-2) или лишенную лейцина, метионина, изолейцина и валина (LM-4). Белки включали радиоактивную аминокислоту, так как мы смогли обнаружить радиоактивность, связанную с белками, с помощью авторадиографии после разделения с помощью SDS-PAGE (рис. 1c, дорожка 3). Чтобы доказать, что обнаруженная радиоактивность представляет собой интактный [1- 14 C] фото-Met, мы подвергли меченые белки полному гидролизу и разделению аминокислот на ионообменной колонке 18 .Из радиоактивности меченых белков 88% было интактным [1- 14 C] фото-Met (рис. 1d, фото-Met). Небольшой пик (7%) элюирования немного раньше, чем глутаминовая кислота (рис. 1d, Glu), также наблюдался, если свободный [1- 14 C] фото-Met просто нагревали в используемых условиях гидролиза (данные не показаны), и поэтому мы пришли к выводу, что он представляет собой продукт термического разложения. Радиоактивность, возникающая в результате разложения с последующей реинтеграцией, проявляется в виде аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, но этот путь не включает радиоактивность.Мы пришли к выводу, что по крайней мере 95% включенной радиоактивности представляет собой неповрежденный [1- 14 C] фото-Met. Мы получили количественные данные о частоте включения фото-Met во вновь синтезированные белки путем мечения с [1- 14 C] фото-Met и [ 3 H] фенилаланином. Сравнение количества включенных изотопов (таблица 1) показало, что частота включения [1- 14 C] фото-Met составляла 14% от частоты включения [ 3 H] Phe, что соответствует 0.7% от общего количества аминокислот.

Таблица 1 Определение частоты включения фото-Met во вновь синтезированные белки

Фото-аминокислоты функциональны и нетоксичны

Неестественные аминокислоты часто токсичны для клеток. Таким образом, мы контролировали биосинтез белка путем включения [ 3 H] Phe и определяли жизнеспособность клеток, выращенных в присутствии или в отсутствие фото-аминокислот, путем исключения трипанового синего (дополнительная таблица 1 онлайн). Из-за нехватки двух незаменимых аминокислот биосинтез белка был снижен примерно до 65% от биосинтеза в полной питательной среде.Добавление фото-Leu или фото-Ile не имело существенного эффекта, тогда как добавление фото-Met увеличивало биосинтез белка. Хотя клетки росли немного медленнее, чем в полной питательной среде, их жизнеспособность (дополнительная таблица 1) и морфология (данные не показаны) не пострадали. Кроме того, фотоактивация УФ-светом в течение 3 минут, достаточная для активации более 99% активируемых групп, не влияла на жизнеспособность клеток (дополнительная таблица 2 онлайн). Мы также проверили, являются ли белки, продуцируемые в клетках, выращенных с фото-аминокислотами, функциональными или нет.С этой целью мы трансфицировали клетки векторами, кодирующими слитые конструкции GFP из GTPase Rab5 и конститутивно активированных (GFP-Rab5QL) или доминантно-отрицательных (GFP-Rab5SN) мутантов 19 , переключили клетки на среду, содержащую фото-аминокислоты, и контролировали флуоресценцию GFP с помощью конфокальной микроскопии (дополнительный рис. 1 онлайн). GFP-Rab5 локализован в эндосомах, GFP-Rab5QL — в увеличенных эндосомах и GFP-Rab5SN — в цитозоле, все согласуется с предыдущими отчетами 19 . Ни на интенсивность флуоресценции, ни на локализацию не влияло присутствие какой-либо из фотоаминокислот.При частоте замены фото-Met на Met 35% (см. Ниже) более 80% слитых белков будут иметь фото-Met как в Rab5-, так и в GFP-части слияния, и более 99% хотя бы в одной из двух частей. Мы пришли к выводу, что фото-аминокислоты не нарушают функцию Rab5 или GFP.

Чтобы подтвердить эти результаты с помощью количественного анализа, мы измерили активность β-галактозидазы, которая была выражена в отсутствие или в присутствии фото-аминокислот в среде (дополнительная таблица 3 онлайн).Добавление любой из трех фото-аминокислот или смеси фото-Met и фото-Leu не влияло на активность фермента. Escherichia coli β-галактозидаза содержит 23 метионина, из которых в среднем 8 заменяются фото-Met; ожидается, что менее 0,01% белка не будет замещено фото-Met. Мы пришли к выводу, что фото-аминокислоты нетоксичны для культивируемых клеток млекопитающих и могут, по крайней мере частично, функционально замещать аминокислоты с разветвленной цепью и метионин.

Специфическое фото-перекрестное связывание с помощью стратегии «кормления и вспышки»

Для изучения фото-перекрестного связывания, индуцированного фото-аминокислотами, мы трансфицировали клетки COS7 плазмидой, содержащей ген, кодирующий кавеолин-1 (см. 20), кормили клетки тремя фото-аминокислотами и искали образование ковалентных димеров кавеолина-1 при УФ-облучении (рис. 2а). Контроли показали, что перекрестное сшивание не происходит в отсутствие фото-аминокислот (рис. 2а, дорожка 1), и мы не обнаружили какого-либо сшивания в необлученных образцах в присутствии фото-аминокислот (рис.2а, полосы 2–4). Иногда слабое поперечное сшивание индуцировалось облучением в отсутствие фото-аминокислот (см. Пример на фиг. 3b, дорожка 1), что согласуется с предыдущими сообщениями о прямом УФ-сшивании 21 . В образцах, облученных в присутствии фото-аминокислот (рис. 2а, дорожки 5-7), мы наблюдали, что значительные количества сшитого димера образовывались с фото-Leu и фото-Met, но не с фото-Ile.

Рисунок 2: Фото-перекрестное сшивание, индуцированное фото-аминокислотами.

( a c ) клетки COS7 ( a , b ) или клетки HeLa ( c ) выращивали в LM-4 ( a ) или LM-2 ( b , c ) в отсутствие или в присутствии L-фото-Leu (pL), L-фото-Met (pM) или DL-photo-Ile (pI) или их смесей (pLM или pLMI), а затем облучали УФ-излучением. (+) или необлученный (-). Сшитые продукты, образующиеся после УФ-облучения, были обнаружены с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием анти-кавеолина 1 ( a ) для обнаружения сверхэкспрессированного кавеолина 1, антистоматина ( b ) для обнаружения эндогенного устьица или анти-EEA1 ( c ) для обнаружения эндогенного EEA1.Сшивание с двумя различными концентрациями DSS показано для сравнения эффективности сшивания ( b , дорожки 8 и 9). Фото-сшивание эндогенного EEA1 с помощью фото-Leu и фото-Met по сравнению с химическим сшиванием с использованием DSS или параформальдегида (PFA), как указано ( c ).

Рис. 3. Специфичность включения и сшивания с помощью фото-Met и фото-Leu.

( a , b ) Клетки COS7, трансфицированные HA-меченным PGRMC1 человека, выращивали в LM-4 в отсутствие или в присутствии фото-Leu ( a ) или фото-Met ( b ) плюс указанная конкурирующая аминокислота.Поперечные сшивки, образовавшиеся после УФ-облучения, выявляли вестерн-блоттингом с использованием антител к эпитопу НА. ( c ) Клетки COS7 выращивали в присутствии [1- 14 C] фото-Met, постоянного следового количества [ 3 H] Phe и конкурирующих немеченых аминокислот, как указано. Белок осаждали, и радиоактивность связанного с белком определяли сцинтилляционным счетом. График показывает количество включенного [1- 14 C] фото-Met, нормализованное по синтезу белка, как определено по включению [ 3 H] Phe.Контрольное значение, полученное в отсутствие конкурирующей аминокислоты (Con), установлено на 100. Данные являются средними ± стандартное отклонение. трех определений.

Перекрестное сшивание с фото-аминокислотами не ограничивалось трансфецированными белками. Эндогенные белки стоматин 22 (фиг. 2b) и EEA1 (ссылка 23; фиг. 2c) также были сшиты с эффективностью, сравнимой с эффективностью, полученной с химическими сшивающими агентами дисукцинимидил-субератом (DSS) или параформальдегидом. В частности, для большого белка EEA1 сшивание фото-аминокислотами превосходит химическое сшивание, поскольку оно позволяет разрешить дискретные сшитые полосы (рис. 2c, дорожки 1-3), тогда как химическое сшивание приводило к образованию высокомолекулярных агрегатов, которые не были разделены с помощью SDS-PAGE (рис. 2c, дорожки 5,6).

Структура трех фото-аминокислот предполагает, что фото-Ile, фото-Leu и фото-Met могут заменять изолейцин, лейцин и метионин соответственно. Если это так, добавление комплементарной аминокислоты должно сильно снизить включение и ингибировать фото-перекрестное сшивание. Мы трансфицировали клетки плазмидой, кодирующей мембранный белок PGRMC1 (ref.24) и оценили, конкурируют ли метионин, валин, лейцин или изолейцин за сшивание с помощью фото-Leu и фото-Met. Мы наблюдали конкуренцию за сшивание фото-Leu (рис. 3a, дорожки 3–7) в основном с лейцином, а конкуренцию за сшивание с помощью фото-Met (рис. 3b, дорожки 3–7) в основном с метионином и в меньшей степени от лейцина. Валин и изолейцин не конкурировали с фото-Met, а скорее усиливали сшивание. Метионин и лейцин также сильно конкурировали с [1- 14 C] фото-Met за включение в белки, тогда как присутствие валина и изолейцина слегка стимулировало включение фото-аминокислоты (рис. 3в). Примечательно, что все четыре из этих аминокислот транспортируются в клетки с помощью транспортной системы L-типа 25 , которая предположительно также транспортирует три фото-аминокислоты. Сильная разница в конкуренции с метионином и лейцином по сравнению с валином и изолейцином исключает возможность конкуренции на уровне поглощения.

Сшивка с фото-аминокислотами должна быть очень специфичной из-за короткого периода полужизни карбена в активированном состоянии и отсутствия какой-либо спейсерной молекулы.Чтобы продемонстрировать эту специфичность, мы проанализировали перекрестное сшивание субъединиц 19S протеасомной регуляторной частицы, комплекса из 17 белковых субъединиц. В отличие от ядерной частицы 20S протеасомы, структурные данные с высоким разрешением для комплекса 19S недоступны. Взаимодействия отдельных субъединиц были картированы с помощью дрожжевого двугибридного анализа и нескольких других подходов in vitro , что привело к предварительной карте взаимодействий 26,27 . Мы проанализировали цитозоль фото-перекрестно-сшитых клеток HeLa с антителами к двум из субъединиц 19S, Rpt4 (S10b) и Rpt1 (S7) (рис.4). После перекрестного связывания Rpt4 был обнаружен в трех различных перекрестно-сшитых полосах с молекулярными массами 120, 140 и 145 кДа (фиг. 4, дорожка 3), что согласуется с описанными взаимодействиями с тремя другими субъединицами протеасомы 26 . Напротив, Rpt1 не был обнаружен в какой-либо заметной поперечно-сшитой полосе (фиг. 4, дорожка 4). Полоса 115 кДа, уже обнаруженная перед облучением (фиг. 4, дорожка 2), отражает перекрестную реактивность антитела. Только слабая полоса при 155 кДа появлялась при гораздо более длительном времени воздействия на блот (данные не показаны).Несмотря на высокую гомологию двух белков (44% идентичности, 62% сходства), общих партнеров по взаимодействию обнаружено не было, что свидетельствует о высокой специфичности процедуры. Ни одна из поперечно-сшитых полос, которые имели Rpt4, не содержала Rpt1, что согласуется с отсутствием взаимодействия между этими двумя субъединицами, о котором сообщалось в предыдущих исследованиях 26,27 .

Фигура 4: Фото-перекрестное связывание показывает специфические взаимодействия протеасомных субъединиц in vivo . Клетки

HeLa были выращены в LM-2 в присутствии фото-Leu и фото-Met, а затем облучены УФ (+) или не облучены (-).Цитозольные фракции подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу против hRpt1 или hRpt4. Rpt4 дает три дискретных сшитых полосы, ни одна из которых не содержит Rpt1. Очень долгая выдержка показывает, что поперечно-сшитая полоса Rpt1 мигрирует медленнее, чем три поперечно-сшитые полосы, образованные Rpt4 (данные не показаны).

PGRMC1 взаимодействует с Insig-1 и SCAP

Мы использовали новую технологию для изучения белок-белковых взаимодействий в комплексе мембранных белков, участвующих в регуляции клеточного гомеостаза липидов.По крайней мере, три мембранных белка, SCAP, Insig-1 и SREBP 28,29,30 , являются частью этой сборки, и недавние данные предполагают существование дополнительных неидентифицированных компонентов 31 . Комплекс расположен в эндоплазматическом ретикулуме, в котором он реагирует на низкий уровень холестерина. PGRMC1, прогестерон-связывающий мембранный белок эндоплазматического ретикулума 24,32 , может быть другим белком, участвующим в этом процессе. В частности, мы подозревали, что он может напрямую взаимодействовать с Insig-1.Чтобы проверить это, мы соэкспрессировали PGRMC1 (PGRMC1-HA) с меткой гемагглютинина (HA) и Insig-1 с меткой Myc (Insig-1-Myc) в клетках COS7, а затем культивировали клетки с фото-Met и фото-кроссом или без него. -связал их. Для обнаружения сшитых белков мы иммунопреципитировали экстракты, обработанные детергентом, антителом к ​​HA и проанализировали преципитаты на наличие Insig-1 с помощью вестерн-блоттинга с антителом к ​​Myc. Когда клетки выращивали в отсутствие фото-Met, было обнаружено только небольшое количество коиммунопреципитированного Insig-1, но не было сшитой полосы (рис.5а, дорожка 2). В клетках, выращенных с фото-Met, сильная полоса появлялась при ожидаемой молекулярной массе сшитого комплекса Insig-1 – PGRMC1 (рис. 5a, дорожка 1). Мы обнаружили идентичную полосу, используя обратный порядок обнаружения, то есть иммунопреципитацию анти-Myc с последующим блоттингом антителом к ​​метке НА (фиг. 5а, дорожка 3). Эти результаты демонстрируют прямое взаимодействие между двумя белками в живых клетках. Таким же способом мы обнаружили прямое взаимодействие между SCAP и PGRMC1 (рис.5b, дорожка 3), но отсутствует взаимодействие между Insig-1 и неродственным сверхэкспрессированным белком с локализацией в эндоплазматическом ретикулуме (рис. 5b, дорожки 5 и 6), что подтверждает специфичность процедуры фото-перекрестного связывания.

Фигура 5: Прямое взаимодействие in vivo между Insig-1 и PGRMC1.

( a ) клеток COS7 трансфицировали HA-меченным PGRMC1 и Myc-меченным Insig-1 и выращивали в LM-4 в присутствии или в отсутствие фото-Met. Клетки подвергали УФ-облучению или нет, как указано, лизировали и подвергали иммунопреципитации (IP) анти-HA или анти-Myc, как указано. Иммунопреципитированные белки подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу (WB) для обнаружения перекрестных связей с анти-Myc или анти-HA, как указано. Небольшая разница в кажущейся молекулярной массе поперечной сшивки обусловлена ​​разным процентным содержанием гелей, используемых для SDS-PAGE. Присутствие несшитого Insig-1 в левых полосах указывает на нековалентную коиммунопреципитацию. Сильная полоса на дорожках 3 и 4 (IgG-HC) представляет собой перекрестно реагирующую тяжелую цепь IgG. (b ) Клетки COS7 трансфицировали векторами, кодирующими меченые белки, как указано, перекрестно связывали и подвергали иммунопреципитации с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом, как указано выше.Обратите внимание, что SCAP образует высокомолекулярную перекрестную связь, вероятно, димер, и Insig-1 перекрестно связывается с PGRMC1, тогда как Insig-1 не перекрестно связывается с TRP-1-ER, который также локализован в эндоплазматическая сеть.

Первые изображения одиночных белков благодаря листу графена

Якоб Арон

Вы бы дважды подумали, прежде чем сделать селфи, если бы вспышка камеры была достаточно яркой, чтобы сжечь кожу. Биологи сталкиваются с аналогичной проблемой при изучении белков под микроскопом, поскольку современные методы визуализации могут разрушить молекулы.Теперь на помощь пришел графен — ультратонкая форма углерода — и предоставил самые первые изображения единственного белка.

Фотографирование белков позволяет нам понять их структуру и функции. Это важно для лечения заболеваний, при которых нарушаются белки, таких как болезнь Альцгеймера. Но методы визуализации, такие как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, основываются на усреднении показаний миллионов молекул, что дает нам нечеткое представление.

Усреднение необходимо, потому что освещение молекул рентгеновскими лучами или высокоэнергетическими электронами может повредить белок, а это означает, что вы не можете получить полную картину из одного изображения, а также потому, что сложно удерживать одну молекулу в одном месте достаточно долго, чтобы сфотографируй его.Теперь Жан-Николя Лоншан из Цюрихского университета, Швейцария, и его коллеги придумали способ сделать именно это.

Они начинают с распыления раствора белков на лист графена, фиксируя белки на месте. Затем они помещают это под электронный голографический микроскоп, который использует интерференционные картины между электронами для создания изображения.

Ручная горка

Этот вид приборов использует электроны с низкой энергией, которые не повреждают белок.Загвоздка в том, что они также хуже проникают в детектор микроскопа. Вот здесь и пригодится графен. «В оптической микроскопии у вас есть предметное стекло. Для нашей электронной микроскопии нам нужно было найти достаточно тонкую подложку, чтобы через нее проходили электроны », — говорит Лонгшамп.

Команда проверила свой метод на ряде белковых молекул размером всего несколько нанометров, таких как гемоглобин, обнаруженный в красных кровяных тельцах. Результаты хорошо согласуются с молекулярными моделями, полученными с помощью рентгеновской кристаллографии (см. Изображение ниже), что позволяет предположить, что изображения являются точными.

Теперь они планируют делать снимки других молекул, которые невозможно отобразить с помощью существующих технологий, и надеются в конечном итоге внести свой вклад в новые медицинские методы лечения. «Есть некоторые заболевания, которые связаны с неправильной структурой определенных белков», — говорит Лонгшамп. «В будущем мы сможем представить разницу в строении здорового человека и человека, который болеет».

Ссылка: arxiv.org/abs/1512.08958

(Изображение предоставлено: Жан-Николя Лоншан из Цюрихского университета, Швейцария)

Химия фотореактивных сшивающих агентов | Thermo Fisher Scientific

Фотоактивируемые реакционноспособные химические группы в реагентах для мечения и сшивания белков и биомолекул включают арилазиды (фенилазиды) и диазирины.В этой статье описываются химические реакции и биологические исследования применения этого класса реагентов.


Введение

Реактивные группы фотореактивного сшивающего агента

Фотоактивируемые (или фотохимические) реакции сшивания требуют энергии света для инициирования. Фотореактивные группы представляют собой химически инертные соединения, которые становятся реактивными при воздействии ультрафиолетового или видимого света. Практически все разновидности фотореактивных групп, используемых в реагентах для сшивания, требуют воздействия ультрафиолетового света (УФ-света) для молекулярной активации.На следующем изображении представлен пример типа инструмента, используемого с фотоактивируемыми сшивающими агентами и приложениями для сшивания УФ-излучением.

Типичная ультрафиолетовая лампа. Ультрафиолетовые лампы Thermo Scientific Pierce — это компактные, многофункциональные ультрафиолетовые лампы с настраиваемой длиной волны 252 нм, 302 нм и 365 нм, настраиваемые с помощью дискового переключателя, специально для использования с фотоактивируемыми сшивающими агентами и методами УФ-сшивания.


Фотохимические реактивные группы имеют определенные преимущества перед строго термохимическими реагентами для сшивки и маркировки биологических образцов и экспериментов. Что наиболее важно, они позволяют добавлять реагенты на раннем этапе эксперимента, а затем инициировать сшивание (путем воздействия УФ-света) на более позднем этапе, который согласуется с конкретным интересующим биологическим состоянием. Кроме того, многие из этих групп будут конъюгировать с любой из нескольких общих функциональных групп в белках, с которыми они сталкиваются в течение короткого времени, когда они активируются. Эта функция делает их особенно полезными для отслеживания взаимодействий белков (см. Обсуждение ниже).

Фотореактивные группы, которые были включены в сшивающее и маркирующее соединение для использования в методах биоконъюгирования, включают арилазиды, азидо-метил-кумарины, бензофеноны, антрахиноны, некоторые диазосоединения, диазирины и производные псоралена. Наиболее полезными из них для исследования биологии белков являются арилазиды и диазирины.

Избранные фотореактивные химические группы, используемые при сшивании белков. Традиционно наиболее широко использовались разновидности арилазидов (также называемые фенилазидами, два верхних ряда). Псорален (внизу справа) реагирует почти исключительно с РНК или ДНК, используется для мечения нуклеиновых кислот или для сшивки и исследования взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Диазирины (внизу слева) — это новый класс соединений, популярность и доступность которых растет для исследования белков. Волнистые связи представляют собой реагент для метки или один конец сшивающего агента, имеющего реактивную группу.


Техническое руководство по сшивающим реагентам

Это 45-страничное руководство полезно как для новичков, так и для тех, кто имеет опыт работы с сшивающими реагентами.Он начинается с основного обсуждения сшивки и используемых реагентов. Руководство также содержит обсуждение различных приложений, в которых применялось перекрестное связывание, в том числе мощную технику переноса меток для идентификации или подтверждения взаимодействий с белками. Химия сшивания рассматривается в удобном для понимания формате, предназначенном для передачи важной информации, которая вам нужна, без потери деталей. Каждый сшивающий реагент Пирса показан вместе с его структурой, молекулярной массой, длиной спейсера и химической реакционной способностью.Справочник завершается списком отличных ссылок на использование сшивающих агентов и глоссарием общих терминов сшивания.

Загрузить Техническое руководство по сшивающим реагентам


Химия реакции арилазида

Когда арилазид подвергается воздействию УФ-света (от 250 до 350 нм), он образует нитреновую группу, которая может инициировать реакции присоединения с двойными связями, вставку в сайты C – H и N – H или последующее расширение кольца для реакции с нуклеофил (например,, первичные амины). Последний путь реакции доминирует, когда в образце присутствуют первичные амины.

Тиолсодержащие восстанавливающие агенты (например, DTT или 2-меркаптоэтанол) следует избегать в растворе образца на всех этапах до и во время фотоактивации, поскольку они восстанавливают азидную функциональную группу до амина, предотвращая фотоактивацию. Реакции можно проводить в различных буферных условиях, не содержащих аминов. При работе с гетеробифункциональными фотореактивными сшивающими агентами используйте буферы, совместимые с обеими химическими реактивами.Эксперименты должны проводиться при приглушенном свете и / или с реакционными сосудами, покрытыми фольгой, до тех пор, пока не потребуется фотореакция. Обычно фотоактивация осуществляется с помощью переносной УФ-лампы, расположенной рядом с реакционным раствором и светящей прямо на него (то есть не через стекло или полипропилен) в течение нескольких минут.

Существуют три основные формы арилазидов: простые фенилазиды, гидроксифенилазиды и нитрофенилазиды. Как правило, коротковолновый УФ-свет (например, 254 нм; 265-275 нм) необходим для эффективной активации простых фенилазидов, тогда как длинный УФ-свет (например.g, 365 нм; От 300 до 460 нм) достаточно для нитрофенилазидов. Поскольку коротковолновый УФ-свет может повредить другие молекулы, нитрофенилазиды обычно предпочтительны для экспериментов по сшиванию.

Схема реакции арилазида для фотохимического конъюгирования с активацией светом. Волнистые связи представляют собой реагент для метки или один конец сшивающего агента, имеющего реактивную группу с фенилазидом; R представляет собой белок или другую молекулу, содержащую нуклеофильные или активные водородные группы.Жирные стрелки указывают на доминирующий путь. Галогенированные арилазиды реагируют напрямую (без расширения кольца) из активированного нитренового состояния.

Методы биоконъюгирования, 3-е издание

Bioconjugate Techniques, 3 rd Edition (2013) Грега Т. Хермансона является крупным обновлением книги, которая широко известна как исчерпывающее справочное руководство в области биоконъюгирования.

Bioconjugate Techniques — это полный учебник и руководство по протоколам для ученых-биологов, желающих изучить и освоить методы биомолекулярного сшивания, маркировки и иммобилизации, которые составляют основу многих лабораторных приложений. Книга также является исчерпывающим и надежным справочным пособием для исследователей, стремящихся разработать новые стратегии конъюгации для совершенно новых приложений. Он также содержит обширное введение в область биоконъюгирования, которое охватывает все основные приложения технологии, используемые в различных научных дисциплинах, а также содержит советы по созданию оптимального биоконъюгата для любых целей.

Загрузить Bioconjugate Techniques, 3 rd Edition


Применения для сшивки арилазида

Хотя гомобифункциональные арилазидные сшивающие агенты были коммерчески доступны в прошлом, они имеют ограниченную применимость по сравнению с альтернативами и больше не продаются (поисковая литература для «BASED, бис- [β- (азидосалициламидо) этил] дисульфид)»).Почти все применения арилазидных реагентов включают гетеробифункциональную химию, в которой арилазидная группа спарена напротив другого типа реакционноспособной группы, такой как амино-реактивный сложный эфир NHS. Эти соединения используются в различных стратегиях «наживка и добыча» для исследования взаимодействий белок-белок или взаимодействий белок-нуклеиновая кислота.

1. Улавливание белковых взаимодействий

Гетеробифункциональные сшивающие агенты на основе NHS-сложного эфира / арилазида используются в экспериментах для обнаружения или анализа условий, в которых происходит конкретное белковое взаимодействие.

Предположим, исследователь имеет очищенный белок (X) и желает сравнить два условия относительного содержания второго белка (Y), который, как известно исследователю, является прямым партнером по связыванию X. Во-первых, сшивающий агент вступает в реакцию изолированно ( и в приглушенном свете) с X; сшивающий агент присоединяется своим NHS-эфирным концом к поверхностным первичным аминам X, маркируя X несколькими готовыми к активации арилазидными группами. После обессоливания X для удаления непрореагировавшего сшивающего агента X добавляют к образцам Y, которые представляют различные условия обработки (например,g. , клеточные лизаты, полученные из клеток, выращенных в различных условиях). Наконец, по прошествии достаточного времени для связывания X и Y друг с другом образец облучают УФ-светом для активации арилазидного фрагмента, который затем конъюгируется с любой функциональной группой белка, с которой он находится.

Если рядом расположены аминокислоты партнера по связыванию (Y), образуются ковалентные поперечные связи между X и Y. На этом этапе результаты можно проанализировать несколькими способами. Предполагая, что у исследователя есть специфические антитела для обнаружения X, продукты можно проанализировать с помощью электрофореза и вестерн-блоттинга.Конъюгированные белки будут работать как один более крупный белок, а не как отдельные отдельные белки, и это различие может быть обнаружено и количественно определено.

В зависимости от длины спейсера и характеристик расщепляемости сшивающего агента, различные конкретные пары белковых интеракторов могут быть более или менее эффективно конъюгированы и проанализированы по-разному. Арилазидные соединения, которые являются гетеробифункциональными с амино-реактивными, сульфгидрильными и карбонильными группами, коммерчески доступны.


2. Взаимодействие с белками-метками

Перенос меток является расширением только что описанного гетеробифункционального сшивания и используется для исследования взаимодействий с белками. Помимо двух сшивающих концов, эти реагенты содержат детектируемую метку или метку (например, флуорофор или биотин) и расщепляемую спейсерную ветвь (обычно дисульфидную связь).

Sulfo-SBED, реагент переноса биотиновой метки. Характеристики этого реагента включают амино-реактивный сложный эфир сульфо-NHS ​​(внизу слева), арилазидную группу (вверху слева), биотин (справа) и расщепляемую дисульфидную связь в плече сложного эфира NHS.


После того, как пары взаимодействующих белков были сшиты (как описано выше для гипотетических белков X и Y), спейсерное плечо, соединяющее их, может быть отщеплено. Это разделяет белки, но оставляет метку (биотин в случае Sulfo-SBED) прикрепленной к Y. Таким образом, биотиновая метка эффективно переносится с белка «приманки» (X) на белок «жертвы» (Y).


Реакционная химия с диазирином

Диазирины — это новый класс фотоактивируемых химических групп, которые включаются в различные виды сшивающих и маркирующих реагентов.Фрагмент диазирина (азипентаноат) имеет лучшую фотостабильность, чем фенилазидные группы, и его легче и эффективнее активируют длинноволновым УФ-светом (от 330 до 370 нм).

Фотоактивация диазирина создает реактивные карбеновые промежуточные соединения. Такие промежуточные продукты могут образовывать ковалентные связи посредством реакций присоединения с любой боковой цепью аминокислоты или пептидным остовом на расстояниях, соответствующих длине спейсерных плеч конкретного реагента.

Схема реакции диазирина для фотохимического конъюгирования с активацией светом. R представляет собой реагент для метки или один конец сшивающего агента, имеющего реактивную с диазирином группу; (P) представляет собой белок или другую молекулу, которая содержит нуклеофильные или активные водородные группы R ‘.


Применение сшивки диазирином

Хотя арилазидные реагенты более широко цитируются в литературе, это, вероятно, изменится по мере того, как диазириновые реагенты станут более доступными и постепенно заменят арилазид в большинстве приложений.

1.Взаимодействия с захватом белков

Если доступны диазириновые эквиваленты гетеробифункциональных арилазидных реагентов, возможны все те же виды экспериментов по взаимодействию с белками. В настоящее время доступно несколько разновидностей диазириновых соединений, которые имеют на противоположном конце амино-реактивный эфир NHS.

Пример светоактивированной конъюгации с диазириновым сшивающим агентом. SDA представляет собой гетеробифункциональный сшивающий агент на основе эфира NHS и диазирина. Первичные амины одного белка можно пометить в темноте.Затем этот белок можно добавить к сложному раствору (например, клеточному лизату) и дать ему возможность связываться с его специфическими взаимодействующими элементами. Наконец, воздействие ультрафиолетового света инициирует конъюгацию с любыми ближайшими химическими группами (то есть с партнером по связыванию).


2. Метаболическое мечение и сшивание

Стабильность и очень маленький размер диазириновой группы также позволяют проводить эксперименты по сшиванию, которые включают метаболическое мечение. Например, фото-L-лейцин и фото-L-метионин являются аналогами природных аминокислот, которые содержат диазириновую группу в своих боковых цепях.Когда эти соединения добавляются в культуральную среду вместо их нативных аналогов, оборудование для синтеза белков будет использовать фотореактивные версии для создания белков. Таким образом, сами белки становятся сшивающими реагентами для стратегий сшивания in vivo.

Структуры фотореактивных аминокислот. Эти диазириновые аналоги лейцина и метионина могут быть включены с помощью механизма трансляции в белковые структуры в качестве формы метаболического мечения для анализа взаимодействия белков.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.