Основная информация, польза для здоровья, побочные эффекты, использование и другие важные сведения

Rhaponticum carthamoides (русская левзея или корень марала) — это трава, используемая в традиционной сибирской и русской медицине для улучшения физической работоспособности, особенно после болезни, а также в качестве общего улучшения физического состояния и помощи для улучшения мужской половой жизни. Это источник молекул, известных как экдистероиды, которые представляют собой гормоны, участвующие в процессе линьки и созревания у насекомых, но оказывают различное действие при попадании в организм не насекомых. Несмотря на то, что экдистероиды являются своего рода «стероидами насекомых», не было обнаружено, что они взаимодействуют с рецепторами эстрогенов или андрогенов и не влияют на уровни этих гормонов в организме.

Основное требование, связанное с Rhaponticum carthamoides , заключается в повышении физической силы и синтеза мышечного белка.Доказательства, подтверждающие эти утверждения, на данный момент ограничены данными о грызунах и в основном сосредоточены на экдистероиде, известном как 20-гидроксиэкдизон (также известный как экдистерон). Однако ограниченные данные свидетельствуют о том, что пероральные добавки могут помочь в обоих этих утверждениях.

Основным ограничением перорального приема Rhaponticum carthamoides и 20-гидроксиэкдизона является быстрый метаболизм 20-гидроксиэкдизона в сыворотке (с периодом полураспада 8 минут или меньше), что приводит к тому, что ограниченное количество молекулы достигает скелетных мышц. Этого удалось избежать в некоторых исследованиях на животных, в которых 20-гидроксиэкдизон вводили непосредственно в мышечную область с помощью инъекций, и, похоже, таким образом он вызывает зависящее от времени увеличение размера мышцы в обрабатываемой области с ограниченными периферическими действиями. (т. е. другие группы мышц могут не испытывать синтез мышечного белка, и органы не могут быть затронуты).

Исследования на людях в настоящее время не проводились, но, похоже, это растение и содержание 20-гидроксиэкдизона могут стать эргогенной помощью в ожидании будущих исследований, включая исследования по сохранению его стабильности в сыворотке (чтобы позволить большему достижению ткани-мишени).

Вы должны войти в систему, прежде чем сможете следить за этой страницей.

Теперь вы подписаны на Rhaponticum carthamoides. Вы будете уведомлены, когда будет произведено какое-либо существенное обновление.

Вы хотите отписаться от этой страницы?

Влияние 20-гидроксиэкдизона, экстрактов Leuzea carthamoides, дексаметазона и их комбинаций на активацию NF-κB в клетках HeLa | Журнал фармации и фармакологии

Аннотация

Objectives

Растительный стероид 20-гидроксиэкдистерон (20E) и 20E-содержащие экстракты из Leuzea carthamoides (Willd. ) DC продаются с заявлением об анаболическом и иммуномодулирующем воздействии. Тем не менее, их влияние на активацию ядерного фактора каппа B (NF- κ B), ключевого игрока в иммунном ответе и судьбе клеток, и их влияние на ингибирующую активность стероидных противовоспалительных препаратов NF- κ B. пока неизвестно.

Методы

Способность 20E, экстрактов левзеи и выбранных стероидных / нестероидных противовоспалительных препаратов влиять на активацию NF- κ B была исследована с использованием в качестве экспериментальной модели рака шейки матки человека HeLa-IL- 6 клеток, стабильно трансфицированных репортерным геном, связанным с IL-6.Влияние на жизнеспособность и пролиферацию клеток отслеживали (анализ МТТ). HPLC-DAD использовался для установления связи между химическими структурами экстрактов левзеи и их биоактивностью.

Основные выводы

20E ингибировал активацию NF- κ B (IC50 31,8 мкм), но был менее активен, чем другие метаболиты растений (ксантогумол 3,8 мкм, с ферином A 1,4 мкм). Экстракты левзеи с высоким содержанием 20E имели удовлетворительный активирующий эффект, но, напротив, некоторые экстракты с низким содержанием 20E значительно ингибировали активацию NF- κ B при IC50 в диапазоне от 3.От 5 до 6,2 мкг / мл. Комбинированные тесты подтвердили, что 20E не объясняет модуляцию NF- κ B, достигаемую экстрактами левзеи. Экстракты, но не сам 20E, показали значительную модуляцию ингибирующего действия дексаметазона NF- κ B.

Выводы

20E вряд ли является основным игроком в ингибирующих эффектах NF- κ B, проявляемых некоторыми экстрактами левзеи in vitro . В случае подтверждения in vivo следует проявлять осторожность в отношении продаваемых экстрактов левзеи, которые не стандартизированы или стандартизированы только для 20E, поскольку различные исходные материалы и экстракты могут даже вызывать противоположные эффекты.Что еще более важно, наши результаты указывают на потенциал взаимодействия левзеи со стероидными противовоспалительными препаратами.

Введение

Фитоэкдистероиды — это гидроксилированные стероиды растительного происхождения, многие из которых связаны с активностью гормона линьки насекомых. 20-гидроксиэкдистерон (20E, рис. 1) является основным представителем этой химической группы и широко распространен в царстве растений. Фитоэкдистероиды привлекли — с момента их открытия в 1960-х годах — большой научный интерес из-за их инсектицидной активности, экологической роли и потенциального применения в защите растений.Совсем недавно было предложено использование фитоэкдистероидов для животных и людей на основании их предполагаемого вмешательства в стероидные метаболические пути млекопитающих. ^[1] Хотя основное внимание по-прежнему уделяется эстрогенным и анаболическим эффектам, мало опубликовано об иммуномодулирующем и противовоспалительном потенциале этих соединений. ^[2–5] Кроме того, в зависимости от используемых тестовых моделей были получены противоречивые результаты. Тренин и Володин ^[6] описали 20E как модулятор лимфоцитов и нейтрофилов человека, в то время как Tanaguchi et al . ^[7] и Harmatha и др. . ^[8] не обнаружил противовоспалительного действия 20E у крыс и изолированных макрофагов мышей, соответственно.

Рисунок 1

20-гидроксиэкдизон (20E).

Рисунок 1

20-гидроксиэкдизон (20E).

20E является основным фитоэкдистероидом в Leuzea carthamoides (Willd.) DC. (син. Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin, Asteraceae ). Основываясь на традиционном использовании левзеи, научные данные собирались с начала 1960-х годов в Советском Союзе, а затем в 1980-х годах в странах Восточной Европы, прежде чем впоследствии вызвали интерес во всем мире. ^[9–11] В результате были описаны различные эффекты для L. carthamoides , включая анаболические, ^[12,13] цитотоксические, противораковые, антиметастатические, ^[14,15] тонические / адаптогенные ^[16–18] и иммуномодулирующие свойства. ^[19,20] Его лекарственные применения были заменены его использованием в качестве анаболического «функционального» корма и пищевой добавки. Продукты обычно основаны либо на сухом порошкообразном корне, либо на его гидроэтанольных экстрактах, и предлагаются через Интернет в качестве естественной альтернативы спорному использованию стероидов в животноводстве, а также для употребления в пищу людьми с анаболическими свойствами. ^[5] Многие из этих продуктов, которые, как утверждается, обладают иммуноукрепляющими свойствами вместе с анаболическим действием, не раскрывают вид, часть растения или тип используемой экстракции. Это может создавать риски, например, для пациентов, страдающих хроническими иммунными состояниями, которые могут испытывать соблазн комбинировать такие продукты с их продолжающейся терапией на основе стероидов без медицинского наблюдения. Интересно, что утверждается, что препараты цельного растения, в основном традиционный гидроэтанольный экстракт корня, а также препараты из надземных частей, предпочтительнее очищенных составов 20Е, которые также доступны. ^[21]

Ядерный фактор каппа B (NF- κ B) играет центральную роль в клеточном иммунном ответе, воспалении и судьбе клеток, а на его активацию влияют глюкокортикоиды. ^[22] Экдистероиды, такие как муристерон A, взаимодействуют с системой NF- κ B, демонстрируя эффекты, сравнимые с дексаметазоном и ретиноевой кислотой, что приводит к передаче сигналов апоптоза в клетках мышиной лимфомы WEHI-231. ^[23] экдистероиды типа эргостана из Polyporus umbellatus проявили сильную противовоспалительную активность в тесте на индуцированное ТРА воспаление на мышах. ^[24] Эти данные побудили нас изучить влияние экстрактов 20E и Leuzea на активацию in vitro NF- κ B, отдельно или в комбинации с дексаметазоном и другими известными ингибиторами NF- κ B. Насколько нам известно, это первый случай, когда влияние экстрактов 20E, а также экстрактов левзеи на активацию NF- κ B было изучено и дополнительно квалифицировано путем сравнения и комбинации с другими модуляторами NF- κ B. Для этого была выбрана хорошо зарекомендовавшая себя люминометрическая тест-система с использованием репортерного гена в стабильно трансфицированных клетках HeLa.NF- κ B регулирует экспрессию многих генов, которые играют роль в иммунитете, включая ген, кодирующий интерлейкин-6, плейотропный цитокин. Либерман и Балтимор обнаружили, что промоторная область гена интерлейкина-6 (IL-6) имеет предполагаемый сайт связывания NF- κ cB после обнаружения, что фрагмент промотора IL-6, содержащий этот сайт, специфически связывает высокоочищенный NF — Белок κ B и белок NF-cB в ядерных экстрактах клеток Jurkat, индуцированных сложным эфиром форбола. ^[25] Тот же самый форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) -индуцируемый ядерный фактор связывается с промотором IL-6 и сайтом иммуноглобулина κ B, в результате чего HeLa luc (Hela-IL-6 ) модель популярного инструмента в иммунологических исследованиях. Цитотоксичность и пролиферативные эффекты были определены с помощью анализа MTT, а методология HPLC-DAD отпечатков пальцев, которая включает определение 20E, была разработана для картирования химических структур в продуктах, полученных из левзеи, и выявления связей между составом и биоактивностью.

Материалы и методы

Стандартные вещества, растительный материал и экстракты

20-гидроксиэкдизон (20E), партенолид, дексаметазон, генистеин, ксантогумол, хлорогеновая кислота и кофейная кислота (все Sigma-Aldrich, Великобритания) служили эталонными стандартами. Витаферин A и WF-1 (5,6-эпокси-1-оксовита-2,14,24-триенолид, выделенный из Withania frutescens (L.) Pauquy) были любезно предоставлены доктором Надей Якобо (Школа фармацевтики, Лондон).

Сухие травы и корнеплоды трехлетнего растения Leuzea carthamoides , происходящего из Исследовательской станции экологического сельского хозяйства Миккели (Финляндия) и продаваемого под торговой маркой Lujza , выращивались в районе Рорбах в Верхней Австрии и были предоставлены г-на Хуберта Фолкингера (Путцляйнсдорф, Австрия). Ваучерный образец (№ 658.291) был депонирован в гербарии Biologiezentrum der Oberösterreichischen Landesmuseen (Линц, Австрия). Растения выращивали в период с 2002 по 2005 год, собирали урожай в июне 2005 года и сушили при комнатной температуре.Перед экстракцией высушенный корневой материал разрезали на кусочки длиной не более 10 мм. С надземных частей — здесь далее называемых травой — все основные стебли (диаметром> 10 мм) были удалены перед разрезанием на кусочки длиной 10 мм.

Корень и трава дважды мацерировали метанолом или 60% этанолом в течение 2 дней соответственно. Неочищенные метанольные экстракты фильтровали и упаривали в вакууме досуха ( R-Me , H-Me) . Метанольный экстракт травы фракционировали градиентным разделением жидкость / жидкость между водой и органическими растворителями в порядке гексана, дихлорметана и этилацетата в три этапа каждая.После объединения, роторного испарения и окончательной сушки в атмосфере азота до постоянного веса они дали три фракции ( H-Me-hex , H-Me-diclo , H-Me-etac ). 60% -ные экстракты этанола восстанавливали в вакууме до тех пор, пока большая часть этанола не выпарилась. К оставшемуся водному слою добавляли этилацетат. Этот процесс повторяли до тех пор, пока фракция этилацетата не оставалась прозрачной, после чего объединенные фракции сушили в вакууме ( R-Et60-etac, H-Et60-etac ).Кроме того, оставшаяся водная фракция корня ( R-Et60-wa ) была лиофилизирована и включена в исследование.

Культура клеток

Клеточная линия HeLa-IL-6 была любезно предоставлена ​​доктором М. Л. Линхардом Шмитцем, Университет Гиссена, Германия). Он содержит плазмиду, сконструированную, как описано Plaisance et al. , выше гена люциферазы, вместе с плазмидой селекции pMEP4. Эта конструкция включает белок, связывающий сигнальную последовательность рекомбинации, Jkappa, который конститутивно связан с сайтом NF-kappaB промотора интерлейкина-6 и действует как негативный регуляторный фактор. ^[26]

Клетки поддерживали в среде DMEM (Invitrogen, UK) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков (полная среда) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO. ₂ и разделялись при слиянии. Клеткам позволяли расти в среде до слияния 60–80% перед сбором для анализов МТТ и NF- κ B. Плотность клеток доводили до 7,5 × 10 ⁴ клеток / мл в среде. Используя 96 (24) луночные планшеты, 200 мкл (500 мкл) ресуспендированной клеточной суспензии на лунку инкубировали в течение 18–24 ч при 37 ° C с 5% CO ₂ , влажностью 95%.

Анализы жизнеспособности и пролиферации клеток

Для анализа МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид], впервые описанного Мосманном в 1983 г., ^[27] образца, растворенного в основном в ДМСО или метаноле, разбавляли в среды для начальной концентрации 50 мкг / мл для экстрактов и 100 мкм для отдельных соединений. После удаления старой среды в каждую тестовую лунку добавляли 100 мкл среды, содержащей максимум 0,5% растворителя, исключая колонки 2 (200 мкл среды в качестве контроля), 3 (холостой пробы, 200 мкл среды без МТТ) и 4 (200 мкл тестового раствора в качестве начальная концентрация). Затем отбирали 100 мкл из колонки 4 и проводили двойные разведения от колонки 5 к колонке 11. После инкубации в течение 6 (12, 24) часов, удаления старой среды и промывки PBS (Invitrogen, UK), 150 мкл раствора МТТ ( SIGMA, 0,5 мг / мл в PBS), и планшеты инкубировали еще 90 мин. Раствор МТТ заменяли 200 мкл смеси ДМСО (10%) / изопропанол (90%), планшеты оборачивали алюминиевой фольгой и оставляли на 10 мин перед ресуспендированием и измерением с использованием фотометрического режима люминометра Anthos Lucy 1. при 570 нм (эталонный фильтр при 620 нм, ASYS, Ойгендорф, Австрия).Все показания были скорректированы путем вычитания холостого поглощения. Скорректированные значения оптической плотности конвертировали в процентные значения роста по сравнению с необработанным контролем. Жизнеспособность менее 85% контроля была определена как токсичная, жизнеспособность более 115% — как пролиферативная. Токсические эффекты выражали двумя способами: в виде максимальной нетоксичной концентрации (MNTC = 85% от соответствующего контроля) и в виде значения IC50. Образцы тестировали в трех экземплярах.

Анализ пролиферации выполняли аналогично с увеличенным числом клеток с использованием 24-луночных планшетов вместо 96-луночных планшетов.

NF-

Hela-IL-6 выращивали до слияния в 24-луночных планшетах, среду заменяли средой, не содержащей сыворотки, и с максимальной долей растворителя 2% (0,5% в случае ДМСО) добавляли к образцам. После 40 мин инкубации добавляли стимулятор (PMA, 50 нг / мл, TNF- α 10 нг / мл), и клетки дополнительно инкубировали (37 ° C) в течение 6 или 24 часов. После лизиса с помощью 70 мл реагента для лизиса (Promega) 30 мкл из каждой лунки добавляли в двух экземплярах в белый 96-луночный планшет.Пятьдесят микролитров свежеприготовленного реагента люциферазы (Promega) добавляли автоматически с использованием системы люминометра Anthos Lucy 1. После времени реакции 10 с были записаны полученные люминометрические данные. Положительный (стимулированные только с помощью растворителя клетки) и отрицательный (клетки без стимуляции) контроли были включены в каждую чашку для расчета разницы между отрицательным контролем и образцом (или положительным контролем) в процентах от положительного контроля. Средние значения были рассчитаны из двух показаний на образец, двух образцов на планшет, трех планшетов на эксперимент и двух независимых экспериментов.В дополнение к значениям IC50 значения MNEC были рассчитаны как 85% от положительного контроля. Это облегчило сравнение диапазона активности с учетом того, что ингибирование иногда не достигало 50% от контроля или проявляло первые цитотоксические эффекты. Для сравнения образцов, которые не подавляли, но дополнительно активировали NF- κ B, по аналогии с подходом IC50 рассчитывали концентрации, которые вызывали 50% повышение активации NF- κ B по сравнению с положительным контролем (AC150).Порог MNEC был установлен на уровне 115% от положительного контроля.

Комбинированные эксперименты

Чтобы изучить возможную роль 20E в общем эффекте экстрактов левзеи, 20E объединяли с сесквитерпенлактон-партенолидом, хлорогеновой и кофейной кислотами (активация PMA). Экстракты также тестировали в комбинации с различными концентрациями 20E (активация PMA и TNF- α ).

Потенциал взаимодействия 20E исследовали путем измерения комбинированного действия 20E и стандартного глюкокортикоидного дексаметазона после активации PMA и TNF- α .Соответственно, выбранные экстракты левзеи были объединены с дексаметазоном.

Статистический анализ

При необходимости, проводились попарные сравнения конкретных видов лечения с контрольным лечением в соответствии с планом эксперимента, как указано в подписях к рисункам. Соответствующими контрольными обработками были либо контроль носителя, либо, в случае экспериментов с комбинациями, монотерапия одним из партнеров комбинации в соответствующей концентрации. P <0,05 для двух разных монотерапий.

Анализ ВЭЖХ

Используя систему HPLC Waters ™ 900, детектор Waters ™ 996 PDA и устройство автоматического пробоотборника Waters ™ 717plus, управляемое программным обеспечением EmPower ™, был применен 80-минутный градиентный метод с использованием смесей растворителей воды (TFA 0,1%), воды — смесь ацетонитрила (65:35, TFA 0,1%) и ацетонитрила с расходом 0,9 мл / мин при 25 ° C. Система была оборудована колонкой Agilent Zorbax RX-C18 (5 мкм 4.6 × 250 мм Highchrom, Великобритания) и защитную колонку Nova-Pak® C8 3,9 × 20 мм (Waters UK Elstree, UK). Образцы (начальная концентрация экстракта 10 мг / мл, стандартные эталоны 1 мг / мл) разбавляли метанолом или смесями метанол / вода, иногда используя несколько капель ДМСО для достижения полного растворения. Перед использованием все образцы фильтровали через шприцевой фильтр Acrodisc® 0,45 мм (Fisher Scientific, Лафборо, Великобритания). Каждый раствор образца вводили в трех экземплярах (30 мкл).

По отпечатку пальца были записаны все основные пики, т.е.е. те, которые представляют более 1% от общей площади пика при интегрировании при 220 или 256 нм, и были получены качественные, полуколичественные и количественные данные. Качественный профиль: пики классифицировали в соответствии с их УФ-спектрами (210–400 нм). Помимо типичных спектров производных кофейной кислоты (CAF), флавоноидов (FLA) и экдистероидов, встречающихся у левзеи, включая характерный циклогексеноновый хромофор (ECD), мы обнаружили четыре других доминирующих типа спектров, которые были классифицированы в группы от A до D.Наконец, все другие соединения со спектрами, не соответствующими ни одному из предыдущих классов, были включены в группу «Прочие» (Таблица 1).

Полуколичественный профиль: для сравнения отпечатков пальцев соотношение между площадями под кривой (AUC) регистрировали при 220 нм, чтобы оценить долю классов соединений в экстракте / фракции.

Количественное определение: 20E использовали в качестве стандарта для расчета общего содержания фитоэкдистероидов (общий ECD), хлорогеновой кислоты для расчета общего содержания производных кофейной кислоты (общий CAF), а кверцетин использовали для определения общего содержания флавоноидов ( общий FLA) (Таблица 1).

Результаты

Влияние чистого 20E на жизнеспособность клеток и активацию NF-

20E сравнивали с синтетическими стероидами дексаметазоном и мифепристоном (RU286), природными соединениями со стероидной активностью (генистеин, ксантогумол, витаферин A, WF-1), известным NF- κ B-ингибирующим сесквитерпен партенолидом, а также кофеином. и хлорогеновые кислоты. Эффект только тестируемых соединений (без стимуляции) на жизнеспособность клеток (MTT) клеток HeLa-IL-6 измеряли через 6 и 24 часа (таблица 2).20E имел значение IC50 ниже, чем у дексаметазона, но выше, чем у мифепристона. Очевидно, более цитотоксичными оказались два витаферина, партенолид и ксантогумол, в то время как генистеин и кофейная кислота не оказали большого влияния на жизнеспособность клеток. Не наблюдалось измеримого пролиферативного эффекта на клетки HeLa при обработке 20E в стандартной процедуре МТТ с использованием 96-луночных планшетов.

Влияние 20E, дексаметазона и эталонных стандартов на жизнеспособность клеток после 6 и 24 ч инкубации (анализ МТТ, диапазон тестирования 0.4–100 мкм) и на PMA-активированном NF- κ B (через 6 часов после стимуляции), определенном в клетках HeLa-IL-6

Влияние 20E, дексаметазона и эталонных стандартов на жизнеспособность клеток через 6 и 24 ч инкубации (анализ MTT, диапазон испытаний 0,4–100 мкм) и на PMA-активированный NF- κ B (6 ч после стимуляции), определенная в клетках HeLa-IL-6

Принимая во внимание результаты МТТ, 20E испытывали при пяти концентрациях (2, 5, 10, 25 и 50 мкм) на модификации PMA, вызвавшей активацию NF- κ B через 6 часов. Опять же, другие синтетические и природные стероидные соединения, а также партенолид, кофейная кислота и хлорогеновая кислота были протестированы в качестве эталонов (таблица 2). Наиболее сильное ингибирование NF- κ B проявляли партенолид, ксантогумол и витанолиды (IC50 между 1.4 и 5,2 мкм и MNEC 0,25–2,5 мкм), в то время как 20E был сопоставим с дексаметазоном и генистеином, демонстрируя умеренное, но устойчивое ингибирование со значениями IC50 между 32–43 мкм и MNEC 6,6–10,4 мкм. Он также имел аналогичные кривые «концентрация-ответ», показывающие небольшое увеличение активности NF- κ B ниже 5 мкм и явное снижение активации NF- κ B при концентрациях выше 10 мкм. Однако кривая доза-ответ обычно выходила на плато при приближении к 50% -ному ингибированию, в то время как токсические эффекты начинались примерно при 50 мкм.Поразительно, но мифепристон дал противоречивые результаты в семи независимых экспериментах, демонстрируя иногда ингибирующие, но часто активирующие эффекты. С другой стороны, кофейная и хлорогеновая кислоты лишь незначительно ингибировали NF- κ B. Стало очевидно, что для сильных ингибиторов NF- κ B интервал между эффективным ингибированием NF- κ B и токсическими эффектами был очень узким. наша клеточная модель. Все нетоксичные концентрации, вызывающие ингибирование NF- κ B через 6 часов, становились токсичными через 24 часа.

Влияние экстрактов корня левзеи и трав на жизнеспособность клеток и активацию NF-

Экстракты и фракции корня левзеи и травы были протестированы на их влияние на жизнеспособность клеток с использованием максимальных концентраций 100 мкг / мл после 24 ч инкубации в соответствии со стандартной процедурой МТТ в 96-луночных планшетах (таблица 3). Только два экстракта, H-Me-diclo и H-Et60-etac, отрицательно повлияли на жизнеспособность клеток со значениями IC50 4,2 и 16 мкг / мл соответственно.

, влияние на жизнеспособность клеток и активация NF- κ B и количественный профиль экстрактов корня (R) и травы (H) на основе ВЭЖХ / DAD Leuzea carthamoides

Выход экстракции, влияние на жизнеспособность клеток и активация NF- κ B и количественный профиль экстрактов корня (R) и травы ( H) из Leuzea carthamoides

Для проверки возможного пролиферативного эффекта анализ МТТ был повторен с увеличенным числом клеток с использованием 24-луночных планшетов (с плотностью клеток, как в NF- κ B). Через 12 и 24 часа не наблюдалось значительного увеличения жизнеспособности митохондрий, что указывает на увеличение количества клеток для любого из образцов (данные не показаны).

В соответствии с этими результатами экстракты корней и трав были затем протестированы на их способность изменять индуцированную PMA активацию NF- κ B в концентрациях, не влияющих только на жизнеспособность клеток (рис. 2). Все три экстракта корня активировали NF- κ B по сравнению с контролем (значения AC150: R-Me, 84 мкг / мл; R-Et60-etac, 5,2 мкг / мл; R-Et60-wa, 125 мкг / мл. ).

Рисунок 2

Влияние экстрактов корня левзеи и трав на индуцированное PMA ингибирование NF- κ B в клетках HeLa-IL-6 (в процентах относительно контроля носителя).Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Обозначает значимость ( P <0,05).

Рисунок 2

Влияние экстрактов корня левзеи и трав на индуцированное PMA ингибирование NF- κ B в клетках HeLa-IL-6 (в процентах относительно контроля носителя). Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Обозначает значимость ( P <0,05).

Что касается экстрактов трав, H-Me показал зависимое от концентрации ингибирование NF- κ B (IC50 15.5 мкг / мл). Две его фракции не имели эффекта (гексан, этилацетат), тогда как фракция дихлорметана имела IC50 5,9 мкг / мл с более сильным ингибированием при более высоких концентрациях, чем неочищенный экстракт, но активирующим действием при концентрациях ниже 1 мкг / мл. H-Et60-etac также ингибировался в зависимости от концентрации (IC50 12,1 мкг / мл).

Комбинированное воздействие экстрактов 20E и левзеи на активацию NF-

Для того, чтобы оценить вклад 20E, основного экдистероида левзеи, в общий эффект экстрактов левзеи, 20E в трех концентрациях (5, 10, 25 мкм) были добавлены к корню, активирующему NF- κ . экстракты и ингибирующие экстракты трав.Концентрации экстракта были близки к их IC50 (для ингибирующих экстрактов) или AC150 (для активирующих экстрактов) (рис. 3). Хотя один 20E умеренно снижал активацию NF- κ B, после стимуляции как PMA, так и TNF α не наблюдалось устойчивой значимой или дозозависимой модификации эффектов экстрактов ни для активирующих экстрактов корней, ни для ингибирующих трав. экстракты. Неожиданно, в некоторых случаях после совместной инкубации экстракта / 20E были обнаружены более высокие уровни NF- κ B, чем после инкубации только экстракта.

Рисунок 3

Влияние экстрактов левзеи отдельно и в сочетании с 20E (5, 10 и 25 мкм) на PMA- (a) и TNF α — (b), индуцированную активацию NF- κ B в HeLa-IL -6 ячеек. Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Указывает значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним экстрактом (анова с последующим тестом Бонферрони).

Рисунок 3

Влияние экстрактов левзеи отдельно и в сочетании с 20E (5, 10 и 25 мкм) на PMA- (a) и TNF α — (b) индуцированную активацию NF- κ B в HeLa- Клетки ИЛ-6.Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Указывает значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним экстрактом (анова с последующим тестом Бонферрони).

Чтобы установить комбинированные эффекты определенных классов соединений, присутствующих в экстрактах левзеи, а именно сесквитерпенелактонов и фенолкарбоновых кислот, 20E был объединен с партенолидом ингибитора NF- κ B в качестве модели сесквитерпенелактона ^[28,29] , а также с кофейной и хлорогеновой кислотой из-за характерного присутствия фенолкарбоновых кислот в наших экстрактах левзеи (рис. 4).На ингибирующие эффекты партенолида не повлияло, в то время как добавление 20E в концентрациях от 5 до 25 мкм увеличивало NF- κ B умеренно при обработке кофеиновой и хлорогеновой кислотой через 6 часов после стимуляции PMA. Никаких изменений не наблюдалось при измерении через 6 и 24 часа после стимуляции TNF α (данные не показаны).

Рисунок 4

Влияние партенолида, кофейной кислоты и хлорогеновой кислоты по отдельности и в сочетании с 20E (5, 10, 25 мкм) на PMA-индуцированную активацию NF- κ B в клетках HeLa-IL-6.указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним только 20E (ANOVA с последующим тестом Бонферрони).

Рисунок 4

Эффект одного партенолида, кофейной кислоты и хлорогеновой кислоты в сочетании с 20E (5, 10, 25 мкм) на индуцированную PMA активацию NF- κ B в клетках HeLa-IL-6. Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одними контрольными соединениями; ^ указывает на значимость ( P <0.05) комбинированного лечения по сравнению с одним только 20E (ANOVA с последующим тестом Бонферрони).

Во всех комбинированных экспериментах первые токсические эффекты наблюдались при использовании 20E в концентрациях 50 мкм. Следовательно, эти результаты не были учтены, поскольку они потенциально могут повлиять на люминометрические показания.

Комбинированное действие дексаметазона с экстрактами 20E или левзеи на NF-

Чтобы установить возможные фармакодинамические взаимодействия между 20E, экстрактами левзеи и стероидными противовоспалительными препаратами, в Национальном федеральном федеральном округе были испытаны комбинации с дексаметазоном в различных соотношениях (5: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 5). — κ B.20E в низких концентрациях (5 и 10 мкм) не оказывал значительного влияния на эффект дексаметазона после стимуляции PMA. Более высокие концентрации 20E (25 мкм) усиливали ингибирующий эффект дексаметазона после стимуляции как PMA, так и TNF α (фиг. 5).

Рисунок 5

Влияние дексаметазона (DEX 5 мкм, 10 мкм, 25 мкм) на PMA- (a) и TNF α — (b) индуцированную активацию NF- κ B в клетках HeLa-IL-6 отдельно и в сочетании с 20E (5, 10, 25 мкм).Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним дексаметазоном с использованием ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Рисунок 5

Влияние дексаметазона (DEX 5 мкм, 10 мкм, 25 мкм) на PMA- (a) и TNF α — (b) индуцированную активацию NF- κ B в HeLa-IL-6 только клетки и в сочетании с 20E (5, 10, 25 мкм). Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего.* Указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним дексаметазоном с использованием ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Дексаметазон (20 мин предварительной инкубации, 20 мкм) в комбинации с активными экстрактами левзеи был протестирован на той же клеточной модели (рис. 6). Одно противовоспалительное лекарственное средство уменьшало PMA-индуцированную активацию NF- κ B дозозависимо, и этот эффект был добавлен к эффекту ингибирующих экстрактов, в то время как эффект активирующих экстрактов казался сниженным (например,грамм. водная фракция 60% этанольного экстракта листьев). Следовательно, вызываемое дексаметазоном ингибирование NF- κ B может быть усилено некоторыми экстрактами левзеи, в то время как другие эффективно нейтрализовали этот эффект.

Рисунок 6

Влияние одного дексаметазона (DEX 20 мкм), экстрактов Leuzea отдельно и комбинаций DEX / экстракт на индуцированное PMA ингибирование NF- κ B в клетках HeLa-IL-6 (в процентах относительно контроля носителя). Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего.указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним дексаметазоном с использованием ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Рисунок 6

Влияние одного дексаметазона (DEX 20 мкм), одного экстракта левзеи и комбинаций DEX / экстракт на индуцированное PMA ингибирование NF- κ B в клетках HeLa-IL-6 (в процентах относительно контроля носителя) . Среднее трех определений в трех повторностях и стандартная ошибка среднего. * Обозначает значимость ( P <0.указывает на значимость ( P <0,05) комбинированного лечения по сравнению с одним дексаметазоном с использованием ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Отпечаток пальца ВЭЖХ и содержание 20E в экстрактах левзеи

Обнаружение характерных классов соединений, описанных для Leuzea, было достигнуто путем сравнения УФ-спектров с чистыми эталонными стандартами хлорогеновой кислоты, кофейной кислоты, 20E, кверцетина и партенолида (рис. 7). Был выбран полуколичественный метод для сравнения процентов AUC суммарных пиков из этих групп (таблица 1 и рисунок 8).Экстракты корней (R-Me, R-Et60-etac) содержали преимущественно фенолкарбоновые кислоты, за которыми следовали соединения группы D и группы ECD (с 20E в качестве основного пика при t _r 22 мин), но мало флавоноидов (рисунки 7 и 8 ). 20E в меньшей степени также был обнаружен в отпечатке R-Et60-wat. Однако во всех трех экстрактах корней 20E не был основным пиком даже при 256 нм, вблизи максимума поглощения соединения.

Рисунок 7 Профили

ВЭЖХ при 256 нм (а) эталонных стандартов и (б) экстракта из корня левзеи (R-Me) и профили ВЭЖХ при 220 нм двух экстрактов из травы левзеи: (в) H-Et60- etac и (d) H-Me-дикло.Пики, отличные от 20E, классифицируются согласно УФ-спектрам (см. Таблицу 1).

Рисунок 7

Профили ВЭЖХ при 256 нм (а) эталонных стандартов и (б) экстракта из корня левзеи (R-Me) и профили ВЭЖХ при 220 нм двух экстрактов из травы левзеи: (в) H-Et60 -etac и (d) H-Me-дикло. Пики, отличные от 20E, классифицируются согласно УФ-спектрам (см. Таблицу 1).

Рисунок 8

Полуколичественный профиль экстрактов левзеи в соответствии с основными группами, идентифицированными по УФ / видимому спектрам 200–400 нм.Процент суммарной AUC для каждой группы соединений, обнаруженной при 220 нм (см. Таблицу 1).

Рис. 8

Полуколичественный профиль экстрактов левзеи по основным группам, идентифицированным по УФ / видимым спектрам 200–400 нм. Процент суммарной AUC для каждой группы соединений, обнаруженной при 220 нм (см. Таблицу 1).

Экстракт травы H-Me и фракции H-Me-etac и H-Et60-etac были богаты флавоноидами и соединениями группы A (Рисунки 7 и 8). Две другие фракции не содержали флавоноидов, но преимущественно составляли компоненты без хромофоров (группа B) с небольшими частями ECD и группы C (H-Me-гекс) или в основном присутствовали соединения типа B и C (H-Me-дикло).

Содержание 20E, а также общее количество производных кофейной кислоты, общее количество флавоноидов и общее количество экдистероидов, рассчитанное на основе внешних стандартов (хлорогеновая кислота, кверцетин, 20E, соответственно), показано в таблице 3. Только в экстрактах корней мы смогли детектировать 20E (R-Me 21 мг / г, R-Et60-etac 29 мг / г, R-Et60-wa 12 мг / г). Однако другие соединения со спектром, подобным 20E, также были обнаружены в экстрактах трав (максимум 83 мг / г в H-Et60-etac). Нельзя исключить пониженное присутствие 20E в экстрактах H-Me, H-Me-etac и H-Et60-etac, поскольку отпечаток пальца показал другие пики (флавоноиды и A), элюирующиеся совместно с этим соединением.Производные кофейной кислоты варьировались от 66 мг / г (R-Et60-wa) до 378 мг / г (R-Et60-etac) в экстрактах корней и от 2,5 мг / г (H-Me-diclo) до 62 мг / г. (H-Et60-etac) в экстрактах трав. Более высокие количества флавоноидов были обнаружены только в экстрактах трав, особенно они преобладали во фракциях этилацетата (H-Me-etac 289 мг / г, H-Et60-etac 416 мг / г).

Взаимосвязь между классами метаболитов и активностью NF-

В совокупности профиль всех экстрактов корня, активирующих NF- κ B, показал преобладание CAF вместе с 20E и другими неидентифицированными экдистероидами.Они сопровождались основными пиками для компонентов D-типа или (водная фракция) A- и B-типов. Напротив, экстракты трав, ингибирующих NF- κ B, содержали явно меньше CAF и ECD, но преобладали другие группы, такие как B в H-Me-дикло и FLA и A в H-Me и H-Et60. -etac (рис. 7c и 7d). Общая картина взаимосвязи между соединениями классов FLA, A или B и измеренным эффектом NF- κ B не может быть установлена ​​из восьми проанализированных здесь экстрактов, поскольку NF- κ B-неактивные экстракты L-Me- В hex и L-Me-etac в равной степени преобладали компоненты B или FLA / C, соответственно.Не удалось найти простой, прямой корреляции между содержанием 20E, общим количеством экдистероидов, общим CAF или общим FLA и фармакологическими эффектами.

Обсуждение

Влияние чистого 20E на жизнеспособность клеток и активацию NF-

Экдистероиды, как сообщается, обладают низкой токсичностью, со значениями LD50 выше 10 мг / кг у мышей после перорального или внутрибрюшинного введения; фактически предполагается постоянное безвредное воздействие пищи на животных и человека. ^[5] Также результаты in vitro для 20E в четырех разных типах клеток, включая HeLa, показали низкую цитотоксичность с IC50 ≥ 50 мкг / мл. ^[30] Это согласуется с нашими результатами для клеток HeLa-IL-6, где цитотоксичность для 20E была немного выше, чем для дексаметазона.

Различные фармакологические эффекты экдистероидов и экдистероидсодержащих растений стимулировали предположения о возможном вмешательстве в стероидные метаболические пути млекопитающих. ^[1,5] Но экдистероиды, включая 20E, не должны взаимодействовать со стероидными рецепторами у млекопитающих и даже широко используются в коммерческих тестовых наборах in vitro для экспрессии индуцируемых экдистероидами трансгенов генов млекопитающих.В этих системах высококонцентрированные понастерон и муристерон А действуют как индукторы, в то время как другие экдистероиды оказались неактивными. ^[5] Иногда, однако, возникает вопрос, действительно ли экдистероиды не влияют на физиологию клеток млекопитающих. Oehme и др. . ^[31] , например, сообщил об ингибировании апоптоза, индуцированного Fas-лигандом и TNF-лигандом, муристероном А на уровне каспазы-8. В дополнение к этому противоречию следует отметить, что некоторые стероиды и нестероиды растительного происхождения, включая кукурбитацины, витанолиды, стильбеноиды или лигнаны, которые взаимодействуют со стероидными системами позвоночных, оказались лигандами эдистероидных рецепторов, т.е.е. аналоги насекомых рецепторов ядерных гормонов млекопитающих, входящие в суперсемейство регуляторов транскрипции. ^[32–34]

Наши данные, полученные в модели HeLa-IL-6, предполагают вызванное 20E ингибирование NF- κ B, сравнимое с ингибированием, индуцированным дексаметазоном или генистеином, которые, как известно, ингибируют этот ядерный фактор. in vivo и in vitro . Тем не менее, сравнение с партенолидом, витанолидами и ксантогумолом показывает, что 20E может не достичь эффективности более мощных ингибиторов NF- κ B растительного происхождения.

Признано, что аномальный домохозяйство NF- κ B в раковых клетках — один из механизмов, ответственных за предотвращение гибели клеток в токсичных условиях для нормальных клеток — дает ингибиторам NF- κ B возможность нацеливаться на раковые клетки за счет снижения повышенных исходных уровней, подавляя «нормальный» апоптотический ответ. ^[35] Наши результаты показывают определенное соответствие между мощным ингибированием NF- κ B (6 часов) и последующей гибелью клеток (24 часа) со сравнимыми значениями IC50 для всех веществ.Наряду с этим связь между ингибированием NF- κ B стероидами, включая муристерон А и понастерон, и последующей индукцией апоптоза уже поддерживалась Donjerković et al. ., ^[23] при последующем измерении жизнеспособности клеток. моменты времени в ячейках WEHI-231.

Несмотря на ингибирующее действие одного 20E в концентрациях от 7 до 50 мкм, остаются вопросы из-за отсутствия ожидаемого аддитивного или синергетического ингибирования при сочетании с партенолидом, дексаметазоном или экстрактами левзеи.Иногда для некоторых из этих комбинаций обнаруживались даже противоположные эффекты.

Противовоспалительные эффекты 20E были описаны некоторыми авторами (обзор Lafont и Dinan 2003), ^[5] , но есть также сообщения, которые не могут подтвердить такие эффекты in vivo . ^[7] Harmatha et al . ^[8] не смог обнаружить сниженную продукцию NO перитонеальными макрофагами при стимуляции ЛПС или интерфероном, даже после инкубации с 20E до 100 мкм.Наши эксперименты являются первым отчетом о 20E как модулятора активации NF- κ B и предполагают, что необходимы дальнейшие тесты in vitro и in vivo. Ингибирующий эффект наблюдался как после стимуляции PMA, так и TNF α , что может указывать на независимость от задействованного пути; либо классический канонический, либо альтернативный. ^[36]

Влияние экстрактов корня левзеи и трав на жизнеспособность клеток и активацию NF-

Традиционные препараты левзеи представляют собой гидроэтанольные экстракты корня, которые, как сообщается, содержат 0.04–0,81% от 20E. ^[11] С нашей метанольной (гидроэтанольной) мацерацией 20E был получен в концентрации 20 мг / г корня (35 мг / г корня), что находится в среднем диапазоне предыдущих отчетов. Общее содержание экдистероидов в экстрактах некоторых трав было сопоставимо с таковым в экстрактах корней, что позволяет предположить, что экстракты, обогащенные экдистероидами, также могут быть получены (зарегистрированный диапазон 20E в листьях 0,03–1,22% ^[11] ). Надземные части могут быть экономической альтернативой корням, потому что многолетние растения допускают постоянное культивирование и повторный сбор урожая. ^[30]

Протестированные экстракты и фракции демонстрируют различные химические профили и частично противоположные фармакологические эффекты. Экстракты, полученные из трав, были либо эффективными ингибиторами NF- κ B, либо вообще не влияли на активацию NF- κ B. Экстракты корней вызывали умеренное дальнейшее увеличение PMA или TNF- α , индуцированной активации NF- κ B. Этот эффект был наиболее выражен для экстракта с наибольшим содержанием 20E (29,6 мг / г; R-Et60-etac).При рассмотрении не только 20E, но и всех экдистероидоподобных соединений экстракты с самым высоким содержанием экдистероидов (83; 47; 35 мг / мл) ингибировали, активировали или не оказывали никакого эффекта.

Хотя CAF преобладает в экстрактах корней с NF- κ B сверхактивирующими эффектами, решающая роль является спорной, учитывая аналогичное общее содержание CAF в активирующем R-Et60-wa (66 мг / г) и ингибирующем H- Et60-etac (62 мг / г) экстракты. Точно так же концентрация флавоноидов, которые были более характерны для тестируемых здесь экстрактов трав, не коррелировала с влиянием на NF- κ B.Помимо необходимого различия отдельных компонентов в группах ECD, CAF и FLA, можно сделать вывод, что за измеряемую активность ответственны соединения, отличные от типичных веществ, рассматриваемых здесь для определения отпечатков пальцев. Левзея содержит интересное сочетание фармакологически активных классов, к которым можно отнести традиционно описанные и доказанные эффекты. Помимо экдистероидов 20E, макистерона C, полиподина B и аджугастерона C ^[37,38] и флавоноидов, ^[39,40] больше внимания можно уделить сесквитерпеновым лактонам, ^[28,29] тиофенам ^{полиацетиленам. [41,42]} и стильбены, ^[43] , которые известны своими цитотоксическими и противовоспалительными свойствами в различных моделях, включающих модуляцию активности NF- κ B (см. Также обзор Кокоски и Яновской ^[11] ).Также уже предлагались N-ферулоилсеротонины. ^[8] Различная активность составляющих групп в отношении отдельных физиологических мишеней может вызвать непредсказуемые экспериментальные эффекты, когда тестируются целые смеси с определенными пропорциями этих групп. С другой стороны, комбинация B-ингибирующего и активирующего принципов NF- κ у левзеи может играть роль в его иммуномодулирующем и адаптогенном применении ввиду ранее предполагаемых биполярных умеренных эффектов, ответственных за формирование клеточного ответа на ослабленная стрессовая реакция. ^[44]

Вклад 20E в действие in vitro на активацию NF-

Сомнения относительно вклада 20E в противовоспалительные эффекты экстрактов левзеи были выражены Harmata et al . (2008). ^[8] Хотя 20E сам по себе был ингибитором NF- κ B в нашей тестовой модели, аналогичные неопределенности возникают в отношении вклада 20E в ингибирование NF- κ B, вызванное экстрактами левзеи по трем причинам.Во-первых, химическая структура активирующих, ингибирующих и неактивных экстрактов: по отпечаткам пальцев наиболее сильными ингибиторами были экстракты с содержанием менее 0,5 мг 20E / г растительного материала или явно низким содержанием 20E по сравнению с другими составляющими. В экстрактах, содержащих больше активированного 20E NF- κ B, концентрация 20E в клеточной среде для диапазона активности экстрактов намного ниже, чем в тестах с одним 20E.

Вторая причина — это минимальное влияние добавления 20E к экстрактам: во время наших экспериментов с добавками мы увеличили естественное содержание 20E в тестируемых экстрактах (максимум 29 мг / г) путем добавления чистого 20E.Используя концентрации экстракта на уровне примерно IC50 (максимум 100 мг / мл), естественное содержание 20E экстракта в среде максимум 1,3 нг / мл было искусственно увеличено с 2,28 мкг / мл до 11,4 мкг / мл чистого 20E. Однако активность экстракта существенно не изменилась по сравнению с одним экстрактом.

Последней причиной является минимальное воздействие при сочетании 20E с другими ингибиторами NF- κ B: добавление 20E к партенолиду (соотношение 1: 10–2: 1), кофейной кислоте (1: 2–10: 1) и хлорогеновая кислота (1: 1–10: 1) либо не оказали существенного влияния на эффект, полученный при использовании одних только других соединений, либо даже увеличили активность NF- κ B.Также комбинации с дексаметазоном (1: 10–5: 1) не показали значительного эффекта.

Таким образом, ни 20E, ни экдистероидоподобные соединения, по-видимому, не отвечают за модулирующие эффекты экстрактов левзеи NF- κ B. Хотя экстракты левзеи могут быть наделены интересным иммуномодулирующим потенциалом, 20E не объясняет модуляцию κ B NF-. В дополнение к его сомнительному вкладу в противовоспалительное действие, пригодность 20E в качестве аналитического маркера при использовании стандартных методов HPLC-UV ограничена.Несомненно, характерный компонент, указывающий на качество, трудности в обнаружении в УФ / видимом диапазоне по сравнению с более заметными соединениями и различение структурно очень похожих экдистероидов в прошлом приводили к определенному нежеланию обнаруживать 20E стандартными методами ВЭЖХ в смесях. ^[45]

Хотя 20E не всегда можно было обнаружить с помощью нашего метода отпечатков пальцев, мы показываем, что анализ ВЭЖХ может предоставить полезную информацию о составе экстракта для качественного контроля. Это может быть далее развито для стандартного количественного определения 20E и, что еще более важно, для других составляющих групп (сесквитерпенлактон, стильбены).Примечательно, что многие продукты Leuzea, предлагаемые для продажи в Интернете, не имеют спецификации используемой части растения или типа экстракта и декларируют только содержание 20E. Доказательства связи между концентрацией 20E и фармакологическим действием препаратов левзеи в основном отсутствуют. Наши результаты подтверждают предыдущие сомнения и предполагают, что необходимы более сложные стандарты качества для экстрактов левзеи.

Влияние дексаметазона в сочетании с экстрактами 20E или левзеи на NF-