Содержание

Насоси на стройную фигуру — What is «manah-manah»? — LiveJournal

Еще один пост с бесполезными в хозяйстве вычислениями (предыдущий был про член на вес золота).
Мне в качалке было сказано, что для скорейшего достижения заданных мной параметров, мне надо несколько дней в неделю есть только белковую пищу. Которую я, надо сказать, не то чтобы не люблю — но без овощей не понимаю.
И вспомнилась мне старая идея белковой диеты — питаться исключительно мужской спермой. Ну, все равно же ценный продукт вырабатывается.
Скажем так, практически реализовать пока особого желания нет, но кто мешает сделать теоретические выкладки?

Итак, на просторах интернета я накопала следующие сведения о составе спермы человека:
Калорий в сперме 1мл 4 калории (наверное, все-таки килокалории)
Жиров в сперме 1мл 1,2 мг
Углеводов 1мл 2,2 мг
Холестирина 1мл 0,7 мг
Белков ( Протеинов ) 1 мл 30 мг

Подставив свои данные вот в этот калькулятор, я выяснила, что для меня:
Суточная норма калорий:
по среднему расходу на килограмм 1860 — 2220;
по формуле Харриса-Бенедикта 1954;
по формуле Миффлина — Сан Жеора 1895.
Ориентиры для снижения веса:
диапазон калорий 1516 — 1706;
суточная норма белка 95 — 128 грамм;
суточная норма жиров 42 — 57 грамм;
суточная норма углеводов 152 — 213 грамм.

Итак, раз велено ориентироваться на белки — считаем белки. Чтобы получить в сутки 128 граммов белка, мне понадобится 4267 миллилитра спермы (ого! Четыре литра! Я ж столько не съем!). Это 1066,75 килокалорий, так что получается некоторый недобор. Ладно, худеем.
Проверим по жирам и углеводам.
Жиров: 5120,4 мг, или чуть больше пяти граммов. Что в десять раз меньше нормы. Но, блин, у нас на то и белковая диета, чтоб жиров и углеводов было мало. Ничего, прорвемся.
Углеводов: 9387,4 мг, почти 10 граммов. Вообще несерьезно. Но, для белкового дня — как раз.

В общем, четыре литра спермы — и идеальный белково-разгрузочный день мне обеспечен. Чтоб скажут мне после него печень, почки и сердце — оставим за кадром.

Дальше, интернеты пишут, что за один раз мужчина в среднем изливает из себя 5 мг. Ну, молодец, чо. Итого, мне таких порций надо 853,4. Ну, 854 порции, с учетом усушки и утруски.

Требовать их все с одного мужа как-то негуманно. Значит, надо привлекать общественность. Тот же интернет сообщает, что в наше время самое большое количество половых актов в неделю, которое наблюдалось медицинской наукой, — это в среднем 45.
Кстати, интересная статья. Утверждалось, что тот мужик, который пошел на рекорд, при меньшем количестве не мог продуктивно работать. Интересно, в чем заключалась его работа.

Впрочем, не отвлекаемся. Требовать 45 актов в неделю мы не будем, мы ж не звери какие-нибудь. Пусть будет 10. Чтоб еще на личную жизнь оставалось что-то. Итого — требуется около 86 мужчин. То есть, чуть больше роты десантников. Что разумно: и мне диета, и военным развлечение. Кстати, с прошедшим днем ВДВ их.

Одно хреново. Раз речь идет об армии — значит, надо долго уговаривать армейских чиновников всех мастей. А мне лень. Но идея — интересная. У кого есть силы и время — можно устроить прекрасный разгрузочный день. Скажем, с понедельника по пятницу десантура трудится, в субботу вы это все потребляете, в воскресенье — все отдыхают. А в понедельник — по-новой. Рекомендую.

Источник: http://lechenie-cellulita.ru/raschet-kbzhu.html#ixzz399INiRb5

В общем, берите на заметку. А я пойду куриные грудки себе варить. С ними договариваться не надо.

Цинк со скидкой до 50%

Интерпретация результатов анализов носит информационный характер, не является диагнозом и не заменяет консультации врача. Референсные значения могут отличаться от указанных в зависимости от используемого оборудования, актуальные значения будут указаны на бланке результатов.

Единица измерения: мкмоль/л

Референсные значения:

Возраст

Цинк, мкмоль/л

до 7 лет

7,6 – 15,3

8 — 15 лет

9,8 – 16,8

женщины (> 15 лет)

10,7 – 17,5

мужчины (> 15 лет)

11,1 – 19,5

Повышение:

  • Первичная остеосаркома.
  • Ишемическая болезнь сердца.
  • Артериосклероз.
  • Отравление цинксодержащими соединениями.

Снижение:

Эндогенный дефицит цинка:

  • Врождённые пороки развития плода и новорожденных (гидроцефалия, микро- и анофтальмия, расщепление нёба, искривление позвоночника, пороки сердца и др.).
  • Наследственный энтеропатический акродерматит.

Экзогенный дефицит цинка алиментарного происхождения и при нарушениях всасывания:

  • Болезнь Прасада (тяжёлая железодефицитная анемия, карликовость, половое недоразвитие).
  • Идиопатическая гипогенвзия и дизосмия.
  • Дерматит, гипогенвзия и гипосмия при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, после гастрэктомии и др.
    , а также при алкогольном циррозе и других заболеваниях печени.
  • Замедленное заживление ран.
  • Ятрогенный дефицит цинка при парентеральном питании и длительном лечении цитостатиками, L-пеницилламином и D-гистидином.
Заболевания крови:
  • Лейкозы, лимфомы, пернициозная анемия.

anon / картинки, гифки, прикольные комиксы, интересные статьи по теме.

Так ли полезна сперма, как принято считать?

​​​В мужском эякуляте много ценных веществ. Но лучше всё же налегать на орехи и апельсины.Природа создала сперму не для того, чтобы её глотали или размазывали по коже. Однако, раз уж эякулят иногда попадает не по месту прямого назначения, имеет смысл разобраться, какие бонусы и риски для организма он несёт.Из чего состоит спермаВ результате одного мужского оргазма можно получить в среднем от 3 до 5 мл эякулята, то есть не более чайной ложки.
Лишь 1–5% этого объёма занимают мужские половые клетки, в которых заложена генетическая информация. Остальная часть приходится на семенную жидкость, в составе которой есть протеины, а также всевозможные витамины и минералы. Все они нужны для того, чтобы защищать и подкармливать сперматозоиды во время марш‑броска к яйцеклетке.  Хорошая новость в том, что сперма — это действительно кладезь питательных веществ. Но, увы, их количества недостаточно для того, чтобы принести ощутимую пользу взрослому организму, а не только кучке сперматозоидов. Для наглядности рассмотрим важнейшие ингредиенты эякулята здорового мужчины.ЦинкОдна порция спермы содержит примерно 3% от рекомендуемой суточной нормы (8–11 мг) цинка. Этот минерал поддерживает здоровье иммунной и репродуктивной систем, укрепляет волосы и омолаживает кожу, стимулируя выработку коллагена.Но чтобы получить цинк в необходимом количестве, гораздо эффективнее налегать на тыквенные семечки и орехи — особенно кедровые и кешью.Витамин CПо Интернету бродит легенда, что в сперме столько же витамина С, сколько в апельсине.
В эякуляте действительно есть аскорбиновая кислота, но её количество весьма незначительно. Так что оральный секс не заменит вам цитрусовые.ПротеиныВ сперме насчитывают около 200 различных белков. В то же время их общая концентрация в среднем составляет чуть более 5 г на 100 мл спермы. А чтобы выработать её в таком количестве, понадобится 20 семяизвержений. Но и этого будет мало, чтобы насытить организм протеинами.Минимальная суточная норма белков — 0,8 г на килограмм веса. Это значит, что женщине весом 60 кг необходимо употребить не менее 48 г протеинов в день. Чтобы получить жизненно важный минимум, понадобится выпить почти литр спермы. Либо же съесть примерно 150 г белого мяса или рыбы. Выбирайте сами.Поинтересуйтесь_От чего зависит вкус спермы и как его изменитьГормоны‑антидепрессантыИсследование начала XXI века показало: женщины, которые всегда занимаются сексом без презерватива, испытывают приступы депрессии реже, чем те, кто предохраняется. Авторы научного труда предположили, что всё дело в чудодейственных компонентах спермы, которые попадают в вагину и всасываются в кровь.
С тех пор эти выводы не раз подвергались критике. Доказано, что секс в целом снимает стресс и повышает настроение, способствуя выработке «гормонов счастья»: серотонина, дофамина и эндорфина. В то же время в самой сперме есть гормоны, которые влияют на поведение, включая тестостерон, эстроген и пролактин. Но насколько велик её вклад в борьбу с хандрой?На этот вопрос нет однозначного ответа. На результаты давнишнего эксперимента могло повлиять то, что непредохранявшиеся участницы состояли в длительных и доверительных отношениях, которые сами по себе являются мощным антидепрессантом, либо же принимали другие гормональные препараты.  СперминОдин из наиболее разрекламированных компонентов мужского эякулята — это антиоксидант спермин, который якобы способен разглаживать морщины и бороться с акне. Например, бьюти‑специалист Челси Льюис, которая работала со Стеллой Маккартни и Гвинет Пэлтроу, всерьёз рекомендует использовать маску из спермы для гладкости и сияющего вида кожи лица.В свою очередь, дерматологи предупреждают: втирать эякулят вместо ночного крема — плохая идея.
Во‑первых, сперма может вызывать аллергию, покраснения и сухость. Во‑вторых, есть вероятность заражения ИППП — то есть вместо сияющей кожи вы рискуете заработать хламидиоз или герпес глаз.Отметим, что спермин в самом деле используется в косметологии. Например, норвежская компания Skin Science создала крем на основе этого антиоксиданта — правда, синтезировав его искусственным путём.Может ли сперма навредитьДа — как разносчик половых инфекций. Кроме того, в редких случаях протеины спермы провоцируют аллергическую реакцию, которая сопровождается зудом, покраснением, набуханием слизистой, ощущением жжения. Причём неважно, куда именно попала семенная жидкость — в вагину, рот или на кожу. Эффект будет примерно одинаковым и наступит через 10–30 минут после контакта.Но если аллергии у вас нет и ваш партнёр ничем не болеет, глотать сперму совершенно безопасно. Не причинит она вреда и при попадании на кожу. Хотя и особой пользы от орального или наружного употребления эякулята нет

Еще на тему

anon(187299)

46 — норма? Считаем хромосомы: сколько человеку для счастья нужно

Прожиточный оптимум

Сначала договоримся о терминологии. Окончательно человеческие хромосомы посчитали чуть больше полувека назад — в 1956 году. С тех пор мы знаем, что в соматических, то есть не половых клетках, их обычно 46 штук — 23 пары.

Хромосомы в паре (одна получена от отца, другая — от матери) называют гомологичными. На них расположены гены, выполняющие одинаковые функции, однако нередко различающиеся по строению. Исключение составляют половые хромосомы — Х и Y, генный состав которых совпадает не полностью. Все остальные хромосомы, кроме половых, называют аутосомами

.

Количество наборов гомологичных хромосом — плоидность — в половых клетках равно одному, а в соматических, как правило, двум.

 

 

 

Интересно, что не у всех видов млекопитающих число хромосом постоянно. Например, у некоторых представителей грызунов, собак и оленей обнаружили так называемые В-хромосомы. Это небольшие дополнительные хромосомы, в которых практически нет участков, кодирующих белки, а делятся и наследуются они вместе с основным набором и, как правило, не влияют на работу организма. Полагают, что В-хромосомы — это просто удвоенные фрагменты ДНК, «паразитирующие» на основном геноме.

У человека до сих пор В-хромосомы обнаружены не были. Зато иногда в клетках возникает дополнительный набор хромосом — тогда говорят о полиплоидии, а если их число не кратно 23 — об анеуплоидии. Полиплоидия встречается у отдельных типов клеток и способствует их усиленной работе, в то время как

анеуплоидия обычно свидетельствует о нарушениях в работе клетки и нередко приводит к ее гибели.

Делиться надо честно

Чаще всего неправильное количество хромосом является следствием неудачного деления клеток. В соматических клетках после удвоения ДНК материнская хромосома и ее копия оказываются сцеплены вместе белками когезинами. Потом на их центральные части садятся белковые комплексы кинетохоры, к которым позже прикрепляются микротрубочки. При делении по микротрубочкам кинетохоры разъезжаются к разным полюсам клетки и тянут за собой хромосомы. Если сшивки между копиями хромосомы разрушатся раньше времени, то к ним могут прикрепиться микротрубочки от одного и того же полюса, и тогда одна из дочерних клеток получит лишнюю хромосому, а вторая останется обделенной.

 

Деление при образовании половых клеток (мейоз) устроено более сложно. После удвоения ДНК каждая хромосома и ее копия, как обычно, сшиты когезинами. Затем гомологичные хромосомы (полученные от отца и матери), а точнее их пары, тоже сцепляются друг с другом, и получается так называемая тетрада, или четверка. А дальше клетке предстоит поделиться два раза. В ходе первого деления расходятся гомологичные хромосомы, то есть дочерние клетки содержат пары одинаковых хромосом. А во втором делении эти пары расходятся, и в результате половые клетки несут одинарный набор хромосом.

Мейоз тоже нередко проходит с ошибками. Проблема в том, что конструкция из сцепленных двух пар гомологичных хромосом может перекручиваться в пространстве или разделяться в неположенных местах. Результатом снова будет неравномерное распределение хромосом. Иногда половой клетке удается это отследить, чтобы не передавать дефект по наследству. Лишние хромосомы часто неправильно уложены или разорваны, что запускает программу гибели. Например, среди сперматозоидов действует такой отбор по качеству. А вот яйцеклеткам повезло меньше. Все они у человека образуются еще до рождения, готовятся к делению, а потом замирают. Хромосомы уже удвоены, тетрады образованы, а деление отложено. В таком виде они живут до репродуктивного периода. Дальше яйцеклетки по очереди созревают, делятся первый раз и снова замирают. Второе деление происходит уже сразу после оплодотворения. И на этом этапе проконтролировать качество деления уже сложно. А риски больше, ведь четыре хромосомы в яйцеклетке остаются сшитыми в течение десятков лет. За это время в когезинах накапливаются поломки, и хромосомы могут спонтанно разделяться. Поэтому чем старше женщина, тем больше вероятность неправильного расхождения хромосом в яйцеклетке.

 

Анеуплоидия в половых клетках неизбежно ведет к анеуплоидии зародыша. При оплодотворении здоровой яйцеклетки с 23 хромосомами сперматозоидом с лишней или недостающей хромосомами (или наоборот) число хромосом у зиготы, очевидно, будет отлично от 46. Но даже если половые клетки здоровы, это не дает гарантий здорового развития. В первые дни после оплодотворения клетки зародыша активно делятся, чтобы быстро набрать клеточную массу. Судя по всему, в ходе быстрых делений нет времени проверять корректность расхождения хромосом, поэтому могут возникнуть анеуплоидные клетки. И если произойдет ошибка, то дальнейшая судьба зародыша зависит от того, в каком делении это случилось. Если равновесие нарушено уже в первом делении зиготы, то весь организм вырастет анеуплоидным. Если же проблема возникла позже, то исход определяется соотношением здоровых и аномальных клеток.

Часть последних может дальше погибнуть, и мы никогда не узнаем об их существовании. А может принять участие в развитии организма, и тогда он получится мозаичным — разные клетки будут нести разный генетический материал. Мозаицизм доставляет немало хлопот пренатальным диагностам. Например, при риске рождения ребенка с синдромом Дауна иногда извлекают одну или несколько клеток зародыша (на той стадии, когда это не должно представлять опасности) и считают в них хромосомы. Но если зародыш мозаичен, то такой метод становится не особенно эффективным.

Третий лишний

Все случаи анеуплоидии логично делятся на две группы: недостаток и избыток хромосом. Проблемы, возникающие при недостатке, вполне ожидаемы: минус одна хромосома означает минус сотни генов.

 

Расположение хромосом в ядре клетки человека (хромосомные территории). Изображение: Bolzer et al., 2005 / Wikimedia Commons / CC BY 2.5

Если гомологичная хромосома работает нормально, то клетка может отделаться только недостаточным количеством закодированных там белков. Но если среди оставшихся на гомологичной хромосоме генов какие-то не работают, то соответствующих белков в клетке не появится совсем.

В случае избытка хромосом все не так очевидно. Генов становится больше, но здесь — увы — больше не значит лучше.

Во-первых, лишний генетический материал увеличивает нагрузку на ядро: дополнительную нить ДНК нужно разместить в ядре и обслужить системами считывания информации.

Ученые обнаружили, что у людей с синдромом Дауна, чьи клетки несут дополнительную 21-ю хромосому, в основном нарушается работа генов, находящихся на других хромосомах. Видимо, избыток ДНК в ядре приводит к тому, что белков, поддерживающих работу хромосом, не хватает на всех.

Во-вторых, нарушается баланс в количестве клеточных белков. Например, если за какой-то процесс в клетке отвечают белки-активаторы и белки-ингибиторы и их соотношение обычно зависит от внешних сигналов, то дополнительная доза одних или других приведет к тому, что клетка перестанет адекватно реагировать на внешний сигнал. И наконец, у анеуплоидной клетки растут шансы погибнуть. При удвоении ДНК перед делением неизбежно возникают ошибки, и клеточные белки системы репарации их распознают, чинят и запускают удвоение снова. Если хромосом слишком много, то белков не хватает, ошибки накапливаются и запускается апоптоз — программируемая гибель клетки. Но даже если клетка не погибает и делится, то результатом такого деления тоже, скорее всего, станут анеуплоиды.

Жить будете

Если даже в пределах одной клетки анеуплоидия чревата нарушениями работы и гибелью, то неудивительно, что целому анеуплоидному организму выжить непросто. На данный момент известно только три аутосомы — 13, 18 и 21-я, трисомия по которым (то есть лишняя, третья хромосома в клетках) как-то совместима с жизнью. Вероятно, это связано с тем, что они самые маленькие и несут меньше всего генов. При этом дети с трисомией по 13-й (синдром Патау) и 18-й (синдром Эдвардса) хромосомам доживают в лучшем случае до 10 лет, а чаще живут меньше года. И только трисомия по самой маленькой в геноме, 21-й хромосоме, известная как синдром Дауна, позволяет жить до 60 лет.

Совсем редко встречаются люди с общей полиплоидией. В норме полиплоидные клетки (несущие не две, а от четырех до 128 наборов хромосом) можно обнаружить в организме человека, например в печени или красном костном мозге. Это, как правило, большие клетки с усиленным синтезом белка, которым не требуется активное деление.

Дополнительный набор хромосом усложняет задачу их распределения по дочерним клеткам, поэтому полиплоидные зародыши, как правило, не выживают. Тем не менее описано около 10 случаев, когда дети с 92 хромосомами (тетраплоиды) появлялись на свет и жили от нескольких часов до нескольких лет. Впрочем, как и в случае других хромосомных аномалий, они отставали в развитии, в том числе и умственном. Однако многим людям с генетическими аномалиями приходит на помощь мозаицизм. Если аномалия развилась уже в ходе дробления зародыша, то некоторое количество клеток могут остаться здоровыми. В таких случаях тяжесть симптомов снижается, а продолжительность жизни растет.

Гендерные несправедливости

Однако есть и такие хромосомы, увеличение числа которых совместимо с жизнью человека или даже проходит незаметно. И это, как ни удивительно, половые хромосомы. Причиной тому — гендерная несправедливость: примерно у половины людей в нашей популяции (девочек) Х-хромосом в два раза больше, чем у других (мальчиков). При этом Х-хромосомы служат не только для определения пола, но и несут более 800 генов (то есть в два раза больше, чем лишняя 21-я хромосома, доставляющая немало хлопот организму). Но девочкам приходит на помощь естественный механизм устранения неравенства: одна из Х-хромосом инактивируется, скручивается и превращается в тельце Барра. В большинстве случаев выбор происходит случайно, и в ряде клеток в результате активна материнская Х-хромосома, а в других — отцовская. Таким образом, все девочки оказываются мозаичными, потому что в разных клетках работают разные копии генов. Классическим примером такой мозаичности являются черепаховые кошки: на их Х-хромосоме находится ген, отвечающий за меланин (пигмент, определяющий, среди прочего, цвет шерсти). В разных клетках работают разные копии, поэтому окраска получается пятнистой и не передается по наследству, так как инактивация происходит случайным образом.

 

Кошка черепахового окраса. Фото: Lisa Ann Yount / Flickr / Public domain

В результате инактивации в клетках человека всегда работает только одна Х-хромосома. Этот механизм позволяет избежать серьезных неприятностей при Х-трисомии (девочки ХХХ) и синдромах Шерешевского — Тернера (девочки ХО) или Клайнфельтера (мальчики ХХY). Таким рождается примерно один из 400 детей, но жизненные функции в этих случаях обычно не нарушены существенно, и даже бесплодие возникает не всегда. Сложнее бывает тем, у кого хромосом больше трех. Обычно это значит, что хромосомы не разошлись дважды при образовании половых клеток. Случаи тетрасомии (ХХХХ, ХХYY, ХХХY, XYYY) и пентасомии (XXXXX, XXXXY, XXXYY, XXYYY, XYYYY) встречаются редко, некоторые из них описаны всего несколько раз за всю историю медицины. Все эти варианты совместимы с жизнью, и люди часто доживают до преклонных лет, при этом отклонения проявляются в аномальном развитии скелета, дефектах половых органов и снижении умственных способностей. Что характерно, дополнительная Y-хромосома сама по себе влияет на работу организма несильно. Многие мужчины c генотипом XYY даже не узнают о своей особенности. Это связано с тем, что Y-хромосома сильно меньше Х и почти не несет генов, влияющих на жизнеспособность.

У половых хромосом есть и еще одна интересная особенность. Многие мутации генов, расположенных на аутосомах, приводят к отклонениям в работе многих тканей и органов. В то же время большинство мутаций генов на половых хромосомах проявляется только в нарушении умственной деятельности. Получается, что в существенной степени половые хромосомы контролируют развитие мозга. На основании этого некоторые ученые высказывают гипотезу, что именно на них лежит ответственность за различия (впрочем, не до конца подтвержденные) между умственными способностями мужчин и женщин.

Кому выгодно быть неправильным

Несмотря на то что медицина знакома с хромосомными аномалиями давно, в последнее время анеуплоидия продолжает привлекать внимание ученых. Оказалось, что более 80% клеток опухолей содержат необычное количество хромосом. С одной стороны, причиной этому может служить тот факт, что белки, контролирующие качество деления, способны его затормозить. В опухолевых клетках часто мутируют эти самые белки-контролеры, поэтому снимаются ограничения на деление и не работает проверка хромосом. С другой стороны, ученые полагают, что это может служить фактором отбора опухолей на выживаемость. Согласно такой модели, клетки опухоли сначала становятся полиплоидными, а дальше в результате ошибок деления теряют разные хромосомы или их части. Получается целая популяция клеток с большим разнообразием хромосомных аномалий. Большинство из них нежизнеспособны, но некоторые могут случайно оказаться успешными, например если случайно получат дополнительные копии генов, запускающих деление, или потеряют гены, его подавляющие. Однако если дополнительно стимулировать накопление ошибок при делении, то клетки выживать не будут. На этом принципе основано действие таксола — распространенного лекарства от рака: он вызывает системное нерасхождение хромосом в клетках опухоли, которое должно запускать их программируемую гибель.

Получается, что каждый из нас может оказаться носителем лишних хромосом, по крайней мере в отдельных клетках. Однако современная наука продолжает разрабатывать стратегии борьбы с этими нежеланными пассажирами. Одна из них предлагает использовать белки, отвечающие за Х-хромосому, и натравить, например, на лишнюю 21-ю хромосому людей с синдромом Дауна. Сообщается, что на клеточных культурах этот механизм удалось привести в действие. Так что, возможно, в обозримом будущем опасные лишние хромосомы окажутся укрощены и обезврежены.

Часто задаваемые вопросы о ВИЧ и СПИДе

Общие сведения

1) Что такое ВИЧ?

ВИЧ — это вирус иммунодефицита человека. ВИЧ представляет собой ретровирус, который заражает клетки иммунной системы человека (главным образом CD4-положительные T-клетки и макрофаги — важнейшие клеточные компоненты иммунной системы), разрушая их или нарушая их работу. Заражение данным вирусом приводит к прогрессирующему истощению иммунной системы, результатом которого становится иммунодефицит.

Иммунодефицит — это состояние иммунной системы, при котором она больше не может выполнять свою роль при борьбе с инфекциями и заболеваниями. Люди с иммунодефицитом значительно более уязвимы для множества инфекций и различных видов рака, большинство из которых редко встречаются у людей, не имеющих иммунодефицита. Заболевания, связанные с тяжелым иммунодефицитом, называют оппортунистическими инфекциями, потому что они получают возможность развиваться благодаря ослаблению иммунной системы.

 

2) Что такое СПИД?

СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита — это комплекс симптомов и инфекций, связанных с приобретенным дефицитом иммунной системы. Установлено, что причиной СПИДа является заражение ВИЧ. Переход от заражения ВИЧ к СПИДу определяется степенью иммунодефицита или появлением определенных инфекционных заболеваний-индикаторов (см. вопрос 4).

 

3) Каковы симптомы заражения ВИЧ?

Большинство людей, зараженных ВИЧ, не знают об этом. У некоторых людей непосредственно после заражения может возникать болезненное состояние, напоминающее железистую лихорадку (с подъемом температуры, сыпью, болями в суставах и увеличением лимфатических узлов), совпадающее с периодом сероконверсии. Сероконверсия — это появление антител к ВИЧ, которое происходит, как правило, в течение второго месяца после заражения (см. вопрос 32).

Несмотря на то, что при заражении ВИЧ часто не наблюдается никаких симптомов, инфицированный человек сам становится заразным и может передавать вирус другим людям (см. вопрос 7). Определить наличие ВИЧ-инфекции можно при помощи теста на ВИЧ (см. вопрос 31).

ВИЧ-инфекция приводит к постепенному истощению и ослаблению иммунной системы. При этом человек становится более уязвимым для инфекционных заболеваний и некоторых видов рака, и у него может развиться СПИД (см. вопросы 2 и 4).

 

4) Когда считается, что у человека СПИД?

Термин «СПИД» применяется к последним стадиям развития ВИЧ-инфекции.

Без лечения у большинства людей, зараженных ВИЧ, симптомы СПИДа появляются через 8–10 лет.

На наличие СПИДа указывает развитие определенных инфекций. Первая стадия заболевания ВИЧ — бессимптомная и не считается СПИДом. Вторая (сопровождающаяся незначительными кожно-слизистыми проявлениями и рецидивирующими инфекциями дыхательных путей), третья (хроническая диарея неустановленной этиологии, продолжающаяся более месяца, тяжелые бактериальные инфекции и туберкулез легких) и четвертая (токсоплазмоз мозга, кандидоз пищевода, трахеи, бронхов или легких и саркома Капоши) стадии заболевания ВИЧ являются СПИДом и определяются по наличию соответствующих заболеваний. Бóльшая часть этих заболеваний — оппортунистические инфекции, которые легко поддаются лечению у здоровых людей.

В дополнение к этой классификации Центры по контролю и профилактике заболеваний США диагностируют СПИД, если количество CD4-положительных T-клеток в 1 мм3 крови оказывается менее 200 (см.: http://www.cdc.gov/epo/dphsi/print/aids1993.htm). CD4-положительные T-клетки жизненно важны для эффективного иммунного ответа организма на инфекции.

 

5) Как быстро у людей, зараженных ВИЧ, развивается СПИД?

Этот период может быть разным у разных людей. От заражения ВИЧ до заболевания СПИДом может пройти 10–15 лет, иногда еще больше, иногда — меньше. Антиретровирусная терапия позволяет предотвратить переход в стадию СПИДа, снижая вирусную нагрузку на инфицированный организм (см. вопрос 26).

 


 

Передача

 

6) Где обнаруживается ВИЧ?

ВИЧ присутствует в биологических жидкостях организма, таких как кровь, сперма, влагалищное отделяемое и грудное молоко.

 

7) Как может передаваться ВИЧ?

ВИЧ передается при проникающем (анальном или вагинальном) сексе, переливании крови, пользовании одним зараженным шприцем в медицинских учреждениях и при потреблении инъекционных наркотиков, а также от матери к ребенку при беременности, родах и грудном вскармливании.

Передача вируса половым путем

ВИЧ способен передаваться при проникающем сексе. Такой способ передачи ВИЧ не очень эффективен, поэтому при однократном вагинальном половом акте риск заражения низок. По статистике заражение в 10 раз чаще происходит при анальном сексе, чем при вагинальном. Для нелеченного больного с ИППП, особенно при наличии изъязвлений или выделений, риск передачи или заражения ВИЧ во время секса в среднем в 6–10 раз выше. 

Оральный секс считается малорискованным видом сексуальной активности с точки зрения передачи ВИЧ.

Передача вируса при совместном пользовании иглами и шприцами

Повторное или совместное использование игл или шприцев — высокоэффективный способ передачи ВИЧ. Риск передачи среди людей, потребляющих инъекционные наркотики, можно значительно снизить, если всегда использовать новые одноразовые иглы и шприцы или надлежащим образом стерилизовать многоразовые иглы/шприцы перед применением (см. вопрос 19). Для снижения частоты передачи в медицинских учреждениях работники здравоохранения должны соблюдать универсальные меры предосторожности (см. вопрос 20).

Передача вируса от матери ребенку

Ребенок может получить ВИЧ от матери во время беременности, родов и грудного вскармливания. В общем случае риск передачи ВИЧ от матери к ребенку до и во время родов составляет от 15 до 30 %. Некоторые факторы могут повышать вероятность заражения, в частности — вирусная нагрузка на мать в момент рождения (чем выше нагрузка — тем выше риск). После рождения мать может передать вирус ребенку также при грудном вскармливании (см. вопрос 21). Если во время беременности и грудного вскармливания мать получает антиретровирусную терапию, риск передачи ВИЧ ребенку очень низок.

Передача вируса при переливании крови

При переливании зараженной крови и препаратов крови риск заражения ВИЧ очень высок (более 90 %). Однако внедрение стандартов безопасности крови гарантирует, что все пациенты, которым требуется переливание, будут получать только безопасную, качественную и соответствующую требованиям кровь и препараты крови. Обеспечение безопасности крови включает проверку всей донорской крови на ВИЧ и другие передающиеся через кровь патогены, а также надлежащий отбор доноров.

 

8) Каков риск передачи ВИЧ при поцелуях, в том числе глубоких?

При поцелуях в губы риск передачи отсутствует. Возможность распространения вируса через слюну при поцелуях не была подтверждена.

 

9) Каков риск передачи ВИЧ при пирсинге или татуировке?

Риск передачи ВИЧ существует, если зараженные инструменты не стерилизуются или используются повторно. Инструменты, нарушающие целостность кожи, надлежит использовать однократно, а затем утилизировать или подвергать тщательной очистке и стерилизации.

 

10) Каков риск передачи ВИЧ, если воспользоваться бритвой зараженного человека?

При любом порезе нестерилизованным предметом, например лезвием бритвы, возможна передача ВИЧ. Совместное использование бритв не рекомендуется, если они не подвергаются стерилизации после каждого применения.

 

11) Безопасно ли заниматься сексом с человеком, живущим с ВИЧ?

Секс с человеком, живущим с ВИЧ, безопасен, если вирус у такого лица полностью подавлен посредством лечения. Также секс безопасен при правильном использовании презерватива или применении доконтактной профилактики, как рекомендовано лицом, оказывающим медицинскую помощь.

 

12) Безопасно ли, если два человека, живущих с ВИЧ, занимаются незащищенным сексом исключительно друг с другом?

Нежелательно, чтобы люди, живущие с ВИЧ, заражались другим штаммом вируса. Поэтому надлежит следовать рекомендациям, приведенным в ответе на вопрос 11, — кроме совета о доконтактной профилактике, так как она не предназначена для людей, живущих с ВИЧ.

 


 

Профилактика

 

13) Как можно предотвратить заражение ВИЧ?

Передачу ВИЧ половым путем можно предотвратить следующими способами:

  • Моногамные отношения между неинфицированными партнерами.
  • Непроникающий секс.
  • Последовательное и правильное применение мужских или женских презервативов.
  • Секс в паре, в которой один партнеров живет с ВИЧ, но проходит антиретровирусную терапию и имеет необнаруживаемый уровень вирусной нагрузки
  • Доконтактная профилактика для людей, не зараженных ВИЧ.
  • Добровольное медицинское мужское обрезание снижает для мужчины риск заражения ВИЧ от женщин.

Дополнительные способы предотвратить заражение:

  • Если вы потребляете инъекционные наркотики, всегда используйте новые одноразовые иглы и шприцы или надлежащим образом стерилизованные перед применением иглы и шприцы многоразового использования (см. вопрос 20), либо выберите другие меры профилактики, например опиоидную заместительную терапию.
  • Удостоверяйтесь в соблюдении стандартов безопасности крови и в том, что кровь и препараты крови прошли тестирование на ВИЧ.
  • См. вопросы 19–22.

 

14) Что такое «менее опасное сексуальное поведение»?

Менее опасное сексуальное поведение — это применение мер предосторожности, снижающих риск передачи или получения при сексе инфекций, передающихся половым путем, включая ВИЧ. К таким практикам относят правильное и последовательное использование презервативов при сексе, оральный и непроникающий секс, а также применение доконтактной профилактики, если вы подвергаетесь риску заражения ВИЧ или имеете необнаруживаемый уровень вирусной нагрузки, живя с ВИЧ.

 

15) Насколько эффективно презервативы защищают от ВИЧ?

Презервативы с гарантией качества — единственный доступный на сегодня продукт, защищающий от заражения ВИЧ и другими ИППП при сексе. При правильном использовании презервативы являются проверенным и эффективным средством профилактики заражения ВИЧ как для женщин, так и для мужчин.

Чтобы презервативы обеспечивали свой защитный эффект, их необходимо использовать правильно и последовательно. При неправильном использовании презерватив может соскользнуть или порваться, и защитный эффект будет снижен.

 

16) Как использовать мужской презерватив?
  • Презервативы со смазкой реже рвутся при манипуляциях и использовании. Не следует использовать лубриканты на масляной основе, например вазелин, так как они могут повредить презерватив.
  • Упаковку с презервативом следует открывать непосредственно перед использованием. Иначе на нем высохнет смазка. Открывая упаковку, следите за тем, чтобы не порвать и не повредить презерватив. Если презерватив все же порвется, выбросите его и откройте новую упаковку.
  • Презерватив в упаковке скатан в плоский кружок. Наложите скатанный презерватив на головку полового члена правильной стороной наружу. Большим и указательным пальцами сожмите кончик презерватива, чтобы выдавить из него воздух. Так в нем останется место для приема спермы после эякуляции. Удерживая кончик презерватива одной рукой, второй раскатайте на всю длину эрегированного полового члена до лобковых волос.
  • Если на презервативе недостаточно лубриканта, можно дополнительно нанести смазку на водной основе (например, силикон, глицерин или гель K-Y). Никогда не используйте смазывающие вещества на масляной основе (растительное масло или кулинарный жир, минеральное масло, детское масло, вазелин и большинство косметических кремов), так как они могут повредить презерватив.

После полового акта презерватив необходимо правильно снять.

  • Сразу после эякуляции мужчина должен придерживать презерватив за основание, чтобы он не соскользнул.
  • Затем следует извлечь половой член, пока он еще эрегирован.
  • Полностью вытащив член, снимите с него презерватив и выбросите. Не смывайте презерватив в унитаз.

При повторном половом акте возьмите новый презерватив и действуйте таким же образом.

 

17) Что такое женский презерватив?

Женский презерватив — это барьерное противозачаточное средство, применение которого контролирует женщина. Женский презерватив — это прочная, мягкая прозрачная полиуретановая оболочка, которая вводится во влагалище перед половым актом. Она полностью закрывает поверхность влагалища, и при правильном и последовательном использовании обеспечивает защиту как от беременности, так и от многих инфекций, передающихся половым путем, включая ВИЧ. Женский презерватив не имеет известных побочных эффектов или рисков, для его использования не требуется назначение или вмешательство лица, оказывающего медицинскую помощь.

 

18) Как использовать женский презерватив?
  • Аккуратно извлеките презерватив из защитной упаковки. При желании нанесите дополнительный лубрикант на внутреннее и внешнее кольца презерватива.
  • Чтобы ввести презерватив, присядьте и разведите колени либо поставьте одну ногу на табуретку или стул. Возьмите презерватив так, чтобы открытый конец свисал вниз. Удерживая верхнее кольцо (закрытый конец презерватива), сожмите его между большим и средним пальцами.
  • Указательный палец поместите между большим и средним. Сохраняя такое положение пальцев, сожмите верхнюю часть презерватива в плоский овал. Второй рукой разведите половые губы и введите закрытый конец презерватива во влагалище.
  • Когда закрытый конец презерватива окажется внутри, указательным пальцем продвиньте его вглубь. Удостоверьтесь, что верхний конец презерватива зашел за лобковую кость — вы нащупаете ее, если согнете указательный палец, введенный во влагалище на несколько сантиметров. Презерватив можно вводить заранее, максимум за восемь часов до полового акта.
  • Следите за тем, чтобы он не перекрутился внутри влагалища. Если это произойдет, извлеките презерватив, добавьте немного лубриканта и вставьте снова. Обратите внимание: около двух сантиметров с открытого конца презерватива должно оставаться снаружи вашего тела. Если партнер введет половой член под презерватив или сбоку от него, попросите его немедленно остановиться. Извлеките презерватив, выбросите его и введите новый. Пока вы с партнером не привыкнете к женскому презервативу, лучше, если вы будете направлять его половой член во влагалище рукой.
  • После эякуляции партнера, когда он извлечет свой половой член, сожмите и перекрутите открытый конец презерватива, чтобы не дать вытечь сперме. Аккуратно извлеките презерватив. Выбросите использованный презерватив (но не смывайте его в унитаз).
  • Использовать женские презервативы повторно не рекомендуется (см. http://www.who.int/reproductive-health/rtis/reuse.en.html).

См. также: http://www.who.int/reproductive-health/publications/RHR_00_8/RHR_00_8_chapter5.en.html.

 

19) Что такое постконтактная профилактика?

Постконтактная профилактика (ПКП) включает в себя лекарственное лечение, лабораторные анализы и консультирование. ПКП начинают в течение нескольких часов после вероятного контакта с ВИЧ и проводят в течение приблизительно четырех недель. Согласно исследованиям, если лекарственное лечение начать в ближайшее время после вероятного контакта с ВИЧ (не позднее 72 часов, в идеале — в течение первых двух часов), это помогает предотвратить заражение ВИЧ.

Подробные сведения см. по ссылке http://www.who.int/hiv/topics/prophylaxis/en/.

 

20) Как потребители инъекционных наркотиков могут снизить риск заражения ВИЧ?

Люди, потребляющие инъекционные наркотики, могут принять ряд мер, чтобы снизить риски для собственного и общественного здоровья:

  • Принимать наркотики перорально (перейти с инъекционного на неинъекционное употребление).
  • Никогда не использовать шприцы, воду или оборудование для приготовления наркотиков повторно или совместно.
  • Каждый раз использовать для приготовления и введения наркотиков новый шприц (полученный из надежного источника, например через программу распространения шприцев с иглами, или приобретенный в аптеке).
  • Использовать для приготовления наркотиков стерильную воду или чистую воду из надежного источника.
  • Перед введением очищать место инъекции при помощи свежего спиртового тампона.

 

21) Как можно предотвратить передачу ВИЧ от матери ребенку?

Передача вируса ребенку от матери, живущей с ВИЧ, может произойти во время беременности и родов, а также после родов при грудном вскармливании. При отсутствии вмешательств риск передачи инфекции матерями, живущими с ВИЧ, во время беременности и родов, оценивается в 15–30 %. Грудное вскармливание повышает риск передачи ВИЧ на 10–15 %. Этот риск зависит от клинических факторов, а также от режима и продолжительности грудного вскармливания.

Достигнут огромный прогресс в работе по сокращению числа детей, рожденных с ВИЧ. Эффективная антиреторовирусная терапия во время беременности, родов и грудного вскармливания позволяет снизить риск передачи ВИЧ от матери ребенку до 5 % и даже менее. Ключевое направление этой стратегии — предотвращение новых случаев заражения ВИЧ среди женщин детородного возраста в сочетании с ранней доступностью дородовой помощи и диагностики ВИЧ. Женщин, живущих с ВИЧ, также поощряют продолжать лечение на протяжении всей жизни ради сохранения собственного здоровья (стратегия подхода B+).

Ранняя диагностика новорожденных имеет важнейшее значение для выявления их ВИЧ-статуса и повышения эффективности программ профилактики и лечения, так как максимальная смертность среди детей, получивших ВИЧ-инфекцию, отмечается в возрасте от шести недель до четырех месяцев.

 

22) Каким процедурам должны следовать работники здравоохранения, чтобы не допустить передачи вируса в медицинских учреждениях?

Работники здравоохранения должны соблюдать универсальные меры предосторожности. Универсальные меры предосторожности — это руководства по контролю за инфекциями, разработанные для защиты работников здравоохранения и их пациентов от заражения заболеваниями, передающимися через кровь и некоторые биологические жидкости организма.

К универсальным мерам предосторожности относятся следующие:

  • Аккуратное обращение с острыми предметами (способными нанести порезы или колотые раны, включая иглы, инъекционные иглы, скальпели и другие лезвия, ножи, инфузионные системы, пилы, осколки стекла и гвозди) и их утилизация.  
  • Мытье рук водой с мылом перед любыми процедурами и после них.
  • Использование барьерных средств защиты, например перчаток, халатов, фартуков, масок и очков при прямом контакте с кровью и другими биологическими жидкостями организма.
  • Безопасная утилизация отходов, загрязненных кровью и другими биологическими жидкостями организма.
  • Надлежащая дезинфекция инструментов и другого загрязненного оборудования.
  • Надлежащая обработка грязного белья.

В дополнение к этому рекомендуется, чтобы все работники здравоохранения принимали меры для предотвращения травмирования иглами, скальпелями и другими острыми инструментами и устройствами. В соответствии с универсальными мерами предосторожности кровь и другие биологические жидкости организма каждого человека рассматриваются как зараженные ВИЧ и другими возможными вирусами независимо от известного или предполагаемого статуса соответствующего лица.

Подробные сведения см. по ссылке http://www.who.int/hiv/topics/precautions/universal/en/.

 

23) Можно ли вылечить ВИЧ?

Полностью уничтожить ВИЧ нельзя. Однако существует эффективное лечение, которое, если начать его оперативно и проводить регулярно, обеспечивает человеку с ВИЧ качество и продолжительность жизни, сравнимые с неинфицированными людьми.

 

24) Какое лечение доступно?

Для лечения ВИЧ-инфекции используются антиретровирусные препараты. Они борются с ВИЧ-инфекцией, блокируя размножение вируса в организме человека (см. вопрос 4). Если человек, живущий с ВИЧ, получает эффективную антиретровирусную терапию, он перестает быть заразным.

 

25) Как работают антиретровирусные препараты?

Находясь внутри инфицированной клетки, ВИЧ воспроизводит собственные копии, которые затем могут заразить новые, здоровые клетки организма. Чем больше клеток заражено ВИЧ, тем выше влияние вируса на иммунную систему (иммунодефицит). Антиретровирусные препараты замедляют репликацию и, соответственно, распространение вируса внутри организма, различными способами нарушая процесс воспроизведения.

Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы. Для создания собственных копий вирусу иммунодефицита человека требуется фермент, который называется обратная транскриптаза. Лекарства этой группы подавляют образование обратной транскриптазы, нарушая таким образом процесс воспроизведения генетического материала вируса.

Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы. Лекарства этой группы также нарушают репликацию ВИЧ, связывая сам фермент обратной транскриптазы. В результате он выводится из процесса репликации, и производство новых вирусных частиц в зараженной клетке прекращается.

Ингибиторы протеазы. Протеаза — расщепляющий фермент, необходимый в процессе репликации ВИЧ для создания новых вирусных частиц. Он расщепляет в инфицированных клетках белки и ферменты, после чего они могут попасть в другие клетки. Ингибиторы протеазы подавляют такое расщепление белков, замедляя таким образом производство новых вирусных частиц.

В настоящее время идут клинические испытания других лекарств, нарушающих другие стадии жизненного цикла вируса (например, попадание вируса в незараженную клетку и слияние с ней).

 

26) Эффективны ли антиретровирусные препараты?

Доказано, что использование комплекса из трех антиретровирусных препаратов существенно сокращает частоту заболеваний, связанных со СПИДом, и смертей. Хотя антиретровирусная комбинированная терапия и не излечивает СПИД, она обеспечивает людям с ВИЧ более долгую, здоровую и продуктивную жизнь благодаря сокращению вирусемии (количества ВИЧ в крови) и увеличению числа CD4-положительных клеток (лейкоцитов, играющих центральную роль в эффективном функционировании иммунной системы). 

Чтобы антиретровирусная терапия сохраняла эффективность в течение длительного времени, необходимо сочетать различные антиретровирусные препараты. Такое лечение называют комбинированной терапией. Термин «высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ)» используют, если применяется комплекс из трех и более препаратов против ВИЧ.

Было доказано, что при лечении только одним препаратом вирус со временем изменяется и развивает устойчивость к нему. В результате такое лекарство становится неэффективным, и вирус начинает воспроизводиться с той же скоростью, что и до лечения. При совместном приеме двух и большего числа антиретровирусных препаратов устойчивость развивается гораздо медленнее.

Антиретровирусные препараты следует принимать в строгом соответствии с назначением профессионального медицинского работника.

 


 

Тестирование

 

27) Что такое тест на ВИЧ?

Тест на ВИЧ — это анализ, позволяющий выяснить, подвергся ли человек заражению ВИЧ. При проведении обычного теста на ВИЧ выявляют антитела, произведенные иммунной системой в ответ на ВИЧ, так они поддаются обнаружению значительно легче (и дешевле), чем сам вирус. В ответ на инфекцию иммунная система вырабатывает антитела.

У большинства людей они появляются через месяц после заражения. Антитела можно обнаружить в крови или слюне.

 

28) Через какое время после вероятного контакта следует делать тест на ВИЧ?

Обычно тест на ВИЧ рекомендуется делать через три месяца после вероятного контакта с инфекцией. Хотя тесты на антитела к ВИЧ высокочувствительны, между заражением ВИЧ и выработкой поддающихся выявлению антител к вирусу существует «окно» длительностью до двух месяцев, в зависимости от конкретного типа анализа. Для самых чувствительных тестов на антитела к ВИЧ, рекомендуемых на сегодняшний день, этот период составляет около трех недель. При использовании менее чувствительных тестов он больше.

В течение этого времени у людей, зараженных ВИЧ, в крови еще нет антител, которые может выявить тест на ВИЧ. Однако уровень ВИЧ в биологических жидкостях организма (крови, сперме, влагалищном отделяемом и грудном молоке) у такого человека уже может быть высоким. Несмотря на то, что тест на ВИЧ еще не может подтвердить наличие вируса у такого человека, в период окна он уже способен передавать ВИЧ другим.

 

29) Почему мне следует сделать тест на ВИЧ?

Знание своего ВИЧ-статуса имеет два жизненно важных преимущества. Во-первых, если вы инфицированы ВИЧ, то быстро начнете лечение, что, возможно, продлит вашу жизнь на много лет (см. вопрос 36). Во-вторых, зная, что вы инфицированы, вы сможете принять все необходимые меры предосторожности, чтобы не допустить распространения ВИЧ-инфекции (см. вопрос 13). Если вы не инфицированы ВИЧ, то сможете узнать, как защитить себя от заражения ВИЧ в будущем.

 

30) Где я могу пройти тест?

Анализ на ВИЧ можно сделать во многих местах: у частного врача, в местном отделе здравоохранения, в больницах, центрах планирования семьи и пунктах, специально организованных для тестирования на ВИЧ. Всегда старайтесь выбрать такое место, где проводится консультирование по вопросам, связанным с ВИЧ.  Также анализ на ВИЧ можно сделать самостоятельно при помощи специальной тест-системы. Однако при положительном результате такого теста вы должны будете обратиться за медицинской помощью, чтобы получить подтверждение и необходимое лечение.

 

31) Являются ли результаты моего теста конфиденциальной информацией?

Каждый человек, проходящий тест на ВИЧ, предварительно должен дать информированное согласие. Информация о результатах теста считается абсолютно конфиденциальной.

Доступны разные варианты тестирования:

Конфиденциальный тест на ВИЧ. Медицинские специалисты, проводящие тест, вносят его результат в медицинские документы как конфиденциальную информацию. Такие результаты не могут быть раскрыты третьим лицам без предварительного согласия человека, которому был сделан анализ.

Анонимный тест на ВИЧ. Имя и фамилия лица, проходящего тест, не сопоставляется с пробой. Вместо этого ей присваивается код или номер, по которому человек затем может получить результаты своего теста. Записи, по которым человека можно было бы связать с тестом, не ведутся.

Рекомендуется выбирать политику совместной конфиденциальности — то есть, делиться информацией с близкими, в число которых могут входить члены семьи, любимые люди, лица, обеспечивающие уход, и друзья, которым вы доверяете. Однако при раскрытии результатов необходимо проявлять осторожность, так как это может привести к дискриминации в учреждениях здравоохранения, на работе и в обществе. Поэтому совместная конфиденциальность остается на усмотрение лица, проходящего тестирование. Хотя результат теста на ВИЧ должен оставаться конфиденциальным, другие профессионалы — например, консультанты или социальные работники, — должны иметь доступ к информации о ВИЧ-положительном статусе человека, чтобы оказать ему необходимую помощь.

 

32) Что делать, если у меня ВИЧ?

Благодаря новым методам лечения ВИЧ-положительный человек может прожить долгую и здоровую жизнь. Однако очень важно, чтобы ваш врач знал, как лечить ВИЧ. Профессиональный медицинский работник или обученный консультант по ВИЧ сможет проконсультировать вас и помочь найти подходящего врача.

 

33) Что означает негативный тест на ВИЧ?

Негативный результат теста означает, что на момент проведения анализа в вашей крови не были обнаружены антитела к ВИЧ. Если ваш статус отрицательный, позаботьтесь о том, чтобы сохранить его: ознакомьтесь с фактами о передаче ВИЧ и избегайте опасного поведения. 

Тем не менее риск заражения все равно остается, так как до момента, когда ваша иммунная система выработает достаточное количество антител, чтобы анализ крови показал заражение, может пройти до трех месяцев. Рекомендуется повторить тест спустя некоторое время, а до тех пор принимать необходимые меры предосторожности. В период окна человек очень заразен, поэтому необходимо принимать меры для предотвращения возможной передачи вируса. 

 


 

Мифы

 

34) Могут ли укусы комаров привести к заражению ВИЧ?

ВИЧ не распространяется комарами и другим жалящими насекомыми. Даже если вирус попадет в комара или другое кровососущее или жалящее насекомое, он не сможет воспроизводиться внутри такого насекомого. Таким образом, насекомое не может заразиться ВИЧ и не может передать ВИЧ другому человеку при укусе.

 

35) Следует ли бояться заражения ВИЧ при занятиях спортом?

Нет никаких свидетельств, которые подтверждали бы возможность передачи ВИЧ при занятиях спортом.

 

36) Можно заразиться ВИЧ бытовым путем (рукопожатия, объятия, пользование одним туалетом, питье из одного стакана с человеком, живущим с ВИЧ, а также нахождение рядом с инфицированным человеком, у которого насморк или кашель)?

ВИЧ не передается при повседневных контактах — общении с друзьями, в школе или на работе. Вы не заразитесь, если пожмете руку человеку, живущему с ВИЧ, обниметесь с ним, будете пользоваться одним туалетом или пить из одного стакана, а также если такой человек будет кашлять или чихать в вашем присутствии (см. вопрос 7).

 

37) ВИЧ заражаются только гомосексуалы и потребители наркотиков?

Нет. Любой человек, если он занимается сексом без презерватива, использует инъекционный инструментарий совместно с другими людьми или если ему перельют зараженную кровь, может заразиться ВИЧ. Новорожденные могут заразиться ВИЧ от своих матерей во время беременности и родов, а также позднее при грудном вскармливании.

 

38) Можно по внешнему виду человека понять, что у него ВИЧ?

По внешнему виду человека невозможно понять, что у него ВИЧ. Человек, зараженный ВИЧ, может выглядеть здоровым и хорошо себя чувствовать, но при этом передать вам вирус. Тест на ВИЧ — единственный способ, позволяющий человеку узнать, есть ли у него вирус.

 

39) Может ли у человека быть одновременно несколько заболеваний, передающихся половым путем?

Да, у человека может быть сразу несколько заболеваний, передающихся половым путем. Каждая инфекция требует собственного лечения. Иммунитет к ИППП не вырабатывается. Одним и тем же заболеванием можно заражаться многократно. При заражении ИППП многие мужчины и женщины не отмечают у себя и не чувствуют ранних симптомов, однако при этом могут заразить своего сексуального партнера.

 

40) Можно ли передать ВИЧ другим, находясь на антиретровирусной терапии?

Если антиретровирусная терапия эффективна, и вирус полностью подавлен, вы не можете передать ВИЧ другому человеку. Поэтому при лечении людей, живущих с ВИЧ, рекомендуется проводить мониторинг подавления вирусной нагрузки.

 


 

COVID-19 и ВИЧ

 

41) Если у меня ВИЧ, что мне следует знать о COVID-19?

COVID-19 — серьезное заболевание, и все люди, живущие с ВИЧ, должны принимать все рекомендованные меры профилактики, чтобы свести к минимуму риск заражения вирусом, который вызывает COVID-19.

Как и у населения в целом, у пожилых людей, живущих с ВИЧ, и людей, у которых помимо ВИЧ есть проблемы с сердцем или легкими, отмечается более высокий риск заражения вирусом и более серьезные симптомы.

Страны, в которых достаточно высока активность обеих эпидемий, смогут предоставить более точные данные о совместном влиянии ВИЧ и COVID-19 на людей, живущих с ВИЧ. Опыт внедрения инноваций и адаптации услуг с целью свести к минимуму воздействие на людей, живущих с ВИЧ, будет обсуждаться и распространяться по мере получения. До тех пор пока не стала известна более точная информация, людям, живущим с ВИЧ, особенно на поздней стадии, рекомендуется проявлять осторожность и принимать надлежащие меры профилактики.

 

42) Как люди, живущие с ВИЧ, могут защититься от вируса, вызывающего заболевание COVID-19?

Люди, живущие с ВИЧ, должны защищать себя и других от вируса, вызывающего заболевание COVID-19, точно так же, как и все остальные.

  • Регулярно и тщательно мыть руки водой с мылом или пользоваться антисептиком для рук на спиртовой основе.
  • Сохранять дистанцию не менее 1 метра от всех, кто кашляет или чихает.
  • Не трогать руками глаза, нос и рот.
  • Следовать (и просить следовать окружающих людей) правилам гигиены дыхательных путей: прикрывать нос и рот сгибом локтя или платком во время кашля и чихания и сразу же выбрасывать одноразовые платки и салфетки.
  • Выполнять рекомендации местных органов здравоохранения касательно социальной дистанции: оставаться дома за исключением неотложных дел, занятий спортом и необходимости получить медицинскую помощь.
  • Не собираться группами по несколько человек.
  • Оставаться дома при плохом самочувствии. В случае появления жара, кашля и затруднения дыхания заранее обратиться за медицинской помощью. Следовать указаниям местной медицинской службы.

Тем не менее ЮНЭЙДС признает, что во многих странах из-за недостаточно развитой системы здравоохранения, наличия неформальных поселений, переполненности городов и общественного транспорта, а также недостатка чистой воды и отсутствия канализации подобные меры самозащиты, социального дистанцирования и сдерживания вируса могут быть невыполнимы.

 

43) Есть ли у ЮНЭЙДС какие-либо особые рекомендации для людей, живущих с ВИЧ, на время пандемии COVID-19?

ЮНЭЙДС рекомендует людям, живущим с ВИЧ, запастись необходимыми лекарственными препаратами на какое-то время, в идеале — на 30 дней или больше. Речь идет как об антиретровирусных препаратах, так и об обычных лекарствах, например от туберкулеза, неинфекционных заболеваний, а также контрацептивах и средствах для поддержания психического здоровья.

Всемирная организация здравоохранения в своих рекомендациях по лечению ВИЧ предписала выдавать большинству пациентов во время плановых приемов запас лекарственных препаратов на срок три месяца и более. Не все страны соблюдают это правило, поэтому ЮНЭЙДС призывает к повсеместному внедрению подобной практики.

Знайте, как обратиться в клинику по телефону в случае, если потребуется консультация. Знайте, как получить лечение и другую необходимую помощь по месту вашего жительства. Такое лечение может включать антиретровирусную терапию, лечение туберкулеза (если оно проводится), а также другие лекарства для иных заболеваний при их наличии.

Помните, что во время пандемии COVID-19 другие заболевания также остаются активными. Обращайтесь за медицинской помощью, если у вас возникают или усиливаются какие-либо симптомы, в том числе связанные с сексуальным и репродуктивным здоровьем, психическим здоровьем и травмами. Как правило, риск некачественного или неподходящего лечения выше, чем риск заражения COVID-19 в медицинском учреждении.

 

44) Как ключевым группам населения защищаться от ВИЧ во время пандемии COVID-19?

Ключевые группы населения, включая людей, принимающих наркотики, работников секс-бизнеса, мужчин-геев и других мужчин, имеющих половые отношения с мужчинами, трансгендерных лиц и заключенных, должны по-прежнему соблюдать правила профилактики ВИЧ: использовать стерильные иглы и шприцы и (или) опиоидную заместительную терапию, а также презервативы и средства доконтактной профилактики (ДКП).

 

45) Как обеспечить защиту прав человека и сокращение уровня стигмы и дискриминации во время пандемии COVID-19?

ЮНЭЙДС призывает все страны обеспечить надлежащий баланс между охраной здоровья, предотвращением экономического и социального кризиса и защитой прав человека.

ЮНЭЙДС вместе со своими партнерами работает над учетом требований по защите прав человека при принятии мер в ответ на COVID-19 и над предоставлением людям, живущим с ВИЧ или пострадавшим от него, такого же уровня доступа к услугам, как и всем остальным, а также над обеспечением непрерывности услуг, связанных с ВИЧ.

С учетом переполненности многих тюрем и других мест лишения свободы, из-за чего под угрозой оказываются элементарная гигиена, здоровье, безопасность и человеческое достоинство, одних только мер по защите от COVID-19 в учреждениях закрытого типа будет недостаточно. ЮНЭЙДС призывает политических лидеров позаботиться о принятии в таких учреждениях надлежащих мер подготовки к COVID-19 и реагированию на него с учетом фундаментальных прав человека.

 

46) Что делать, если возникает проблема, связанная с гендерным насилием, во время пандемии COVID-19?

Если вы стали жертвой насилия, обратитесь за поддержкой к своим родным, друзьям или соседям, позвоните на горячую линию или, если это безопасно, воспользуйтесь онлайн-службой для жертв насилия. Узнайте, открыты ли соответствующие местные организации (например, убежища, консультационные службы), и при необходимости обратитесь к ним.

Составьте план обеспечения безопасности на случай повторного совершения насилия в отношении вас или ваших детей. Что включить в этот план?

  • Имена соседей, друзей, родственников, коллег или название убежища, где вы сможете укрыться, если вам придется срочно уйти из дома ради собственной безопасности.
  • План безопасного выхода из дома и перемещения в такое место (например, транспорт). 
  • Набор самых необходимых вещей (например, личные документы, телефон, деньги, лекарства и одежда), а также список номеров телефонов на случай экстренной ситуации.  
  • По возможности договоритесь с соседями об условном сигнале, заметив который, они смогут прийти вам на помощь в случае необходимости. 
 
47) Что делать, если возникает проблема, связанная с психическим здоровьем, во время пандемии COVID-19?

Уделяйте особенное внимание своему психическому здоровью:

  • Избегайте избыточного объема информации о COVID-19 из СМИ. Пользуйтесь только информацией из надежных источников.
  • Заботьтесь о своем организме. Выполняйте дыхательные упражнения, делайте растяжку или медитируйте. Попробуйте питаться правильно, сбалансированно, регулярно заниматься спортом, много спать и по возможности избегать алкоголя и наркотиков.
  • Выделяйте время на отдых, напоминайте себе, что негативные эмоции исчезнут. Делайте перерывы в просмотре, прослушивании и чтении новостей — постоянное напоминание о кризисе может расстраивать. Попробуйте заняться другими делами, которые вам нравятся, чтобы вернуться к нормальной жизни.
  • Общайтесь с другими. Поделитесь своими страхами и чувствами с другом или членом семьи.

ВИЧ-инфекция (HIV-infection). | Государственное учреждение «Минский городской центр гигиены и эпидемиологии»

Хронология эпидемии ВИЧ/СПИД

Информационные материалы для людей живущих с ВИЧ

Профилактика ВИЧ-инфекции среди детей подросткового возраста

Информационные материалы по профилактике ВИЧ/СПИД

Развей сомнения. Сдай экспресс тест на ВИЧ. Самотестирование на ВИЧ (видео)

Что такое ВИЧ/СПИД?

ВИЧ – инфекция – медленно прогрессирующее инфекционное заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека, характеризующийся поражением иммунной и нервной систем, с последующим развитием на этом фоне оппортунистических (сопутствующих) инфекций, новообразований, приводящих инфицированного ВИЧ к летальному исходу.

СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) — терминальная стадия ВИЧ-инфекции, характеризующиеся клиническими проявлениями (совокупностью определенных симптомов и заболеваний, вызванных существенными нарушениями иммунной системы).

Этиология.

Вирус иммунодефицита человека относят к семейству ретровирусов (Retroviridae), роду лентивирусов (Lentivirus). Ретровирусы, имеют в структуре вирионов обратную транскриптазу — фермент, синтезирующий ДНК на матрице РНК вируса. Название Lentivirus происходит от латинского слова lente — медленный. Такое название отражает одну из особенностей вирусов этой группы, а именно — медленную и неодинаковую скорость развития инфекционного процесса в макроорганизме. Для лентивирусов также характере длительный инкубационный период. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значи­тельно превышающей таковую у вируса гриппа, что является одним из факторов, затрудняющих разработку методов специфической профилактики болезни.

Устойчивость

ВИЧ чрезвычайно чувствителен к внешним воздействиям, гибнет под действием всех известных дезинфектантов. Нагревание до 56 °С в течение 10 минут снижает инфекционность вируса, при нагревании до 70-80 °С он инактивируется через 10 мин, при кипячении — через 1 мин.

Вирионы чувствительны к действию 70% этилового спирта (инактивируются через 1 мин), 3% раствора перекиси водорода, 0,5% раствора формальдегида, 3% раствора хлорамина, эфира, ацетона и др. Устойчив при лиофильной сушке, воздействии ультрафиолетовых лучей и ионизирующей радиации. Хорошо переносит низкие температуры.

В нативном состоянии в крови на предметах внешней среды сохранят заразную способность до 14 дней, в высушенных субстратах – до 7 суток.

Эпидемиология ВИЧ-инфекции

 

Единственным источником инфекции является ВИЧ-инфицированный человек на всех стадиях заболевания.

Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВИЧ-инфекции – многолетнее малосимптомное носительство вируса. В силу этого обстоятельства ВИЧ инфицированный человек в течение многих лет остается источником ВИЧ — инфекции (чаще всего нераспознанным)

В организме инфицированного человека ВИЧ с наибольшим постоянством и в наибольшем количестве обнаруживается в крови, сперме, вагинальном секрете, грудном молоке, цереброспинальной жидкости, лимфоидной ткани, в головном мозге и внутренних органах, в меньшей концентрации — в слезной жидкости, слюне, секрете потовых желез, что определяет особенности распространения возбудителя.

Пути передачи

Существует три основных пути передачи инфекции:

  • Парентеральный путь (через кровь) – заражение происходит при инъекционном введении инфицированных наркотических веществ, использовании нестерильных игл и шприцев, через необеззараженные многоразовые инструменты для маникюра/педикюра, тату, пирсинга.
  • Половой путь – заражение происходит при незащищенном половом контакте с ВИЧ-инфицированным. Наличие у человека инфекций передаваемых половым путем, увеличивает риск инфицирования ВИЧ в 10 раз.
  • Вертикальный, или внутриутробный путь — вирус передается от инфицированной матери ребенку во время беременности, родов, кормления грудью.

Диагностика

Течение ВИЧ-инфекции характеризуется длительным отсутствием существенных симптомов болезни.

Диагноз ВИЧ-инфекции ставится на основании лабораторных данных. В первые 3 месяца после заражения антитела к ВИЧ появляются у 90-95 % пациентов, через 6 мес.  — у остальных 5-9 %, а в более поздние сроки  (до года) — только у 0,5-1 %. Первые 4-6 недели после инфицирования ВИЧ представляют собой «период серонегативного окна», когда антитела к ВИЧ не выявляются. Поэтому отрицательный результат тестирования на ВИЧ в этот период не означает, что человек не инфицирован ВИЧ и не может заразить других. На основании этого, при подозрении на инфицирование ВИЧ проводят обследование через 1, 3, 6 месяцев после момента предполагаемого инфицирования.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА), выявление в крови антител к ВИЧ, является скрининговым. Для подтверждения специфичности результата, полученного в ИФА, используется реакция иммунного блоттинга (ИБ), принцип которой заключается в выявлении антител к целому ряду белков вируса. До получения положительного результата в ИБ и при отрицательном результате человек считается здоровым, противоэпи­демические мероприятия не проводят.

Для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции большое значение имеет определение «вирусной нагрузки» — количества ко­пий РНК ВИЧ в плазме методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).   

Лечение

До сих пор не найдены средства для проведения профилактических прививок против ВИЧ-инфекции и для полного излечения ВИЧ-инфицированных больных.

В настоящее время существуют лекарственные средства, способные снизить темп и остановить прогрессирование ВИЧ-инфекции – антиретровирусные препараты.

Антиретровирусная терапия является неотъемлемой и важнейшей частью комплексной терапии ВИЧ-инфекции, которая также включает лечение и профилактику оппортунистических инфекций, патогенетическую, иммунокорригирующую, симптоматическую, общеукрепляющую терапию и психосоциальную помощь. Целью антиретровирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией является максимальное и продолжительное угнетение репликации вируса, восстановление и/или сохранение функции иммунной системы, уменьшение числа осложнений, улучшение качества и продление жизни, снижение связанной со СПИДом заболеваемости и смертности. В связи с тем, что ВИЧ угнетает иммунную систему, важное значение придается поддержанию здоровья ВИЧ-положительного немедикаментозными средствами (правильное и рациональное питание, здоровый сон, избегание стрессов, перегревания и переохлаждения организма, здоровый образ жизни), а также регулярный мониторинг состояния здоровья у врачей-специалистов в области ВИЧ/СПИД.

Профилактика

Специфических средств профилактики ВИЧ-инфекции в настоящее время в мире не существует. Поэтому защита от ВИЧ/СПИД в подавляющих случаях зависит от поведения и образа жизни самого человека.

Алгоритм безопасного поведения.

  • Пользоваться только личными предметами гигиены (зубные щетки, бритвы, лезвия и маникюрные принадлежности и т.д.).
  • Требовать применения стерильного инструментария при обслуживании в различных учреждениях и организациях. Косметические процедуры (татуировки, пирсинг, маникюр, педикюр) проводить только в специальных учреждениях, имеющих лицензию на их проведение.
  • При случайных половых контактах пользоваться презервативом. Избегать половых связей с людьми, употребляющими наркотики.
  • Приучать себя и своего партнера систематически и правильно пользоваться презервативом; это поможет снизить вероятность заражения СПИДом, предохранит от венерических заболеваний и нежелательной беременности.
  • Не употреблять инъекционные наркотики.

Где можно пройти тест на ВИЧ?

Обследоваться на ВИЧ-инфекцию, в том числе добровольно и анонимно, можно в любом учреждении здравоохранения г. Минска. До и после теста Вы получите консультацию специалиста, который объяснит результат теста и ответит на интересующие Вас вопросы.

Все о ВИЧ/СПИДе

О ВИЧ/СПИДе. Этиология ВИЧ-инфекции. Введение.

ВИЧ-инфекция — это заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека, длительное время персистирующим в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной системы, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями, приводящими к гибели больного.

ВИЧ-инфекция — это смена стадий, последнюю из них обозначают термином СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита человека, являющуюся заключительной, терминальной стадией процесса.

Возбудитель и эпидемиология ВИЧ-инфекции

Возбудитель ВИЧ-инфекции — вирус иммунодефицита человека, принадлежит к подсемейству лентивирусов, семейства ретровирусов. Выделяют два типа вируса -ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Вирусная частица представляет собой форму, близкую к сферической, со средним диаметром 100-120 нм, состоящую из ядра, окруженное оболочкой. Ядро содержит РНК и ферменты — обратную транскриптазу (ревертазу), интегразу, протеазу. Наличие обратной транскриптазы обеспечивает обратную направленность потока генетической информации: не от ДНК к РНК, а наоборот, от РНК к ДНК.

В составе вириона имеется оболочка и нуклеоид. Наружная оболочка пронизана вирусными белками: трансмембранным и внешним глико-протеидами. Белки выполняют функцию детерминанты и участвуют в прикреплении к мембране клетки-хозяина, С внутренней стороны оболочки расположен каркас, образованный белком р 17, окружающий внутреннюю структуру вириона — нуклеоид (сердцевина). Собственно оболочка сердцевины образована белком р 24. Внутри нуклеоида располагается геном вируса, состоящих из 2 цепочек РНК, окруженных белками р 7 и р 9 .

Жизненный цикл ВИЧ включает в себя процессы специфической сорбции вируса на CD 4(+) — лимфоцитах за счет процессов диффузии мембран, синтез ДНК копии генома и дальнейшей ее интеграции в хромосому клетки-хозяина.

При попадании ВИЧ в клетку под действием фермента обратной транскриптазы происходит образование ДНК ВИЧ, встраивающейся в ДНК клетки-хозяина, которая в дальнейшем продуцирует вирусные частицы.

ВИЧ не стоек в окружающей среде. Полностью инактивируется нагреванием при температуре 56°С в течение 30 мин, быстро погибает при кипячении (1-3 мин), а также под воздействием дезинфицирующих средств н концентрациях, обычно используемых в практике. ВИЧ в то же время устойчив к ультрафиолетовым лучам и ионизирующей радиации.

Источником заражения является человек, инфицированный ВИЧ как в стадии бессимптомного носителъства, так и развернутых клинических проявлений болезни. Вирус обнаруживается в крови, сперме, спинномозговой жидкости, грудном молоке, менструальной крови, влагалищном секрете, которые являются факторами передачи ВИЧ-инфекции. В слюне, слезной жидкости, моче ВИЧ находится в небольшом количестве, недостаточном для заражения.

Пути передачи ВИЧ-инфекции — половой (гетеро- и гомосексуальный), парентеральный и вертикальный.

Парентеральный путь передачи встречается, в основном, среди потребителей наркотических препаратов внутривенным путем. Факторами передачи ВИЧ при этом могут быть как общие шприцы и иглы, так и сам наркотический препарат, в который добавляется кровь с целью «очистки». Инфицирование возможно при использовании контаминированного ВИЧ медицинского инструментария, не прошедшего соответствующую обработку.

Вертикальный путь передачи может быть от инфицированной матери ребенку во время беременности и родов, а также во время грудного вскармливания, возможно также заражение матери от ВИЧ-инфецированного ребенка при его вскармливании.

Патогенез ВИЧ-инфекции.

При попадании ВИЧ в клетку, РНК под воздействием ревертазы превращается в ДНК, которая встраивается в ДНК клетки-хозяина, продуцируя новые вирусные частицы — копии РНК вируса, оставаясь в клетке пожизненно. Ядро окружено оболочкой, в составе которой имеется белок g р 120, обуславливающий прикрепление вируса к клеткам организма человека, имеющим рецептор — белок CD 4 .

ВИЧ адсорбируется на клетках, в состав мембраны которых входит белок CD 4. Это Т-лимфоциты с фенотипом CD 4(+) , макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии (вследствие этого происходит поражение центральной нервной системы), клеток слизистой оболочки кишечника, дендритных клеток. Прежде всего поражаются С D 4(+)-лимфоциты, являющиеся центральной фигурой иммунного ответа. Причиной снижения Т-хелперов является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и слияние неинфицированных клеток с инфицированными и образование синтиция.

Одновременно происходит нарушение функции В-лимфоцитов. повышается количество иммуноглобулинов, циркулирующих иммунных комплексов, что ведет к большему снижению С D 4(+) — лимфоцитов. Все перечисленные механизмы и формируют различные клинические проявления заболевания. В результате поражения центральных звеньев иммунной системы человек, инфицированный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций, в первую очередь, условно-патогенными (оппортунистическими) микроорганизмами, которые не представляют угрозы для практически здорового человека.

В связи с прогрессированием вторичного иммунодефицитного состояния формируются опухолевые и аутоиммунные процессы, в патологический процесс всегда вовлекается ЦНС, куда проникает вирус вместе с инфицированными моноцитами. Поражение клеток нейроглии приводит к трофическим повреждениям нейронов, ткани мозга, нарушению мозговой деятельности, и в конечном итоге развитию СПИД-деменции (слабоумию).

Российская классификация ВИЧ-инфекции, 2006 год (В.В. Покровский)

Стадия 1 — «стадия инкубации» — период от момента заражения до появления реакции организма в виде клинических проявлений «острой инфекции» и/или выработки антител. Продолжительность ее обычно составляет от 3-х недель до 3-х месяцев, но в единичных случаях может затягиваться и до года

Стадия 2 — «стадия первичных проявлений» — связана с проявлением первичного ответа организма на внедрение и репликацию ВИЧ в виде клинических проявлений и/или выработки антител. Стадия первичных проявлений ВИЧ-инфекции может иметь несколько вариантов течения.

2А «Бессимптомная», характеризуется отсутствием каких-либо клинических проявлений ВИЧ-инфекции. Ответ организма на внедрение ВИЧ проявляется лишь выработкой антител.

2Б «Острая инфекция без вторичных заболеваний» проявляется разнообразной кли­нической симптоматикой. Наиболее часто регистрируются лихорадка, высыпания на коже и слизистых (уртикарные, папулезные, петехиальные), увеличение лимфатических узлов, фарингит. Могут отмечаться увеличение печени, селезенки, диарея. Иногда такой вариант течения называют «мононуклеозоподобный» или «краснухоподобный» синдром

2В «Острая инфекция с вторичными заболеваниями» характеризуется значительным снижением уровня С04-лимфоцитов. В результате на фоне иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (кандидозы, герпетическая инфекция и т.д.). Их проявления, как правило, слабо выражены, кратковременны, хорошо поддаются терапии, но могут быть тяжелыми (кандидозный эзофагит, пневмоцистная пневмония), в редких случаях возможен даже смертельный исход.

Продолжительность клинических проявлений во второй стадии может варьировать от нескольких дней до нескольких месяцев, однако обычно они регистрируется в течение двух-трех недель.

В целом продолжительность стадии первичных проявлений ВИЧ-инфекции составляет один год с момента появления симптомов острой инфекции или сероконверсии.

Стадия 3 — «субклиническая стадия» — характеризуется медленным нарастанием иммунодефицита, что связано с компенсацией иммунного ответа за счет модификации и избыточного воспроизводства С04-клеток. Скорость размножения ВИЧ в этот период по сравнению со стадией первичных проявлений замедляется.

Основным клиническим проявлением субклинической стадии является «персистирующая генерализованная лимфоаденопатия» (ПГЛ). Для нее характерно увеличение не менее двух лимфоузлов, не менее чем в двух не связанных между собой группах (не считая паховых), у взрослых до размера в диаметре более 1 см, у детей — более 0,5 см, сохраняющееся в течение не менее трех месяцев. При осмотре обычно лимфатические узлы эластичные, безболезненные, не спаяны с окружающей тканью, кожа над ними не изменена.

Длительность субклинической стадии составляет от двух-трех до 20-ти и более лет, но в среднем она продолжается 6-7 лет. Скорость снижения уровня С04-лимфоцитов в этот период в среднем составляет 50-70×106/л в год.

Стадия 4 — «стадия вторичных заболеваний» — связана с истощением популяции С04-клеток за счет продолжающейся репликации ВИЧ. В результате на фоне значительного иммунодефицита развиваются инфекционные и/или онкологические вторичные заболе­вания. Их наличие обусловливает клиническую картину стадии вторичных заболеваний.

В зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В.

4А обычно развивается через 6-10 лет от момента заражения. Для нее характерны бактериальные, грибковые и вирусные поражения слизистых и кожных покровов, вос­палительные заболевания верхних дыхательных путей. Обычно стадия 4А развивается у пациентов с уровнем С04-лимфоцитов 500-350×106/л (у здоровых лиц число С04-лимфоцитов колеблется в пределах 600-1900×106/л).

4Б чаще возникает через 7-10 лет от момента заражения. Кожные поражения в этот пе­риод носят более глубокий характер и склонны к затяжному течению. Начинают развиваться поражения внутренних органов. Могут отмечаться потеря веса, лихорадка, локализованная саркома Капоши, поражение периферической нервной системы. Обычно стадия 4Б развивается у пациентов с уровнем С04-лимфоцитов 350-200×106/л.

4В преимущественно выявляется через 10-12 лет от момента заражения. Она характе­ризуется развитием тяжелых, угрожающих жизни вторичных заболеваний, их генера­лизованным характером, поражением ЦНС. Обычно стадия 4В имеет место при уровне С04- лимфоцитов менее 200×106/л.

Несмотря на то, что переход ВИЧ-инфекции в стадию вторичных заболеваний является проявлением истощения защитных резервов организма зараженного человека, этот процесс имеет обратимый характер (по крайней мере, на какое-то время). Спонтанно или вследствие проводимой терапии клинические проявления вторичных заболеваний могут исчезать. Поэтому в стадии вторичных заболеваний выделяют фазы прогрессирования (при отсутствии противоретровирусной терапии или на фоне противоретровирусной терапии) и ремиссии (спонтанной, после ранее проводимой противоретровирусной терапии или на фоне противоретровирусной терапии).

Стадия 5 — «терминальная стадия» — проявляется необратимым течением вторичных заболеваний. Даже адекватно проводимая противоретровирусная терапия и лечение вторичных заболеваний оказываются не эффективными. В результате больной погибает в течение нескольких месяцев. На этой стадии число С04-клеток, как правило, ниже 50хЮ6/л. 

Протеомная характеристика свежих сперматозоидов и надосадочной жидкости после криоконсервации в отношении способности к замораживанию спермы карпа (Cyprinus carpio L)

Abstract

Наши недавние исследования показали, что возможность замораживания спермы карпа связана с профилями белков семенной плазмы. Здесь мы стремились сравнить протеомы сперматозоидов хорошей (GF) и плохой (PF) спермы карпа, способной к замораживанию. Для этого мы использовали двухмерный разностный гель-электрофорез с последующей масс-спектрометрией MALDI-TOF/TOF.Сперму классифицировали как GF или PF на основании подвижности сперматозоидов после замораживания/оттаивания. Идентифицировали белки, обогащенные сперматозоидами GF (22 белка) и PF (18 белков) спермы. Мы также идентифицировали 12 белков, обогащенных супернатантом после криоконсервации спермы ПФ. Хорошая способность к замораживанию связана с высокими концентрациями белков, участвующих в поддержании структуры жгутиков, текучести мембран, эффективном контроле Ca 2+ и подвижности сперматозоидов, выработке энергии и антиоксидантной защите, что, вероятно, отражает статус полного созревания сперматозоидов GF. сперма.С другой стороны, плохая способность к замораживанию, по-видимому, связана с присутствием белков, идентифицированных как высвобождаемые в больших количествах из криоконсервированной спермы PF. Таким образом, идентифицированные белки могут быть полезными биоиндикаторами устойчивости к замораживанию и могут быть использованы для скрининга самцов карпа перед криоконсервацией, что улучшит долгосрочное сохранение спермы у карпа. Данные доступны через ProteomeXchange с идентификатором PXD008187.

Образец цитирования: Дитрих М.А., Церешко А. (2018) Протеомная характеристика свежих сперматозоидов и супернатантов после криоконсервации в зависимости от способности к замораживанию спермы карпа ( Cyprinus carpio L).ПЛОС ОДИН 13(3): e0192972. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972

Редактор: Myung-Geol Pang, Университет Чунг-Анг, РЕСПУБЛИКА КОРЕЯ

Поступила в редакцию: 9 мая 2017 г.; Принято: 15 января 2018 г.; Опубликовано: 22 марта 2018 г.

Copyright: © 2018 Dietrich, Ciereszko. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа была поддержана Проектом 2011/01/D/NZ9/00628 для MD из Национального научного центра, Польша, и фондами, выделенными Институту репродукции животных и пищевых исследований, http://www. ncn.gov.pl/finansowanie-nauki/konkursy/typy?languag=&language=en. Стоимость обработки статьи была покрыта грантом Научного консорциума KNOW: «Здоровое животное — безопасная пища» (Министерство науки и высшего образования; декабрь: 05-1/KNOW2/2015).Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Криоконсервация широко используется в вспомогательных репродуктивных технологиях, сельском хозяйстве и программах сохранения исчезающих видов. Однако в рыбоводстве этот метод еще не реализован на коммерческом уровне.Криоконсервация является повреждающим процессом, вызывающим окислительный и осмотический стрессы, которые изменяют состав липидов и белков, снижают подвижность и жизнеспособность, вызывают повреждение митохондрий и хвостов сперматозоидов, а также увеличивают фрагментацию ДНК сперматозоидов, что приводит к снижению качества спермы позвоночных после криоконсервации [1–2]. 7]. По этим причинам протоколы криоконсервации должны быть тщательно оптимизированы, чтобы свести к минимуму вышеупомянутые повреждения. Разработано несколько эффективных протоколов криоконсервации спермы карпа [8–11].Однако эти протоколы не дают удовлетворительных результатов для некоторых людей из-за различий в способности образцов выдерживать процесс замораживания-оттаивания [12]. Таким образом, идентификация маркеров для прогнозирования результатов криоконсервации спермы карпа является необходимым условием для улучшения протоколов криоконсервации спермы.

Параметры качества свежей спермы (например, подвижность, жизнеспособность и концентрация сперматозоидов) использовались в качестве инструментов прогнозирования потенциала криоконсервации спермы у рыб [5, 6, 9, 13, 14].Однако полезность таких биоиндикаторов варьируется в зависимости от вида рыб и отдельных особей. По этой причине существует необходимость идентификации молекулярных биомаркеров качества спермы. У млекопитающих такие различия в замораживаемости связаны с белковым составом семенной плазмы и сперматозоидов [15–19]. Некоторые специфические белковые маркеры хорошей и плохой замораживаемости спермы были идентифицированы у млекопитающих [20, 21]. Более высокие уровни белка теплового шока 90, акрозин-связывающего белка и потенциал-зависимого анионного канала 2, а также более низкие уровни триозофосфатизомеразы коррелируют с GF у сперма хряка [22–26].Было показано, что высокие уровни енолазы и глюкозо-6-фосфатизомеразы являются маркерами GF в сперме человека [27]. Недавний сравнительный анализ протеома спермы быка показал, что высокая способность к замораживанию связана с более высоким уровнем белков, связанных со стабилизацией структуры акросомы, стабилизацией мембраны спермы и энергетическим метаболизмом спермы [28]. Кроме того, протеомные исследования у людей и быков показали, что белки сперматозоидов, измененные при криоконсервации, также могут служить маркерами устойчивости к длительному криоконсервированию [29, 30].Юн и др. [31] наблюдали динамику эпидидимального протеома сперматозоидов и возможные белковые маркеры криостресса при криоконсервации. Они обнаружили, что девять белков по-разному экспрессировались до и после криоконсервации (уровень двух белков снизился, а уровень семи увеличился). Поскольку транскрипция, трансляция и синтез белка обычно не происходят в зрелых сперматозоидах, наблюдаемое увеличение количества белка после криоконсервации может быть результатом посттрансляционной модификации.

Процент подвижной спермы после замораживания и оттаивания обычно используется в качестве показателя качества спермы как у млекопитающих, так и у рыб. Он использовался в молочной промышленности для оценки успеха криоконсервации и в качестве отличительного фактора в протеомных исследованиях способности к замораживанию спермы млекопитающих [17–19, 32]. Недавно Горохорватский с соавт. [12] использовали подвижность сперматозоидов после оттаивания для классификации криорезистентности спермы карпа. В рыбном CASA оценка процента подвижных сперматозоидов в образцах свежей и криоконсервированной спермы положительно коррелирует со способностью к оплодотворению и может использоваться в качестве показателя способности к оплодотворению у многих видов рыб, включая карпа [14, 33–35].В настоящее время неизвестно, можно ли использовать другие характеристики спермы в качестве показателей качества спермы. Более раннее исследование показало, что жизнеспособность сперматозоидов у рыб является менее чувствительным показателем токсичности тяжелых металлов и способности к оплодотворению, чем подвижность сперматозоидов [36].

Сперма состоит из сперматозоидов и окружающей их жидкости, называемой семенной плазмой. Наши недавние исследования показали, что возможность замораживания спермы карпа связана с профилями белков семенной плазмы, даже если тестируемая сперма характеризуется сходными исходными параметрами качества спермы [37]. Мы указали в семенной плазме потенциальных белковых биомаркеров замораживаемости, связанных с целостностью мембран сперматозоидов и антиоксидантной защитой. Однако, насколько нам известно, нет сведений о взаимосвязи между протеомом сперматозоидов карпа и замораживаемостью. Такое исследование должно предоставить дополнительные новые биомаркеры способности к замораживанию спермы сперматозоидов карпа. Эти знания являются необходимым условием для лучшего понимания механизма криоповреждений отдельных структур и функций сперматозоидов.

Целью настоящего исследования было сравнение протеома свежих (до криоконсервации) сперматозоидов спермы карпа GF и PF с использованием метода 2D-DIGE и выявление дифференциально распространенных белков. Кроме того, мы сравнили супернатанты спермы ГФ и ПФ после криоконсервации и выявили, что белки вытекли в большем количестве из сперматозоидов ПФ, чем ГФ. Выявленные белки сперматозоидов могут служить потенциальными биомаркерами замораживаемости. Мы считаем, что на основе полученных нами результатов ELISA-тесты могут быть разработаны для скрининга самцов карпа на способность к замораживанию спермы и для улучшения методов сохранения карпа.

Материалы и методы

Происхождение рыбы и управление маточным стадом

Молоки сазана ( Cyprinus carpio L) были получены от рыб, содержащихся в Институте ихтиобиологии и аквакультуры Польской академии наук в Голише, Польша. Самцов случайным образом отбирали из большей популяции производителей из пруда в середине нерестового сезона (2 июля). Группу самцов 5–7 лет (n = 20) помещали в аквариум объемом 2,5 м3 с аэрированной водой температурой 19–20°С и содержали в стабильных условиях в течение двухдневного адаптационного периода.За сутки до сбора спермы карпа самцам интрадорсально вводили Овопел (одна таблетка, содержащая 18–20 мкг аналога ГнРГ и 8–10 мг метоклопрамида на кг массы тела рыбы; Interfish Ltd., Венгрия). . Молоко получали путем легкого массажа живота, стараясь не загрязнять образец кровью, фекалиями или мочой.

Перед началом экспериментов было получено разрешение Комитета по этике экспериментов на животных в Ольштыне, Польша (№ 93/2011).

Сбор спермы хорошей и плохой замораживаемости

Это исследование является продолжением нашего недавно опубликованного отчета о различиях в профиле белков семенной плазмы спермы карпа с хорошей замораживаемостью (GF) и плохой замораживаемостью (PF) [37]. Одни и те же образцы спермы GF (n = 6) и PF (n = 6) использовались для анализа семенной плазмы [37] и сперматозоидов (данное исследование).

Чтобы различить образцы спермы между двумя группами, сперма была криоконсервирована с использованием метода замораживания, описанного Копейкой [38].Вкратце, образцы спермы разводили (1:9) в разбавителе, состоящем из 59 мМ NaCl, 6,3 мМ KCl, 0,68 мМ CaCl 2 , 2,1 мМ Mg 2 SO 4 , 27 мМ NaHCO 3 , 3,3. мМ сахарозы, 69 мМ D-маннита, 118 мМ трис-HCl, pH 8,1 и 16% этиленгликоля. После разбавления разбавителем образцы загружали в соломинки объемом 0,5 мл и выдерживали в парах жидкого азота на высоте 3 см над поверхностью жидкого азота в течение 5 мин. Затем соломинки погружали в жидкий азот и хранили в течение двух недель.После замораживания соломинки размораживали, погружая их в водяную баню (40°С) на 13 с.

Параметры подвижности свежей и криоконсервированной спермы определялись с помощью компьютерного анализа спермы (CASA) с использованием двухэтапного метода измерения подвижности, описанного Rurangwa et al. [14]. Снижение процента подвижности сперматозоидов, вызванное криоконсервацией, использовали в качестве маркера способности спермы к замораживанию. В наборе из 20 самцов карпа условно выделены две группы со спермой с высокой и низкой замораживаемостью.Шесть образцов спермы с наибольшим снижением подвижности сперматозоидов после замораживания и оттаивания были классифицированы как имеющие PF (это дало порог ≥ 40% для снижения МОТ сперматозоидов). Шесть образцов спермы с наименьшим снижением были классифицированы как имеющие ГФ (порог снижения МОТ сперматозоидов был ≤ 20%).

Все кинетические параметры движения сперматозоидов, измеренные до и после криоконсервации с использованием системы CASA (VCL, VSL, VAP, PFT, MAD, BCF, ALH, DMN, LIN, STR, Mot), представлены в таблице S1. После криоконсервации процент подвижных сперматозоидов в сперме PF был ниже, чем в сперме GF. Другая кинетика движения сперматозоидов, кроме STR, не отличалась между GF и PF. Однако в свежей сперме из обеих групп STR и другие параметры движения сперматозоидов были одинаковыми. Результаты четырех показателей кинетики сперматозоидов % MOT, VCL, VSL и ALH для обеих групп представлены в нашем предыдущем исследовании [37].

Приготовление свежих сперматозоидов и надосадочной жидкости после криоконсервации из спермы карпа хорошей и плохой морозостойкости

Для получения сперматозоидов с хорошей (n = 6) и плохой (n = 6) замораживаемостью сперму центрифугировали при 3000×g в течение 30 мин (4°C).После удаления супернатанта осадки (содержащие сперматозоиды) дважды промывали раствором для иммобилизации сперматозоидов (20 мМ трис-HCl, 200 мМ KCl, pH 8,0) путем центрифугирования при 3000xg при 4°C в течение 30 мин. Белки экстрагировали из сперматозоидов буфером для лизиса (8 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% [масса/объем] 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат [CHAPS]), 0,1% (масса/объем) Triton X-100, 100 мМ дитиотреитола (DTT), 2 % (об. /об.) буфера с иммобилизованным градиентом рН (IPG) (3–10 нл) и 2,5 % (об./об.) смеси ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich, St. .Луис, США). Образцы обрабатывали ультразвуком (5 с три раза), выдерживали на льду в течение 1 ч и центрифугировали в течение 10 мин при 14000×g при 4°C. Белковый экстракт (сперматозоиды) хранили при -80°С до проведения анализа.

Супернатант после криоконсервации определяется как жидкость, окружающая расширенную сперму после криоконсервации. В его состав входят семенная плазма, разбавитель и вещества, вытекающие из сперматозоидов после замораживания и оттаивания. Для получения супернатантов после криоконсервации криоконсервированную сперму хорошей и плохой замораживаемости центрифугировали при 3000×g в течение 30 мин при 4°С с последующим центрифугированием супернатанта в течение 10 мин при 12000×g при 4°С.Супернатант криоконсервированной спермы собирали и хранили при -80°С. Перед протеомным анализом супернатанты спермы GF и PF концентрировали с использованием ультрацентрифуги Amicon (отсечение молекулярной массы 3 кДа [Millipore]).

Перед протеомным анализом аликвоты, содержащие примерно 800 мкг белков (сперматозоиды и супернатант после криоконсервации), обрабатывали с помощью набора для очистки (GE Healthcare, Уппсала, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Образцы ресуспендировали в 80 мкл буфера для мечения DIGE, состоящего из 30 мМ Трис, 7 М мочевины, 2 М тиомочевины и 4% CHAPS, до концентрации белка 5–10 мг/мл.Концентрацию белка до и после процедуры очистки измеряли с использованием набора Coomassie Plus Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

2D-DIGE-анализ свежих сперматозоидов и супернатантов после криоконсервации спермы с хорошей и плохой замораживаемостью

Было проведено два независимых анализа 2D-DIGE для сравнения i) профилей белков сперматозоидов спермы GF и PF (n = 6 для каждой группы) и ii) профилей белков супернатанта после криоконсервации спермы GF и PF ( n = 6 для каждой группы).Для каждой биологической повторности 50 мкг белкового экстракта каждого типа образцов (сперматозоиды и супернатанты после криоконсервации GF и PF) метили 400 пмоль Cy3 или Cy5 (GE Healthcare) соответственно. Замена красителей (Cy3/Cy5) выполнялась между образцами с хорошей и плохой морозостойкостью, чтобы исключить погрешность окрашивания. Внутренний стандарт был создан путем смешивания равных количеств каждого образца в ходе эксперимента и был помечен Cy2. После инкубации на льду и в темноте в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 10 мМ лизина.Затем в каждом эксперименте три меченых образца объединяли по схеме, представленной в таблицах S2 и S3, и разбавляли регидратационным буфером (8 М мочевина, 2% CHAPS, 18 мМ дитиотреитол (ДТТ), 0,5% амфолит-носитель, рН (3–3 10 нл) до 340 мкл.Объединенные образцы наносили на полоску с градиентом рН (18 см, рН 3–10 нл) для изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) на системе Ettan IPGphor (Amersham Bio-sciences, Уппсала, Швеция), как описано Дитрих и др. [39].После ИЭФ полоски сначала уравновешивали в уравновешивающем растворе 50 мМ трис-HCl (pH 8.8), 6 М мочевины, 30% (об./об.) глицерина, 2% (вес./об.) SDS, следы бромфенолового синего и 1% (вес. /об.) ДТТ в течение 15 мин, а затем в том же растворе, за исключением что ДТТ был заменен 4% (вес/объем) йодацетамида еще на 15 мин. Полоски с уравновешенным иммобилизованным градиентом pH (IPG) переносили на 12,5% вертикальные полиакриламидные гели (размер геля 25,5 × 19,6 см, толщина 1 мм, отливали в стеклянные пластины с низкой флуоресценцией с использованием шестисистемной системы Ettan Dalt [GE Healthcare, Уппсала, Швеция]). . Электрофорез проводили в течение ночи при 1.5 Вт на гель постоянного тока. Изображения, меченные Cy2-, Cy3- и Cy5, были получены на сканере Typhoon 9400 (Amersham Biosciences) при значениях возбуждения и эмиссии 488/520, 532/580 и 633/670 нм соответственно.

Обнаружение и количественная оценка внутригелевых пятен, а также межгельное сопоставление и количественная оценка были выполнены с использованием модулей дифференциального внутригелевого анализа (DIA) и анализа биологических вариаций (BVA) программного обеспечения DeCyder версии 6.5 (Amersham Bio-sciences). Во время обнаружения пятен расчетное количество пятен было установлено на уровне 10 000, а объем <30 000.Полученные карты точек были экспортированы в BVA. Сопоставление геля с гелем стандартных карт точек из каждого геля с последующим статистическим анализом изменения содержания белка между образцами выполняли в модуле BVA. Критерием отбора для обнаружения значительно измененных белковых пятен было то, что белковые пятна выявлялись во всех анализируемых гелях со статистической значимостью (p ≤ 0,05).

Расщепление белков и масс-спектрометрический анализ

Интересующие точки с дифференциальной экспрессией белка вырезали из гелей DIGE и подвергали расщеплению в геле трипсином.Вкратце, гелевые пробки обесцвечивали 30% ацетонитрилом в 100 мМ бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3 ) в течение 30 мин и сушили в вакууме. Затем добавляли раствор для переваривания (20 нг/мкл трипсина (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в 20 мМ NH 4 HCO 3 , и образцы переваривали при 37°C в течение ночи. После переваривания пептиды экстрагировали. с 0,1% трифторуксусной кислотой, а затем концентрировали и обессоливали с использованием наконечников для пипеток Zip-Tip C18 (Millipore), как описано Dietrich et al.[27]. Равные объемы образца и матрицы α-HCCA (5 мг/мл) наносили и смешивали на планшете-мишени MALDI-TOF. Смеси пептидов анализировали с помощью масс-спектрометра Bruker Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT (Bruker Daltonics, Бремен, Германия) в режиме отражателя положительных ионов. Ускоряющий потенциал составлял 20 кВ при восьми выстрелах в секунду. Каждый спектр был откалиброван внутри с использованием моноизотопных [M + H] + калибровочных стандартов ионных пептидов (Bruker Daltonics), состоящих из ангиотензина II (1046.54), ангиотензин I (1296,68), субстанция Р (1347,73), бомбезин (1619,82), АКТГ клип 1 (2093,086), АКТГ клип 18 (2465,19) и соматостатин 28 (3147,471). МС-пептидный масс-отпечаток (PMF) и масс-спектры фрагментов (МС/МС) из каждой отдельной точки были объединены и использованы для поиска в базе данных NCBInr Bony Fishes (база данных, содержащая 3 005 095 белков, была создана 30 января 2017 г. с использованием MascotServer [Matrix Sciences]) со следующими настройками: фермент расщепления, трипсин; макс. пропущенные расщепления 2; допуск по массе моно, 50 частей на миллион; Допуск по массе осколочного иона, 0.5 Да; допуск по массе родительского иона, 200 частей на миллион; алкилирование цистеина карбамидометилированием в виде фиксированной модификации; и окисление метионина как вариабельная модификация. Для поиска ионов PMF и MS/MS статистически значимые ( p ≤ 0,05) совпадения с помощью MASCOT считались правильными совпадениями. Белки, идентифицированные как гипотетические, искали с точки зрения сходства белковых последовательностей с использованием инструмента Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

Путь изобретательности и анализ STRING

Чтобы понять биологический контекст идентифицированных белков и их участие в биологических путях, дифференциально распространенные белки были подвергнуты классификации анализа пути изобретательности (IPA) (версия 9. 0, http://www.pantherdb.org/). Поскольку IPA принимает только инвентарные номера генов или белков, представляющие гены или белки человека, мыши и крысы, сначала были идентифицированы ортологи идентифицированных белков карпа, принадлежащих к этим трем видам, а инвентарные номера самых популярных бластных хитов были загружены в IPA. Каждый идентификатор был связан с базой знаний IPA и использовался для создания сетей и идентификации белков пяти основных категорий для каждого из функциональных доменов и канонических путей.Для расчета значимости ( p ≤ 0,05) функциональных и канонических путей белков, участвующих в подвижности сперматозоидов, использовали точный критерий Фишера и множественные поправки Бенджамини-Хохберга.

Для анализа сети белок-белковых взаимодействий дифференциально экспрессируемые белки (как определено с помощью BVA) были проанализированы с использованием базы данных STRING версии 10.5 (Инструмент поиска для поиска взаимодействующих генов, http://string-db. org/) с высокий показатель достоверности (оценка > 0.7). Номер доступа UniProt для всех идентифицированных белков был представлен и сопоставлен с эталонным набором данных Homo sapiens . Сети взаимодействия были получены на основе достоверности и доказательств.

Валидация результатов 2D-DIGE методом вестерн-блоттинга

Мы использовали антитела против Pv карпа, полученные в нашей лаборатории путем иммунизации кролика Pv, выделенным из сперматозоидов карпа [40], чтобы подтвердить идентификацию Pv как белка, содержание которого зависит от замораживаемости спермы.Аликвоты (100 мкг) белков сперматозоидов из спермы GF и PF (оба n = 6) G (n = 6), доведенные до 125 мкл регидратационным буфером, наносили на 7-сантиметровые полоски IPG (диапазон pH 4–7; GE Healthcare ). Изоэлектрофокусировку проводили в соответствии с протоколом производителя (GE Healthcare), а затем полоски ИПГ уравновешивали 2% дитиотреитола и 2,5% йодацетамида. Каждую полоску помещали на 15% гель SDS-PAGE (10×8×0,1 см) для электрофореза второго измерения. Вестерн-блоты выполняли, как описано Dietrich et al.[39]. Вкратце, шесть образцов сперматозоидов из спермы GF и PF были перенесены на нитроцеллюлозные мембраны после 2DE. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4°C с антителами против Pv, разведенными 1:20000 в TBS-T (0,05 М Трис-HCl, 0,15 М NaCl и 0,1% Твин 20, рН 7,6). После промывки для удаления несвязавшихся первичных антител мембраны инкубировали с лошадиными антикроличьими антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (AP) (Sigma), разведенными 1:20000 в TBS-T, в течение двух часов при комнатной температуре. Продукты визуализировали путем инкубации с 5-бром-4-хлор-30-индолифосфатом и растворителем реагента нитро-синий тетразолий (BCIP/NBT) в темноте в течение 10 мин, после чего мембраны промывали 2 мМ ЭДТА для остановки цветной реакции.Затем блоты сканировали с помощью системы VersaDoc MP 4000 (Bio-Rad). Используя программное обеспечение для анализа Quantity One, версия 4.6.9 (Bio-Rad), пятна Pv количественно определяли по плотности/площади (INT/мм2). Относительное содержание Pv рассчитывали как отношение содержания отдельных пятен к общему содержанию Pv.

Результаты

Сравнение протеома свежих сперматозоидов спермы хорошей и плохой замораживаемости

Анализ белков сперматозоидов из спермы с хорошей и плохой способностью к замораживанию с использованием количественной технологии 2D-DIGE привел к обнаружению 1555 совпадающих пятен, из которых 54 пятна имели существенное различие в количестве (> 1,0.1-кратное изменение, p<0,05) между GF и PF (рис. 1A и 1B). Из дифференциально выраженных пятен 28 пятен были активизированы в сперматозоидах спермы GF, из которых 22 были успешно идентифицированы с помощью MALDI-TOF/TOF (таблица 1). Было обнаружено, что 26 пятен активируются в сперматозоидах спермы PF, а 22 были успешно идентифицированы как 18 уникальных белков (таблица 1). Наложение белков сперматозоидов самцов GF и PF показано на рис. 1C. На рис. 1D показаны трехмерные изображения и линейные диаграммы, представляющие относительную количественную оценку дифференциально распространенных белковых пятен между сперматозоидами самцов GF и PF.

Рис. 1.

Репрезентативная картина протеомов сперматозоидов с хорошей (A) и плохой (B) замораживаемостью спермы после анализа 2D-DIGE. C-наложение сперматозоидов хорошей (GF) и плохой (PF) спермы (Cy5 [красный] — сперматозоиды PF; Cy3 [зеленый] — сперматозоиды GF). Цифры обозначают пятна со значительно различающимся содержанием между сперматозоидами групп GF и PF (красные цифры указывают на белки, более распространенные в сперматозоидах PF, зеленые цифры указывают на большее количество белков в сперматозоидах спермы GF).(В) – 3-D (репрезентативные изображения) и линейные диаграммы (данные для шести самцов) выбранных пятен (пятно 11 – протеинкиназа С и субстрат казеинкиназы в нейронах белок 2 и пятно 45 – мейхроацидиноподобный спермоспецифический аксонемальный белок).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972.g001

Сравнение супернатантов после криоконсервации спермы хорошей и плохой замораживаемости

Анализ супернатанта после криоконсервации спермы GF и PF с использованием 2D-DIGE привел к обнаружению 1616 совпадающих пятен. Из них 19 были более распространены (p<0,05) в супернатанте спермы PF, чем в сперме GF (рис. 2A и 2B). Восемнадцать из этих пятен были успешно идентифицированы как 12 уникальных белков (таблица 2). Репрезентативное 2D-DIGE-изображение наложения супернатанта после криоконсервации спермы GF и PF показано на рис. 2.

Рис. 2. Репрезентативная картина супернатанта после криоконсервации хорошей (Cy3, зеленые точки) и плохой замораживаемости (Cy5, красные точки) спермы после анализа 2D-DIGE.

Цифры указывают на большее содержание белков в супернатанте после криоконсервации спермы с плохой способностью к замораживанию.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972.g002

Анализ путей изобретательности дифференциально распространенных белков

В общей сложности 22 и 18 белков, сверхэкспрессированных в сперматозоидах спермы GF и PF, соответственно, и 12 белков, присутствующих в большем количестве в супернатанте после криоконсервации спермы PF, были проанализированы с помощью IPA с точки зрения их канонического сигнального пути, молекулярной и клеточной функции, и функционируют сети. Сводка всех связанных путей и функций для дифференциально распространенных белков представлена ​​в таблице 3.Основными каноническими путями, связанными с белками с более высоким содержанием в сперме GF, были путь убиквитинирования белка, путь презентации антигена, клеточный окислительно-восстановительный гомеостаз, деградация D-маннозы и биосинтез L-карнитина, в то время как молекулярные и клеточные функции, включая метаболизм аминокислот, биохимия малых молекул , гибель и выживание клеток, морфология клеток, сборка и организация клеток.

IPA продемонстрировал пентозофосфатный путь и суперпуть деградации метионина как канонические пути, на которые больше всего влияют белки с более высоким содержанием в сперме PF.Эти белки были связаны с углеводным обменом, окислительно-восстановительным процессом, клеточным метаболизмом альдегидов и клеточным движением.

Белки, которые были обогащены в супернатанте после криоконсервации спермы PF, были вовлечены в путь стресса эндоплазматического ретикулума, процессинг и презентацию антигена, а также фолдинг белков. Молекулярные и клеточные функции этих белков были связаны с клеточным движением, реакцией на стресс эндоплазматического ретикулума, клеточной функцией и поддержанием, транспортом и переносом белков.

Сетевой анализ белок-белковых взаимодействий дифференциально распространенных белков из спермы с хорошей и плохой способностью к замораживанию

Мы провели сетевой анализ взаимодействия этих белков, обогащенных сперматозоидами спермы GF, с использованием STRING. Мы обнаружили, что из 22 белков 11 белков взаимодействуют друг с другом (22 ребра). Наиболее связанные белки (коэффициент кластеризации, 0,983; p-значение обогащения PPI, 4,33e-15) участвуют в протеасомном убиквитине, катаболическом процессе белка, а также в процессинге и презентации антигена (рис. 3A).Для 18 белков, обогащенных сперматозоидами PF, мы обнаружили 28 ребер (14 белков взаимодействовали друг с другом) с коэффициентом кластеризации 0,789 (значение p обогащения: 4,33e-16). Эти белки были вовлечены в процесс окислительного восстановления и процесс клеточного метаболизма альдегидов (рис. 3В).

Рис. 3. Сети белок-белковых взаимодействий белков сперматозоидов с разным содержанием в сперме с хорошей (GF) и плохой замораживаемостью (PF).

Различные кластеры взаимодействующих белков были идентифицированы с помощью программного обеспечения STRING с высокой степенью достоверности.(A) Белки спермы с более высоким содержанием в GF. (B) Белки спермы с более высоким содержанием в PF. (C) Белки, обогащенные супернатантом после криоконсервации PF. Размер линии указывает на высокую оценку взаимодействия (узкие линии указывают на высокую оценку > 0,9; тонкие линии указывают на среднюю оценку > 0,7). Белки, идентифицированные в сперматозоидах карпа самцов GF и PF и супернатанте после криоконсервации, представлены в Таблице 1 и Таблице 2 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972.g003

Кроме того, STRING-анализ белков, обогащенных в супернатанте после криоконсервации спермы PF, показал, что все 12 белков были связаны (19 ребер, коэффициент кластеризации 0,619, p-значение обогащения PPI 1,61). е-13). Наиболее связанные белки участвовали в фолдинге белков в эндоплазматическом ретикулуме, процессах углеводного обмена и ответе на стресс эндоплазматического ретикулума.

Валидация 2D-DIGE с помощью вестерн-блоттинга парвальбумина

Поликлональные антитела против парвальбумина карпа выявили четыре пятна (протеоформы) Pv (рис. 4А и 4В).Как и в случае с протеомными данными, увеличение (p ≤ 0,05) относительной численности пятна 53 (определяемой как отношение численности пятна к общей численности Pv) наблюдалось в сперматозоидах из спермы GF (относительная численность 0,104) по сравнению со сперматозоидами из PF. сперма (относительная численность 0,084; рис. 4C). Протеоформа Pv (пятно 53) соответствует пятну 53, идентифицированному как обогащенное спермой GF с помощью 2D-DIGE (рис. 1). Обилие остальных изоформ Pv и общее содержание Pv были одинаковыми в сперме GF и PF.На рис. 4 показана репрезентативная картина пятен белка Pv, полученная в результате вестерн-блоттинга.

Рис. 4. Проверка результатов 2D-DIGE с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к парвальбумину (Pv).

Репрезентативный вестерн-блоттинг сперматозоидов хорошей замораживаемости (GF) спермы (A) и плохой заморозки (PF) спермы (B). Белки разделяли методом 2DE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и инкубировали с антителами против Pv. Блоты сканировали с помощью системы VersaDoc MP 4000 (Bio-Rad, Hercules, CA).Пятна указывают на протеоформы Pv, обнаруженные с помощью анти-Pv антител в сперматозоидах GF и PF. Цифра 53 указывает изоформу Pv, содержание которой различается между спермой GF и PF, и соответствует точке 53 на рис. 6) количественно определяли с использованием программного обеспечения для анализа Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA). (C) Относительное содержание Pv было рассчитано как отношение количества пятен к общему содержанию Pv.Показанные данные являются средним значением ± SEM. Звездочками отмечены достоверные различия между сперматозоидами самцов карпа GF и PF (*p ≤ 0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972.g004

Обсуждение

Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором представлены дифференциально экспрессированные белки между сперматозоидами спермы рыб с хорошей и плохой замораживаемостью. Используя подход 2D-DIGE в сочетании с MALDI-TOF/TOF, сравнивая сперматозоиды спермы GF и PF, мы идентифицировали дифференциально экспрессируемые белки.IPA-анализ этих белков спермы выявил различные канонические пути для спермы GF и PF. Мы также идентифицировали 12 белков, обогащенных супернатантом после криоконсервации плохо замораживаемой спермы. Полученные результаты могут быть полезны для лучшего понимания механизма замерзания спермы рыб, особенно карпа.

Среди белков, обогащенных сперматозоидами с хорошей замораживаемостью, String анализ выявил множественные значимые взаимодействия между тремя α- и тремя β-субъединицами протеасомы 20S и блеомицином.Эти белки создают один главный кластер, функционально участвующий в протеасомном пути убиквитина. Протеасома 26S играет решающую роль в контроле митоза и мейоза и отвечает за деградацию белков и клеточное ремоделирование во время сперматогенеза [41]. Было показано, что у млекопитающих протеасомный комплекс 26S более распространен в зрелых сперматозоидах, чем в незрелых сперматозоидах [42], что указывает на его важную роль в подвижности сперматозоидов и событиях, связанных с оплодотворением [43]. Недавно протеасома 26S была идентифицирована как положительный маркер устойчивости сперматозоидов к замораживанию в семенной плазме барана [44].Blmh впервые идентифицирован в сперматозоидах рыб. Его функция у млекопитающих связана с презентацией антигена, полиубиквитинированием белков, антиоксидантной защитой, реакцией на токсические вещества и созреванием сперматозоидов [45]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что большее количество протеасом и Blmh в сперматозоидах GF может отражать статус полного созревания этих сперматозоидов, что приводит к большей устойчивости к криоповреждениям. Более низкое содержание этих белков в сперматозоидах ПФ может указывать на неполное созревание или явление старения.Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на анализе взаимосвязи между изменениями протеома и созреванием и старением сперматозоидов.

Белок

потенциалзависимых анионселективных каналов (VDAC) обогащен сперматозоидами GF. VDAC представляет собой порообразующий белок, который в сперматозоидах млекопитающих образует канальную структуру в липидном бислое, который обеспечивает транспорт ионов и малых молекул (Ca 2+ , Cl , HCO 3 , АТФ , глутамат) через наружную мембрану митохондрий и плазматическую мембрану [46, 47], а также участвует в поддержании жгутиковых структур зрелых сперматозоидов [48].Кроме того, сообщалось, что VDAC участвует в сперматогенезе, созревании сперматозоидов, капацитации, акросомной реакции, модуляции подвижности сперматозоидов [49, 50]. Вилагран и др. [24] определили VDAC2 как потенциальный положительный маркер способности к замораживанию спермы хряков, что согласуется с нашими выводами. Однако роль VDAC в сперматозоидах рыб остается неизвестной. Присутствие VDAC3 в более высоких количествах в сперматозоидах GF предполагает его участие в защите сперматозоидов от изменений текучести мембран за счет лучшей регуляции трансмембранного потока ионов во время событий холодового шока, например, при криоконсервации.

Среди белков, обогащенных спермой GF, мы идентифицировали ферменты, важные для защиты от окислительного стресса, включая две формы (Rho и Pi) глутатион-S-трансферазы (GST), 4-триметиламинобутиральдегиддегидрогеназу (ALDH9A1) и глутаредоксин. Ли и др. [51] предполагают, что криоконсервация спермы карпа вызывает окислительный стресс в сперматозоидах, что проявляется более высокими уровнями перекисного окисления липидов, окисления белков и активности глутатионпероксидазы. Таким образом, обогащение защитных внутриклеточных ферментов и ферментов плазматической мембраны в сперматозоидах GF было бы большим преимуществом, поскольку эти клетки подвергаются воздействию АФК, образующихся во время криостресса, и их функция может быть связана с лучшей защитой мембраны сперматозоидов и белков от окислительного повреждения. происходит при криоконсервации.

Сперматозоиды с хорошей способностью к замораживанию имели более высокое количество белков, участвующих в клеточном окислительно-восстановительном и энергетическом обмене, включая сукцинилтрансферазу дигидролиполлизинового остатка (DLST), глицерол-3-фосфатфосфатазу и маннозо-6-фосфатизомеразу. Эти два последних фермента ранее не были идентифицированы в сперматозоидах карпа и их функция в производстве энергии сперматозоидами. DLST является компонентом митохондриального комплекса 2-оксоглутаратдегидрогеназы. Недавно было обнаружено, что другой компонент этого комплекса (дигидролипоилдегидрогеназа) в высокой степени экспрессируется в сперме быков с высокой способностью к замораживанию [28].Взятые вместе, наши результаты показывают, что сперматозоиды GF метаболически превосходят и имеют преимущество в накоплении энергии (необходимой для подвижности сперматозоидов) по сравнению со сперматозоидами PF.

Парвальбумин, Ca 2+ -связывающий белок, присутствует в нескольких протеоформах в сперме карпа. Парвальбумин является основным белком сперматозоидов карпа, который появляется на заключительном этапе сперматогенеза [40]. Было обнаружено, что одна протеоформа парвальбумина положительно связана с криоконсервацией спермы карпа.Показана решающая роль специфических протеоформ парвальбумина в механизмах, контролирующих движение спермы карпа [39]. Поскольку Ca 2+ играет ключевую роль в подвижности сперматозоидов карпа [52], парвальбумин, обогащенный спермой GF, может участвовать в контроле градиента Ca 2+ во время подвижности сперматозоидов после криоконсервации. Это необходимое условие как для контроля преждевременной активации, так и для активации подвижности сперматозоидов. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что эффективный контроль градиента Ca 2+ и подвижности сперматозоидов благотворно влияет на криорезистентность сперматозоидов карпа.

Помимо обнаружения белков, положительно связанных с замораживаемостью, мы также обнаружили четыре белка, протеоформы которых были дифференциально (положительно или отрицательно) связаны с замораживаемостью спермы карпа. Мейхроацидиноподобный спермоспецифический аксонемный белок (MSAP) является структурным компонентом жгутиковой аксонемы карпа, экспрессируется во время позднего спермиогенеза и накапливается в зрелых сперматозоидах, локализуясь в базальном теле и жгутике сперматозоидов [53]. Функция MSAP связана со сборкой и дифференцировкой жгутиков во время спермиогенеза.Конкретные протеоформы MSAP могут вызывать небольшие различия в организации и стабилизации структуры жгутиков, что может влиять на устойчивость жгутиков сперматозоидов к стрессу криоконсервации.

Помимо MSAP, тремя другими белками, по-разному связанными с замораживанием спермы карпа, были такие ферменты, как: дипептидилпептидаза 3 (DPP3), протеиндисульфидизомераза A3-подобная (PDIA3) и аденозилгомоцистеиназа (AHCY). DPP3 и PDI являются частью системы контроля качества правильного фолдинга белков.PDI также действует как молекулярный шаперон, предотвращающий образование белковых агрегатов. AHCY участвует в энергетическом метаболическом пути, ведущем к выработке фосфокреатина, необходимого для подвижности сперматозоидов карпа. Таким образом, мы предполагаем, что возможность замораживания спермы карпа связана с правильным сворачиванием белка и обеспечением энергией. Механизм, с помощью которого генерируются эти множественные протеоформы, и то, как они способствуют замораживанию, остаются неизвестными.

Среди белков, связанных с плохой замораживаемостью спермы, мы обнаружили белки, функционально связанные с процессом метаболизма альдегидов и циклом трикарбоновых кислот.Кроме того, мы обнаружили белки, помогающие в организации цитоскелета. Следует особо подчеркнуть, что многие из этих белков (PASCIN2, PGD, TALDO1, TKT) и/или протеоформы были обнаружены в больших количествах в супернатанте после криоконсервации спермы PF. Это позволяет предположить наличие связи между наличием некоторых белков, обогащенных в свежих сперматозоидах ПФ, и их утечкой после криоконсервации. Точная причина этого явления неизвестна. Различный белковый состав сперматозоидов с хорошей и плохой замораживаемостью может быть результатом генетических различий и/или различий в сперматогенезе. Кроме того, мы предполагаем, что эти различия связаны с негативными изменениями свойств мембраны сперматозоидов, возможно, в результате предшествующей инфекции или воспаления спермы, о чем свидетельствует повышенный уровень белков острой фазы в семенной плазме при ПФ [37]. Сублетальное повреждение оболочки сперматозоидов может привести к более эффективному извлечению белков из свежих сперматозоидов ПФ и их утечке после криоконсервации.

Мы также идентифицировали белки, высвобождаемые в больших количествах из сперматозоидов после криоконсервации спермы ПФ, которые не обнаруживались в свежих сперматозоидах ПФ.Эти белки включали Ca 2+ -связывающие белки (EHD1, Calr), Ldhb, ядерные белки (Ran, EEF1G) и шапероны (HSPA5, Hyou1), участвующие в метаболизме, правильной укладке белков и реакции на стресс. Утечка Ca 2+ — связывающих белков и метаболических ферментов из спермы может быть частью механизма, ответственного за снижение подвижности сперматозоидов в группе PF после криоконсервации. Более того, как обсуждалось выше, большая утечка цитозольных ферментов предполагает, что криоконсервация значительно влияет на целостность плазмалеммы сперматозоидов PF, что приводит к увеличению утечки цитоплазматических белков.Нарушение целостности мембраны сперматозоидов подтверждалось наличием белков плазматической мембраны (Calr, EHD1, Pascin2), высвобождаемых в повышенном количестве в ПФ после криоконсервации. Струнный анализ выявил сильное взаимодействие между изученными белками, особенно HSPA5, PDIA3, CALR, GANAB и HYOU1, что свидетельствует о его функциональной связи с укладкой белка и реакцией на стресс.

Результаты этого исследования дополняют наш недавно опубликованный анализ протеома семенной плазмы и его связи с возможностью замораживания [37].Поскольку семенная плазма и сперматозоиды, использованные в этих экспериментах, были получены из одних и тех же образцов спермы, теперь доступен сравнительный анализ белковых изменений в обоих источниках. Результаты обоих исследований показывают, что белковая составляющая сперматозоидов и окружающих их сред (семенной плазмы) влияет на замораживаемость карпа. Наше предыдущее исследование показало, что PF связан с повышенным уровнем белка, который отражает инфекцию или воспаление репродуктивного тракта, что приводит к тонким изменениям в структуре спермы.GF связан с более высоким уровнем белков, участвующих в поддержании целостности мембран сперматозоидов и антиоксидантной защиты. Это согласуется с представленными здесь результатами, которые показывают, что сперматозоиды с GF демонстрируют улучшенное поддержание текучести мембран, антиоксидантную защиту, организацию жгутиков, подвижность сперматозоидов и выработку энергии. Однако следует подчеркнуть, что в этих функциях в семенной плазме и сперматозоидах участвуют разные белки. Например, Wap65, по-видимому, связан с антиоксидантной защитой в семенной плазме, в то время как глутатион-S-трансфераза (GST), 4-риметиламинобутиральдегиддегидрогеназа (ALDH9A1) и глутаредоксин в сперматозоидах.Таким образом, оказывается, что белки в семенной плазме и сперматозоидах влияют на способность к замораживанию спермы карпа посредством различных механизмов. В настоящее время неизвестно, какой из этих потенциальных источников биоиндикаторов лучше прогнозирует устойчивость сперматозоидов к длительному криоконсервированию.

В совокупности наши данные показывают, что вариабельность криорезистентности может быть связана с различиями в белковом составе сперматозоидов. Хорошая способность к замораживанию связана с более высокими концентрациями белков, участвующих в поддержании структуры жгутиков, текучести мембран, эффективном контроле Ca 2+ и подвижности сперматозоидов, выработке энергии и антиоксидантной защите, что отражает состояние полного созревания сперматозоидов GF.Напротив, PF, по-видимому, связан с неполным созреванием или старением спермы и присутствием белков, которые, как было показано, вытекают в больших количествах из криоконсервированных сперматозоидов спермы PF.

Кроме того, определенные протеоформы белков, связанные с правильным сворачиванием белков, обеспечением энергией и статусом метилирования, могут иметь решающее значение как для положительной, так и для отрицательной связи с успехом криоконсервации. Полученные результаты создадут платформу для будущих исследований, направленных на оценку функциональной значимости конкретных белков в криорезистентности.Такие исследования должны основываться на многопараметрической оценке характеристик спермы (кинетических, структурных, биохимических и функциональных) после криоконсервации [54, 55], чтобы различать сперму карпа хорошей и плохой замораживаемости и подтверждать полезность идентифицированных белков спермы в качестве потенциальных биомаркеров замораживаемости. . В настоящее время неизвестно, проявляет ли динамика протеомных изменений спермы, влияющих на ее замораживаемость, сезонность. Эта возможность должна быть изучена в будущих исследованиях.Результаты такого исследования улучшат наше понимание механизма замораживания спермы у рыб, особенно у карпа.

Вспомогательная информация

Таблица S3. Экспериментальная установка для мечения CyDye

TM шести супернатантов после криоконсервации хорошей спермы (супернатант GF 1–6) и шести супернатантов после криоконсервации плохо замораживаемой спермы (супернатант PF 1–6) с включением объединенного внутреннего стандарта .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192972.s003

(DOCX)

Благодарности

Данные протеомики масс-спектрометрии были переданы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE [56] с идентификатором набора данных PXD008187. Авторы очень благодарны Ильгизу Ирназарову из отдела ихтиобиологии и аквакультуры Польской академии наук в Голише за предоставление спермы карпа. Мы также благодарим Галину Кароль и Еву Лишевскую за их прекрасную техническую помощь.Эта работа была поддержана проектом 2011/01/D/NZ9/00628 Национального научного центра Польши и средствами, выделенными Институту репродукции животных и пищевых исследований. Стоимость обработки статьи была покрыта грантом Научного консорциума KNOW: «Здоровое животное — безопасный корм» (Министерство науки и высшего образования; декабрь: 05-1/KNOW2/2015).

Каталожные номера

  1. 1. Лаббе С., Марториати А., Дево А., Месс Г. Влияние криоконсервации спермы на стабильность ДНК спермы и развитие потомства радужной форели. Молекулярное воспроизводство и развитие 2001; 60: 397–404. пмид:11599051
  2. 2. Зилли Л., Скьявоне Р., Зонно В., Сторелли С., Вилелла С. Оценка повреждения ДНК в сперме Dicentrarchus labrax после криоконсервации. Криобиология 2003; 47: 227–235. пмид:14697734
  3. 3. Зилли Л., Скьявоне Р., Зонно В., Россано Р., Сторелли С., Вилелла С. Влияние криоконсервации на белки спермы морского окуня. Биология размножения 2005; 72: 1262–1267. пмид:15659707
  4. 4.Мартинес-Парамо С., Перес-Серезалес С., Гомес-Романо Ф., Бланко Г., Санчес Х.А., Эрраес М.П. Криобанкинг как инструмент сохранения биоразнообразия: влияние криоконсервации спермы кумжи на генетический потенциал самцов. Териогенология 2009; 71: 594–604. пмид:18976804
  5. 5. Мартинес-Парамо С., Диого П., Динис М.Т., Эрраес М.П., ​​Сараскете С., Кабрита Э. На способность к замораживанию спермы морского окуня влияют переменные подвижности и состав мембранных липидов, но не целостность мембраны и перекисное окисление липидов. Наука о репродукции животных 2012; 131: 211–218. пмид:22503480
  6. 6. Кабрита Э., Сараскете С., Мартинес-Парамо С., Роблес В., Бейрао Дж., Перес-Сересалес С. и др. Криоконсервация спермы рыб: применение и перспективы. Прикладная ихтиология 2010; 26: 623–635.
  7. 7. Yoon SJ, Rahman MS, Kwon WS, Ryu DY, Park YJ, Pang MG. Протеомная идентификация криостресса в эпидидимальных сперматозоидах. J Anim Sci Biotechnol. 2016 21 ноября; 7:67 вечера: 27895910
  8. 8.Гво Дж. К., Курокура Х., Хирано Р. Криоконсервация сперматозоидов радужной форели, обыкновенного карпа и морского фугу. Бюллетень Japan Social Science Fish 1993; 59: 777–782.
  9. 9. Линхарт О., Родина М., Коссон Дж. Криоконсервация спермы обыкновенного карпа Cyprinus carpio : Подвижность сперматозоидов и успешность вылупления эмбрионов. Криобиология 2000;41:241–250. пмид:11161556
  10. 10. Хорват А., Мишкольци Э., Урбани Б. Криоконсервация спермы обыкновенного карпа. Водные живые ресурсы 2003; 16: 457–460.
  11. 11. Варнеке Д., Плута Х.Дж. Подвижность и оплодотворяющая способность замороженной/размороженной спермы карпа ( Cyprinus carpio L.) с использованием диметилацетамида в качестве основного криопротектора. Аквакультура 2003; 215:167–185.
  12. 12. Хороховацкий Ю., Сэмпелс С., Коссон Дж., Линхарт О., Родина М., Федоров П. и др. Липидный состав спермы сазана ( Cyprinus carpio ), обладающей различной криорезистентностью. Криобиология 2016;73:282–5.пмид:27574978
  13. 13. Бабяк И., Глоговски Дж., Брзуска Э., Шумиец Дж., Адамек Дж. Криоконсервация спермы обыкновенного карпа, Cyprinus carpio L. Исследование аквакультуры 1997;28:567–571.
  14. 14. Рурангва Э., Киме Д.Е., Оллевье Ф., Нэш Дж.П. Измерения подвижности спермы и факторы, влияющие на качество спермы у культивируемых рыб. Аквакультура 2004; 234:1–28.
  15. 15. Джобим М.И.М., Оберст Э. Р., Сальбего К.Г., Соуза Д.О., Вальд В.Б., Трамонтина Ф. и др.Двумерный электрофорез белков семенной плазмы крупного рогатого скота в полиакриламидном геле и их связь с замораживаемостью спермы. Териогенология 2004; 61: 255–266. пмид:14662126
  16. 16. Жобим М.И., Трейн С., Цирклер Х., Грегори Р.М., Симе Х., Маттос Р.С. Двумерный электрофорез белков семенной плазмы лошадей в полиакриламидном геле и их связь с замораживаемостью спермы. Териогенология 2011;76:765–71. пмид:21601917
  17. 17. Рикард Дж. П., Лихи Т., Солейвоуп С., Цикис Г., Лабас В., Харишо Г., Линч Г.В., Друарт X, де Грааф С.П.Идентификация протеомных маркеров устойчивости сперматозоидов к замораживанию в семенной плазме баранов. Журнал протеомики 2015; 126: 303–311. пмид:26025878
  18. 18. Рикард Дж. П., Шмидт Р. Е., Мэддисон Дж. В., Батгейт Р., Линч Г. В., Друарт X, де Грааф С. П. Изменения в семенной плазме изменяют способность сперматозоидов барана выживать при криоконсервации. Воспроизводство, плодородие и развитие 2016;28:516–523.
  19. 19. Soleilhavoup C, Tsikis G, Labas V, Harichaux G, Kohnke PL, Dacheux JL, Guérin Y, Gatti JL, de Graaf SP, Druart X.Протеом семенной плазмы барана и его влияние на сохранение жидкости сперматозоидов. Журнал протеомики 2014; 109: 245–260. пмид:25053255
  20. 20. Йесте М. Обновление криоконсервации спермы: Криодеструкция, маркеры и факторы, влияющие на возможность замораживания спермы у свиней. Териогенология. 2016;85:47–64. пмид:26506124
  21. 21. Моура А.А., Мемили Э. Функциональные аспекты семенной плазмы и белков спермы и их потенциал в качестве молекулярных маркеров фертильности. Размножение животных.2016;13:191–199.
  22. 22. Касас И., Санчо С., Баллестер Дж., Бриз М., Пинар Э., Буссалеу Э. и др. Содержание спермы HSP90AA1 и прогноз способности эякулята хряка к замораживанию. Териогенология 2010;74:940–950. пмид:20580074
  23. 23. Вилагран И. , Кастильо Дж., Бонет С., Санчо С., Йесте М., Эстаньол Дж. М. и др. Связывающий акрозин белок (ACRBP) и триозофосфатизомераза (TPI) являются хорошими маркерами для прогнозирования способности к замораживанию спермы хряка. Териогенология 2013;80:443–450.пмид:23768753
  24. 24. Вилагран И., Йесте М., Санчо С., Касас И., дель Аламо ММР, Бонет С. Связь малого белка теплового шока 10 сперматозоидов и зависимого от напряжения анионного канала 2 с замораживаемостью спермы хряков. Териогенология 2014; 82: 418–426. пмид: 24933094
  25. 25. Ван П., Ван Ю.Ф., Ван Х., Ван К.В., Зан Л.С., Ху Д.Х., Ли К.В., Цзя Ю.Х., Го-Цзи Ма Г.Дж. Корреляция экспрессии HSP90 с устойчивостью к замораживанию спермы быков. Зигота. 2014;22:239–245. пмид:23506739
  26. 26.Валенсия Х., Гомес Г., Лопес В., Меса Х., Энао Ф.Х. Взаимосвязь между белками HSP90a, NPC2 и L-PGDS и способностью к замораживанию спермы хряка. J Animal Science and Biotechnology 2017; 8:21
  27. 27. Jiang XP, Wang SQ, Wang W, Xu Y, Xu Z, Tang JY и др. Энолаза-1 (ENO1) и глюкозо-6-фосфат-изомераза (GPI) являются хорошими маркерами для прогнозирования замораживания сперматозоидов человека. Криобиология. 2015;71:141–145. пмид:25
  28. 8
  29. 28. Rego JP, Martins JM, Wolf CA, van Tilburg M, Moreno F, Monteiro-Moreira AC, et al.Протеомный анализ семенной плазмы и сперматозоидов и их связь с замораживаемостью спермы быков Гузерата. J Anim Sci. 2016;94:5308–5320. пмид:28046165
  30. 29. Chen X, Zhu H, Hu C, Hao H, Zhang J, Li K, Zhao X, Qin T, Zhao K, Zhu H, Wang D. Идентификация дифференциально экспрессируемых белков в свежих и замороженных-оттаенных сперматозоидах хряка с помощью iTRAQ-связанного 2D ЖХ–МС/МС. Репродукция. 2014; 147:321–330. пмид:24357664
  31. 30. Богл О.А., Кумар К., Аттардо-Парринелло С., Льюис С.Э.М., Эстаньол Дж.М., Балеск Дж.Л., Олива Р.Выявление белковых изменений сперматозоидов человека в процессе криоконсервации. Андрология. 2017;5:10–22. пмид:27860400
  32. 31. Yoon SJ, Rahman MS, Kwon WS, Ryu DY, Park YJ, Pang MG. Протеомная идентификация криостресса в эпидидимальных сперматозоидах. J Anim Sci Biotechnol. 2016;21;7:67 пмид:27895910
  33. 32. Рикард Дж. П., Шмидт Р. Е., Мэддисон Дж. В., Батгейт Р., Линч Г. В., Друарт X, де Грааф С. П. Изменения в семенной плазме изменяют способность сперматозоидов барана выживать при криоконсервации.Воспроизводство, плодородие и развитие 2014;28:516–23.
  34. 33. Kime DE, Van Look KJ, McAllister BG, Huyskens G, Rurangwa E, Ollevier F. Компьютерный анализ спермы (CASA) как инструмент для мониторинга качества спермы у рыб. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2001; 130:425–33. пмид:11738630
  35. 34. Ланштайнер Ф. Криоконсервация спермы лососевых и северной щуки. Исследования аквакультуры. 2000; 31: 245–258.
  36. 35. Рурангва Э., Фолькерт Ф., Хайскенс Г., Киме Д.Е., Оллевье Ф.Контроль качества охлажденной и криоконсервированной спермы с использованием компьютерного анализа спермы (CASA), жизнеспособного окрашивания и стандартизированного оплодотворения африканских сомов ( Clarias gariepinus ). Териогенология. 2001; 55: 751–69. пмид:11245263
  37. 36. Дитрих Г.Дж., Дитрих М., Ковальски Р.К., Добош С., Кароль Х., Демьянович В., Глоговски Дж. Воздействие ртути и кадмия на молоки радужной форели изменяет параметры подвижности сперматозоидов и репродуктивный успех. Аква токсикол. 2010; 97: 277–84.пмид:20044150
  38. 37. Дитрих М.А., Ирназаров И., Церешко А. Протеомная идентификация белков семенной плазмы, связанных с замораживанием спермы карпа. Журнал протеомики 2017.
  39. 38. Копейка ЭФ. Инструкция по низкотемпературному консервированию спермы карпа. Всесоюзное научно-производственное общество по рыбоводству, Москва, 1986. С. 11.
  40. 39. Дитрих М.А., Дитрих Г.Дж., Мостек А., Церешко А. Подвижность сперматозоидов карпа связана с глубокими изменениями в протеоме сперматозоидов.Журнал протеомики 2016; 138: 124–135. пмид:26926441
  41. 40. Дитрих М.А., Нинка Дж., Билинска Б., Куба Дж., Котула-Балак М. , Кароль Х. и соавт. Идентификация парвальбуминоподобного белка как основного белка сперматозоидов карпа ( Cyprinus carpio L), который появляется на заключительной стадии сперматогенеза. Сравнительная биохимия и физиология B-биохимия и молекулярная биология. 2010; 157: 220–227.
  42. 41. Меккариелло Р., Кьянезе Р., Чиарамелла В., Фазано С., Пьерантони Р.Молекулярные шапероны, кошапероны и система убиквитинирования/деубиквитинирования: участие в производстве высококачественных сперматозоидов. Биомед Рез Инт. 2014;561426. пмид:25045686
  43. 42. Типлер С.П., Хатчон С.П., Хендил К., Танака К., Фишел С., Майер Р.Дж. Очистка и характеристика протеасом 26S из сперматозоидов человека и мыши. Молекулярная репродукция человека, 1997; 3:1053–1060. пмид:9464850
  44. 43. Сутовский П. Протеасома сперматозоидов и оплодотворение.Репродукция. 2011; 142:1–14. пмид:21606061
  45. 44. Рикард Дж. П., Шмидт Р. Е., Мэддисон Дж. В. , Батгейт Р., Линч Г. В., Друарт X и др. Изменения в семенной плазме изменяют способность сперматозоидов барана выживать при криоконсервации. Воспроизводство, плодородие и развитие 2016;28:516–523.
  46. 45. де Матео С., Кастильо Дж., Эстаньол Дж. М., Балеска Дж. Л., Олива Р. Протеомная характеристика ядра спермы человека. Протеомика 2011;11:2714–2726. пмид:21630459
  47. 46.Сэмпсон М.Дж., Декер В.К., Боде А.Л., Руитенбек В., Армстронг Д., Хикс М.Дж. и др. Неподвижные сперматозоиды и бесплодие у мышей, у которых отсутствует митохондриальный потенциалзависимый анионный канал типа 3. J. Biol. хим. 2001; 276:39206–39212. пмид:11507092
  48. 47. Шошан-Бармац В., Де Пинто В., Цвекштеттер М., Равив З., Кейнан Н., Арбель Н. VDAC, многофункциональный митохондриальный белок, регулирующий жизнь и смерть клеток. Мол. Аспекты Мед. 2010; 31: 227–285. пмид:20346371
  49. 48. Хинш К-Д, Де Пинто В., Айрес В.А., Шнайдер Х., Мессина А., Хинш Э.Потенциал-зависимые анионселективные каналы VDAC2 и VDAC3 представляют собой многочисленные белки в наружных плотных волокнах крупного рогатого скота, цитоскелетном компоненте жгутика сперматозоидов. Дж. Биол. хим. 2004; 279:15281–15288. пмид:14739283
  50. 49. Лю Б., Тан М., Хань З., Ли Дж., Чжан Дж., Лу П. и др. Совместная инкубация сперматозоидов человека с анти-VDAC-антителом снижала подвижность сперматозоидов. Cell Physiol Biochem. 2014; 33:142–50. пмид: 24481077
  51. 50. Квон В.С., Пак Ю.Дж., Мохамед эль-СА, Панг М.Г. Потенциал-зависимые анионные каналы являются ключевым фактором мужской фертильности.Фертил Стерил. 2013;99:354–61. пмид:23062735
  52. 51. Ли П., Хулак М., Коубек П., Сулк М., Дзюба Б., Борышполец С. и др. Выносливость к ледниковому периоду: влияние криоконсервации на белки спермы карпа обыкновенного, Cyprinus carpio L. Theriogenology 2010;74:413–423. пмид:20570330
  53. 52. Краснай З., Морисава М., Морисава С., Краснай З.Т., Трон Л., Гаспар Р. и др. Роль ионных каналов и мембранного потенциала в инициации подвижности сперматозоидов карпа. Водные живые ресурсы.2003; 16: 445–449.
  54. 53. Ю Т.К., Хуан Ф.Л. MSAP, гомолог мейхроацидина карпа ( Cyprinus carpio ), отличается от аналога грызунов по экспрессии зародышевой линии и включает жгутиковую дифференцировку. Биол Репрод. 2004;71:1419–29. пмид:15215198
  55. 54. Касас И., Санчо С., Бриз М., Пинар Э., Буссалеу Э., Йесте М. и др. Прогнозирование способности к замораживанию эякулятов хряков по функциональным параметрам спермы и белкам спермы. Териогенология 2009;72:930–948.пмид:19651432
  56. 55. Юн С.Дж., Квон В.С., Рахман М.С., Ли Д.С., Панг М.Г. Новый подход к идентификации физических маркеров криоповреждения сперматозоидов быков. ПЛОС Один. 2015 4;10(5):e0126232. пмид:25938413
  57. 56. Вискайно Дж. А., Чордас А., Дель-Торо Н., Дианес Дж. А., Грисс Дж., Лавидас И., Майер Г., Перес-Ривероль И., Райзингер Ф., Тернент Т., Сюй К.В., Ван Р., Хермякоб Х. (2016). 2016 обновление базы данных PRIDE и сопутствующих инструментов. Нуклеиновые кислоты Res 44 (D1): D447–D456. пмид: 26527722

Сравнительная протеомика выявила связь между белками SPANX и клиническими результатами искусственного оплодотворения донорской спермой Банк спермы человека

, выданный Национальной комиссией по здравоохранению и планированию семьи Китайской Народной Республики, как личная информация доноров спермы, так и реципиентов должна быть конфиденциальной, поэтому никакая информация, которая могла бы идентифицировать участников этой статьи, не может быть найдена.

Это исследование было проведено с одобрения и под контролем Комитета по этике Школы фундаментальных медицинских наук Центрального Южного университета (номер утверждения: LLSB-2017-002). Все образцы спермы, используемые для анализа 2D-DIGE и вестерн-блоттинга, были получены от каждого донора с информированным согласием, подписанным при их первой сдаче. Кроме того, для проспективного исследования следовые количества образцов спермы, собранных до лечения СПИДом, также были собраны с информированного согласия, подписанного парами-реципиентами, которое также содержало разрешение на сбор информации о случаях. Все эксперименты и процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике Школы базовых медицинских наук Центрального Южного университета и проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

Сбор образцов

Для протеомного анализа 20 образцов спермы из групп с низкой и высокой плодовитостью были случайным образом отобраны у здоровых доноров, зарегистрированных в Банке спермы человека в Репродуктивно-генетической больнице CITIC-Xiangya. Было подготовлено девять образцов спермы (по три образца были выбраны случайным образом из групп с низкой и высокой плодовитостью и три образца были выбраны случайным образом со средней клинической частотой наступления беременности) для вестерн-блоттинга результатов идентификации.Все собранные образцы спермы соответствовали требованиям пятого издания руководства Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Проспективное исследование

В это проспективное исследование с октября 2014 г. по март 2016 г. было включено 106 пар, получавших лечение СПИДа. а также реципиенты, получающие терапию для индукции овуляции. Критерии включения: реципиенты в возрасте до 35 лет, толщина эндометрия >8 мм, отсутствие неблагоприятного анамнеза беременности, хотя бы одна сторона маточной трубы гладкая.Вся донорская сперма, использованная для лечения, соответствовала требованиям «Основные стандарты и технические спецификации банка спермы человека» , образец спермы (50 мкл) был собран сразу после промывания, но до проведения лечения. Уровень экспрессии белков SPANX оценивали вестерн-блоттингом. Группа лечения была разделена на две подгруппы на основе значений экспрессии.

Выделение сперматозоидов и экстракция белков

Клетки сперматозоидов выделяли из спермы с использованием двухступенчатого перколлового градиента (Sigma-Aldrich, Cat.# F0119; 45% и 90%, разведенные в Ham’s F10, HyClone, Cat. № Ш40025.01) и центрифугированием при 600 g в течение 30 мин. Осадок сперматозоидов собирали и трижды промывали фосфатно-солевым буфером путем центрифугирования при 600 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Сперматозоиды объединяли, замораживали сразу после последнего центрифугирования и хранили в жидком азоте до использования. Как для процедур DIGE, так и для вестерн-блоттинга замороженные образцы оттаивали при 37 °C после центрифугирования при 600 g в течение 10 минут при 4 °C, а полученные супернатанты отбрасывали.Очищенные сперматозоиды солюбилизировали в лизирующем буфере на льду. Суспензию обрабатывали с помощью ультразвукового прибора. После ультразвуковой обработки образцы помещали на лед на 45–60 мин. После центрифугирования удаляли весь нерастворившийся материал. Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа Bradford (Bio-Rad, номер по каталогу 5000006), используя альбумин, разведенный в лизирующем буфере, в качестве эталонного стандарта. Супернатант хранили при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

Мечение белков с помощью CyDye DIGE Fluor

Процесс мечения образцов осуществлялся в соответствии с руководством пользователя Ettan DIGE.В общей сложности образец белка весом 50 мкг был помечен 400 пмоль Cy3 или Cy5. В эксперименте использовали внутренний эталонный стандарт, состоящий из двух смешанных образцов, помеченный Cy2. Реакцию мечения проводили на льду в течение 30 мин в темных условиях. Реакции гасили добавлением 10 мМ лизина и инкубировали в течение 10 минут на льду в темноте. Меченые образцы объединяли для последующих этапов эксперимента. Каждый образец дважды разделяли на отдельные гели, чтобы продемонстрировать воспроизводимость и надежность результатов настоящего исследования.

Разделение белков методом 2D-флуоресценции DIGE

2D-электрофорез проводили, как описано в предыдущем исследовании, с несколькими незначительными модификациями. Полоски с иммобилизованным градиентом pH (IPG) гидратировали в гидратационном буфере и инкубировали с мечеными образцами в темноте. Изоэлектрическую фокусировку первого измерения (ИЭФ) выполняли с использованием системы Ettan IPGphor System (GE Healthcare, Питтсбург, США) общей мощностью 60 кВ·ч при 20 °C, в частности, в пять этапов: 30 В в течение 12 ч, 120 В в течение 1 ч, 500 В в течение 1 ч, 1000 В в течение 1 ч и 8000 В в течение 7 ч. После IEF полоски IPG уравновешивали в уравновешивающем растворе, содержащем 1% вес./об. дитиотреитола (ДТТ) в течение 15 мин, а затем в том же растворе, содержащем 2,5% ИУК вместо ДТТ. Затем полоски подвергали 2D-электрофорезу после переноса на 12,5% полиакриламидные гели с додецилсульфатом натрия. Электрофорез проводили при 2,5 Вт на гель в течение 30 мин, затем при мощности 20 Вт на гель до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигал конца геля.

Сканирование изображений, меченных DIGE, и анализ изображений

Белковые пятна в аналитических гелях визуализировали с помощью окрашивания Кумасси бриллиантовым синим G-250.Меченые белки визуализировали с помощью имидж-сканера Typhoon 9410 (GE Amersham Biosciences, Питтсбург, США). Изображения Cy5/Cy3/Cy2 сканировали. Все гели сканировали с разрешением 100 мкм. Окрашенные гели сканировали с помощью UMax Powerlook 2110XL (UMax, Даллас, США), а анализ изображений проводили с помощью ImageMaster 2D Platinum версии 5.0 (GE Amersham Biosciences, Питтсбург, США). Изображения анализировали с использованием программного обеспечения для дифференциального анализа DeCyder (GE Amersham Biosciences, Питтсбург, США).Дифференциальный анализ в геле (DIA) применяли для расчета различий содержания белка между образцами на одном и том же геле. Полученные карты пятен были проанализированы с помощью анализа биологических вариаций, чтобы предоставить статистические данные о дифференциальной экспрессии белка, которая существовала между двумя группами. Соотношения Cy3/Cy2 и Cy5/Cy2 DIA использовали для расчета средних изменений содержания белка. Преимущество внутреннего эталонного стандарта заключалось в том, что он повышал уверенность исследователя в результатах, полученных с использованием различных гелей.

Точечный сбор и ферментативное расщепление

Отдельные препаративные гели использовали для получения достаточного количества белка для МС-анализа. Вкратце, кусочки геля сначала окрашивали и сушили в вакуумном насосе. Затем пятна обезвоживали, обрабатывали рабочим раствором трипсина и инкубировали в течение 15–18 часов. Собирали супернатанты и сушили в вакууме. Экстракцию проводили в следующие этапы. (1) Супернатанты растворяли в 50% ацетонитриле (ACN) и 0.5% трифторуксусной кислоты (ТФУ) на водяной бане при 37°С в течение 60 мин и обработке ультразвуком в течение 15 мин. (2) 75% ACN и 0,5% TFA были дополнительно добавлены в водяную баню при 37 ° C на 60 минут и обработаны ультразвуком в течение 15 минут. (3) 100% ACN и 0,5% TFA снова добавляли в водяную баню при 37 ° C на 60 минут и обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут.

Анализ MALDI

Профили пептидов анализировали с помощью ультрагибкого TOF/TOF (Bruker Daltonics, Массачусетс, США). Образцы были обессолены и сконцентрированы с использованием ZIP-TIPTM (Millipore, Perkin Elmer, UK), а затем смешаны с матричным раствором а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в пропорции 1:1.Смесь была помещена в AnchorChip (Bruker Daltonics, Массачусетс, США) для использования в будущем. Паттерн рефлекса автоматически контролировался программным обеспечением FlexControl. Программное обеспечение Mascot (Matrix Science Ltd, Лондон, Великобритания) использовалось для анализа пика PMF и LIFT MS. Программное обеспечение BioTools (Bruker Daltonics, Массачусетс, США) использовали для поиска и идентификации данных PMF и MS/MS с допустимым отклонением массы пептида 100 ppm. Идентификация белков была принята, когда наблюдаемые и предсказанные изоэлектрические точки и относительные молекулярные массы соответствовали друг другу, а оценки указывали на неслучайные идентификации при уровне значимости P < 0.05.

Вестерн-блоттинг

Белковые образцы и предварительно окрашенные белковые стандарты (Thermo Fisher, № по каталогу 26616) разделяли с помощью SDS-PAGE. Для электрофореза белков применяли обычные сборные полиакриламидные гели с градиентом 4–15% (Bio-Rad, № по каталогу 5678081). Готовые гели запускали в течение 45 мин при постоянном напряжении 200 В в рабочем буфере (25 мМ трис-основы, 192 мМ глицина, 1% SDS, pH 8,3, как рекомендовано производителем). По окончании электрофореза белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану (Millipore, Cat.# IPVH00010) с использованием ячейки для электрофореза Bio-Rad mini trans-blot при постоянном токе 200 мА в течение 60 мин. Процедуру электрофореза проводили при комнатной температуре, процедуру переноса мембран проводили на льду. Затем мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком (Thermo Fisher, № по каталогу LP0031B) в TBST (20 мМ трис, 150 мМ NaCl, содержащий 0,05 % твин-20, рН 7,4) при комнатной температуре в течение 2 ч, затем инкубировали с первичные антитела. Концентрация первичных антител была изменена в соответствии с описанием продукта, антитело к целевому белку представляло собой антитело к SPANX A/D (Santa Cruz, sc-162262, 1/500, разведенное в TBST), антитело к контрольному белку представляло собой антитело к β -Актин (Abcam, ab8227, 1/2000, разведенный в TBST).Первичные антитела инкубировали при 4°С в течение ночи (приблизительно 15 ч). Первичное антитело удаляли и трижды промывали в TBST по 5 мин. Вторичное антитело (козьи антикроличьи IgG H&L, Abcam, № по каталогу ab205718) разбавляли 1/2500 с помощью TBST, затем инкубировали с мембраной при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего мембрану промывали трижды по 5 минут, каждый раз с помощью TBST. Затем мембраны подвергали воздействию реагента хемилюминесценции с повышенной прозрачностью (ECL) (GE Healthcare, Cat # RPN2133) в темноте.Пленка (Carestream, кат. № 864 6770) экспонировалась в темноте в течение 2–3 мин при комнатной температуре, затем пленка проявлялась в течение 5 мин в проявляющем растворе (Carestream, кат. № 526 9055) и фиксировалась в течение 25 с. мин в растворе фиксажа (Carestream, № по каталогу 886 8804) и трижды промывали фильтрованной водой, сухую пленку сканировали и анализировали. Уровень экспрессии был представлен соотношением значений серого целевого белка и β-актина.

Статистические методы

Соотношения Cy3/Cy2 и Cy5/Cy2 DIA, уровни экспрессии белков SPANX в группах с низкой и высокой плодовитостью и в нормальной группе были статистически проанализированы с помощью парного t-критерия. Уровни экспрессии белков SPANX в проспективном исследовании были сгруппированы методом прямой кластеризации, и для оценки классификации был использован t-критерий независимого образца. Тест хи-квадрат был использован для анализа корреляции между экспрессией белка SPANX и клинической беременностью AID.

Биоинформатический анализ

Генно-онтологический анализ был выполнен с помощью FunRich 3.0 (инструмент анализа функционального обогащения, http://www.funrich.org/).

Границы | Обонятельные рецепторы в сперме и мужском тракте: от протеома к белкам

Введение

Белки обонятельных рецепторов (OR) представляют собой рецепторы, связанные с G-белком, которые представляют самое большое семейство генов в геноме человека.Геном кодирует около 1000 OR (1). ОР экспрессируются в назальных обонятельных сенсорных нейронах, которые участвуют в путях передачи сигнала. Передача сигнала приводит к стимуляции мембранной аденилатциклазы III и как минимум к увеличению внутриклеточных концентраций Ca 2+ и Na + . Эти события вызывают деполяризацию мембраны (2). OR также участвуют в хемотаксисе и цитокинезе, оказывая регуляторную роль на цитоскелет (3).

Некоторые из этих рецепторов экспрессируются в необонятельных тканях, включая клетки миокарда и эритроидных клеток (4, 5), ганглии вегетативной нервной системы (6), селезенку (7), толстую кишку (8), предстательную железу (9), а также в семенниках (10).

Физиологическая функция тестикулярных ОР обсуждалась, но до сих пор остается неизвестной.

По оценкам, количество тестикулярных OR у млекопитающих колеблется от 20 до 66. Было идентифицировано 20 генов OR млекопитающих, фактически имеющих преобладающую экспрессию в мужской зародышевой линии (11), особенно на поздних стадиях сперматогенеза.Группа Парментье, используя анализы защиты от РНКазы, сообщила, что в семенниках млекопитающих экспрессируется в общей сложности 50 рецепторов (12). Сходное количество OR впоследствии было подтверждено в семенниках мышей с использованием подхода с использованием высокопроизводительного олигонуклеотидного микрочипа, обнаружившего 66 генов, обогащенных OR (13). Специфические OR были локализованы в средней части и основании жгутика зрелых сперматозоидов (14, 15).

Специфический тестикулярный OR, hOR17-4, был идентифицирован с помощью ОТ-ПЦР в биоптатах ткани яичка человека (16).Его поверхностная экспрессия впоследствии была подтверждена на зрелых сперматозоидах с помощью протеомного анализа с использованием технологии многомерной идентификации белков (14).

Специфический профиль экспрессии различных ORs в канальцах семенников, а также их функция до сих пор не ясны. Сообщалось о предыдущих данных, предполагающих роль hOR17-4 и mOR23 в хемиотаксисе сперматозоидов. В 2003 г. Шпер и соавт. продемонстрировали, что hOR17-4 может представлять собой механизм, с помощью которого сперматозоиды обнаруживают хемотаксические стимулы и переводят эту информацию в стереотипные паттерны движения (16).

Помимо хемотаксической роли hOR17-4 и mOR23, другие тестикулярные OR могут участвовать в сперматогенезе, созревании придатка яичка и функции сперматозоидов.

В предыдущем исследовании мы впервые опробовали протеомный подход к изучению семенной плазмы у фертильных мужчин (17).

В этом контексте идентификация семенного репертуара OR представляет собой интересную область исследования репродукции. Целью настоящего исследования было применение протеомного подхода, основанного на масс-спектрометрии (МС) высокого разрешения, для определения репертуара семенных ОР и проверки экспрессии вновь идентифицированных ОР в сперматозоидах, тестикулярной и эпидидимальной ткани.

Материалы и методы

Протокол одобрен Этическим комитетом Fondazione Policlinico «A. Джемелли», Рим (Италия). Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Люди

В этом исследовании приняли участие восемь фертильных мужчин, чьи партнерши были беременны на момент начала исследования. Ни у кого не было проблем с фертильностью. Все женщины-партнеры забеременели в течение 3 месяцев до начала исследования.

Критерии исключения из исследования: мужчины моложе 20 и старше 55 лет, заболевания яичек, наличие варикоцеле и/или инфекций половых путей.

Субъекты дали информированное согласие в соответствии с рекомендациями Хельсинкской декларации.

Гормональное исследование

Образец крови был взят в 08:00 для определения уровня ЛГ, ФСГ, тестостерона (Т), эстрадиола (Е2), дигидротестостерона (ДГТ), глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), и пролактина (ПРЛ).ЛГ, ФСГ и ГСПГ определяли иммунорадиометрическими методами на твердой фазе с использованием метода моноклональных двойных антител. Т, Е2 и ПРЛ анализировали в двух повторностях методом РИА с использованием коммерческих наборов (Radim). DHT анализировали с помощью RIA с использованием коммерческого набора (Chematil).

Анализ спермы и расщепление в растворе

пробы спермы были получены у всех испытуемых через 3 дня полового воздержания. Объем, рН, концентрация сперматозоидов, подвижность и нормальная морфология определялись в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (2010 г. ) по анализу спермы после разжижения при комнатной температуре.

Протеомный анализ

Разжиженные образцы спермы центрифугировали при 9200 g в течение 20 минут для получения семенной плазмы и обеспечения полного удаления клеточных компонентов. После центрифугирования проверяли аликвоту, чтобы убедиться в отсутствии сперматозоидов. Семенную плазму разделяли на аликвоты по 0,5 мл, которые немедленно замораживали при -80°С до проведения МС-анализа (в течение 1 мес).

Аликвоту каждой семенной плазмы, соответствующую 1 мг общего белка (согласно анализу Бредфорда), подвергали расщеплению в растворе, как описано ранее (17).Для протеомного анализа образцы ресуспендировали в водной трифторуксусной кислоте [TFA/H 2 O 0,2% (об./об.)] и анализировали равное количество белка (5 мкг) в каждом образце. Анализы ВЭЖХ-МС выполняли с помощью аппарата Nano/Micro-HPLC (Ultimate 3000, Dionex), соединенного с гибридным масс-спектрометром LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher). Образцы ресуспендировали в водном растворе трифторуксусной кислоты (TFA/H 2 O 0,2 % по объему) и анализировали равное количество белка (5 мкг) на колонке C18 (диаметр частиц 3 мкм; внутренний диаметр 1 мм × 10 см). ; Supelco Discovery Bio Wide Pore), используя TFA/H 2 O (0.056%, об./об.) и ТФУ (0,05%, об./об.) в растворе ацетонитрил/вода (80:20, об./об.) в качестве элюентов А и В соответственно. Линейный градиент проводили от 0 до 50% растворителя Б в течение 60 мин при скорости потока 80 мкл/мин. Спектры МС и МС/МС высокого разрешения были записаны в режиме сканирования, зависящего от данных, где каждые три МС спектрометр выполнял одно полное масс-спектрометрическое сканирование (разрешающая способность 60 000) и три сканирования МС/МС для выбранных наиболее интенсивных многозарядных ионов. , фрагментированный диссоциацией, вызванной столкновением (35% нормированной энергии столкновения).

Анализ данных

Анализ ВЭЖХ-МС и МС-МС проводили одновременно.

Данные МС были обработаны с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer (версия 1.3 Thermo Fisher Scientific) на основе базы данных белков UniProtKb/Swiss-Prot (выпуск 2017_02: Homo sapiens ). Параметры настройки были следующие: фермент трипсин с тремя пропущенными расщеплениями, карбамидометилирование цистеинов в виде фиксированной модификации и окисление метионинов, фосфорилирование треонинов, тирозинов и серинов в качестве вариабельной модификации.

Для получения надежной идентификации пептидов использовались следующие жесткие фильтры: коэффициент ложного обнаружения 1%, почти два пептида на белок.

Для определения репертуара ОР, вовлеченных в семенную плазму, мы рассмотрели список всех идентифицированных ОР среди объединенных данных идентифицированных белков в образцах.

Количественное определение белков без метки выполнялось с помощью узла Precursor Ions Area Detector Node во время биоинформатического анализа с использованием программного обеспечения Proteome Discoverer. Этот метод количественного определения использовали для получения представления об относительных количествах всех пептидов в образце. Приложение Proteome Discoverer вычисляет площади пептидов во время обработки, используя их для автоматического расчета площадей белков для белков в отчете. Он вычисляет площадь любого заданного белка как среднее значение трех наиболее распространенных различных пептидов, идентифицированных в белке. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Вестерн-блот

Вестерн-блот-анализ семенной плазмы был проведен при обработке образцов восстанавливающим буфером Лэммли (31.5 мМ Трис-HCl рН 6,8, 1% ДСН, 10% глицерина, 0,005% бромфенолового синего с 355 мМ 2-меркаптоэтанола) и кипятили при 95°С в течение 5 мин. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF от Millipore (Милан, Италия). Используемые первичные антитела: кроличьи поликлональные анти-OR4S1, анти-OR1I1 и анти-OR4C13 антитела (Abcam 1:500), мышиные моноклональные анти-актин (Sigma). Мембраны были разработаны с использованием усиленной хемилюминесценции (ECL Amersham) с помощью системы визуализации хемилюминесценции Alliance 2.7 (UVITEC Cambridge) и количественный анализ с помощью программного обеспечения Alliance V_1607.

Образцы яичка и эпидидима

Фиксированные формалином и залитые в парафин ткани яичка и придатка, принадлежащие пяти пациентам, перенесшим операцию по кастрации по поводу рака полового члена с эрозией мошонки (средний возраст 37 лет) в университетской больнице «Policlinico Universitario A. Gemelli» с 2004 по 2011 год, были проанализированы на оценить тестикулярную экспрессию OR4S1, OR4C13 и OR1I1. Обследование не выявило инвазии яичка раком полового члена.

Кроме того, были проанализированы фиксированные формалином и залитые парафином тестикулярные ткани, взятые из биоптатов яичек пяти пациентов с скрытой азооспермией и задержкой созревания сперматоцитов. Ретроспективно оценивали гормональные уровни ЛГ, ФСГ, Т, Е2, ДГТ, ГСПГ и ПРЛ.

Срезы биопсии яичка, обнаружившие «синдром только клеток Сертоли», использовали в качестве отрицательного контроля.

Анализ конфокальной микроскопии сперматозоидов, яичка и придатка яичка

Сперматозоиды

помещали на покровные стекла и фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем пермеабилизировали в 0.1 М фосфатно-солевой буфер (PBS) с 1% Triton X-100 в течение 20 мин при комнатной температуре.

Срезы ткани яичка и придатка яичка фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 20 мин при комнатной температуре и заливали в парафин. Срезы депарафинизировали, подвергали антиген-ретривированию и затем блокировали 5% БСА в течение 1 ч.

Предметные стекла инкубировали с антителами анти-OR4S1, анти-OR1I1 и анти-OR4C13 (Abcam 1:100) в течение ночи при 4°C. Отрицательные контроли получали путем инкубации предметного стекла только со вторичным антителом.После трех промывок в PBS их инкубировали с конъюгированным с FITC вторичным антителом. Кроме того, сперматозоиды инкубировали в течение ночи с конъюгатом Lectin-PNA Alexa Fluor 594-Conjugate для окрашивания акросом (Invitrogen, 1:100). Изображения были получены с помощью системы конфокального лазерного сканирования (TCS-SP2, Leica Microsystems), оснащенной Ar/ArKr-лазером для возбуждения 488 нм и гелий-неоновым лазером для возбуждения 543 нм. Ядра контрастировали DAPI или TOPRO3.

Результаты

В исследуемой популяции восьми фертильных субъектов измерение гормональных показателей выявило уровни в пределах нормы, как указано ниже (среднее значение ± стандартное отклонение): ЛГ 4.2 ± 2,8 мМЕ/мл; ФСГ, 3,9 ± 1,5 мМЕ/мл, T 4,95 ± 1,2 нг/мл; E2 28,1 ± 8,9 пг/мл; ДГТ 0,33 ± 0,1 нг/мл; ГСПГ 35,8 ± 6,3 нмоль/л и ПРЛ 11,2 ± 3,7 нг/мл.

Параметры семенной жидкости находились в пределах референсных значений ВОЗ (2010 г.) следующим образом (среднее значение ± стандартное отклонение): объем 3,5 ± 1,5 мл; рН 7,4 ± 0,6; количество сперматозоидов 67 ± 33 млн/мл; подвижность сперматозоидов 57,4 ± 10,4%; нормальная морфология 17,2 ± 7,3%.

Восемь различных OR были идентифицированы в семенной плазме с помощью протеомного анализа с использованием критериев фильтрации и анализа слияния, как указано в таблице 1.Для каждого белка мы сообщали следующую информацию: UniProt, название гена, молекулярную массу, изоэлектрическую точку и описание. Количественные протеомные данные, сообщающие о среднем содержании белка (× 10 6 ) ± стандартное отклонение для идентифицированных OR, представлены на рисунке S1 в дополнительном материале.

Таблица 1 . Идентифицированы обонятельные рецепторы (ОР) в семенной плазме с помощью протеомики.

Вестерн-блоттинг

подтвердил экспрессию OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в семенной плазме (рис. 1).

Рисунок 1 . Вестерн-блот анализ уровней белков OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в семенной плазме фертильных лиц.

Чтобы подтвердить, является ли экспрессия этих OR также общей для сперматозоидов, мы исследовали с помощью иммунофлуоресценции экспрессию OR OR4S1, OR4C13 и OR1I1 на сперматозоидах. OR4S1, OR4C13 и OR1I1 были обнаружены на поверхности сперматозоидов, включая акросому, среднюю часть и жгутик (рис. 2).

Рисунок 2 .Репрезентативные изображения экспрессии белка OR4S1 (A) , OR1I1 (B) и OR4C13 (C) (зеленый) с помощью конфокального анализа в сперматозоидах. Ядра контрастировали DAPI, а акросомы — лектин-ПНК (красный). Масштабная линейка 10 мкм.

Конфокальный анализ срезов яичка показал, что экспрессия OR4S1 и OR1I1 в основном локализована в сперматоцитах и ​​сперматидах, но не в сперматогониях, локализованных на базальной канальцевой мембране. Иммунореактивность OR4C13 присутствовала во всех канальцах, начиная с незрелых зародышевых клеток (сперматогонии, сперматоциты) и заканчивая более дифференцированными клетками (сперматидами) (рис. 3).

Рисунок 3 . Конфокальный анализ экспрессии белков OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в ткани яичка. Ядра контрастировали DAPI (масштабная линейка 25 мкм). На рисунке представлены репрезентативные панели, показывающие сперматогонии, сперматоциты и сперматиды при большом увеличении.

Кроме того, мы исследовали образцы, полученные от пациентов со скрытой азооспермией и задержкой созревания сперматоцитов. В этой популяции бесплодных пациентов гормональные значения были зарегистрированы следующим образом (среднее значение ± стандартное отклонение): ЛГ 4.2 ± 3,6 мМЕ/мл; ФСГ 7,9 ± 3,2 мМЕ/мл; Т 4,6 ± 1,5 нг/мл; E2 27,2 ± 5,4 пг/мл; ДГТ 0,21 ± 0,2 нг/мл; ГСПГ 35,7 ± 5,8 нмоль/л, ПРЛ 11,5 ± 3,4 нг/мл.

Статистический анализ подтвердил, что пациенты с азооспермией и остановкой созревания сперматоцитов имели более высокий FHS по сравнению с фертильными субъектами (7,9 ± 3,2 против 3,9 ± 1,5 мМЕ/мл, p < 0,05), как и ожидалось.

У этих пациентов с азооспермией мы наблюдали снижение экспрессии OR4S1 и OR1I1 в сперматогониях и сперматоцитах, тогда как в сперматогониях была обнаружена слабая положительная реакция на OR4C13 (рис. 4).

Рисунок 4 . (A) Репрезентативные изображения (H&E) нормальной или патологической ткани яичка (остановка созревания сперматоцитов), масштабная линейка 200 мкм. (B) Конфокальный анализ экспрессии белков OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в ткани яичка у пациентов с секреторной азооспермией и обнаружением задержки созревания сперматоцитов. Ядра контрастировали DAPI (масштабная линейка 25 мкм). На рисунке представлены репрезентативные панели, показывающие сперматогонии и сперматоциты при большом увеличении.

Наконец, мы наблюдали интенсивное и диффузное окрашивание OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в псевдомногослойном столбчатом эпителии придатка яичка (рис. 5).

Рисунок 5 . Конфокальный анализ экспрессии OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в псевдомногослойном столбчатом эпителии придатка яичка. Ядра контрастировали с TOPRO. Масштабная линейка 25 мкм.

Обсуждение

Идентификация семенного репертуара OR представляет собой интересную область в исследованиях репродукции. Тем не менее, исчерпывающий каталог ОР человека в мужских половых путях все еще отсутствует.

Мы разработали новый подход к комплексной идентификации ОР человека in vivo (плазма семенной жидкости), применяя метод масс-спектрометра высокого разрешения, подтверждая результаты, полученные с помощью этой процедуры, с помощью вестерн-блоттинга.

В семенной плазме мы впервые с помощью протеомного подхода определили наличие восьми новых различных OR. Насколько нам известно, это первая широкая идентификация репертуара растворимых ОР в семенной плазме.Вестерн-блот подтвердил протеомные данные по образцам семенной плазмы и подтвердил экспрессию OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в семенной плазме.

Чтобы подтвердить, является ли экспрессия этих OR также общей для сперматозоидов, мы исследовали с помощью иммунофлуоресценции экспрессию OR OR4S1, OR4C13 и OR1I1 на сперматозоидах. OR4S1, OR4C13 и OR1I1 были обнаружены на поверхности спермиев, преимущественно в акросоме, средней части и жгутике. Кроме того, другой тип рецептора OR, ранее изученный Spehr et al., OR17-4, имеет схему локализации, сходную с OR4S1, OR4C13 и OR1I1. Предыдущие исследования показали, что OR17-4 участвует в активации подвижности и хемиотаксисе (14, 16). В последние годы стало ясно, что сперматозоиды млекопитающих должны направляться, чтобы достичь ооцита (18). Несколько исследований показали, что механизмом управления сперматозоидами млекопитающих является хемиотаксис (19). Для объяснения хемиотаксиса сперматозоидов были предложены различные механизмы, включая взаимодействие между одорантами и ОР как у людей, так и у животных (20).Оттавиано и др. подтвердили важную роль OR17-4 в активности сперматозоидов и предполагаемое участие в идиопатическом бесплодии (21, 22). Подобно OR17-4, функция OR4S1, OR4C13 и OR1I1 может быть связана с реакцией акросом и активацией подвижности жгутиков в сперматозоидах. Кроме того, функциональные характеристики могут дать ключ к пониманию роли OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в хемиотаксисе сперматозоидов.

Чтобы установить тестикулярное происхождение идентифицированных OR и выяснить, зависит ли экспрессия OR от стадии развития семенных канальцев, мы провели конфокальный анализ срезов яичка.Специфическую локализацию ОР в разных клеточных компартментах канальцев следует использовать в качестве маркера для различных клеточных популяций в семявыносящих канальцах.

Основной функцией OR белков является обоняние в хемосенсорном органе. В то же время литературные данные предполагают дополнительные функции ОР, а именно участие в хемотаксисе сперматозоидов. Один из важных вопросов, требующих решения, касается того, какой из сотен ORs, кодируемых семенниками, участвует в хемотаксисе сперматозоидов, т.к. такая специфическая функция вряд ли будет опосредована всем репертуаром OR.Предыдущие исследования показали, что в этой функции участвуют два гена OR, hOR17-4 (16) и mOR23 (15). Однако эти гены экспрессируются на низком уровне в семенниках. Наоборот, др. гены OR высоко экспрессируются в семенниках, но пока не задействованы в хемотаксисе (23).

Протеомные платформы помогли нам изучить репертуар OR в семенной плазме, предоставив спектр семенных белков OR. В данном исследовании подход «от протеома к белку» позволил нам проверить экспрессию трех новых ОР в сперматозоидах и изучить другой паттерн экспрессии в канальцах яичка.Мы наблюдали различную тубулярную локализацию для трех исследованных нами ОР. Поэтому мы предположили, что, помимо хемотаксической роли сперматозоидов, ОР могут играть специфическую роль в созревании сперматозоидов и миграции из базальной мембраны в просвет.

Нехемотаксическая роль OR была предложена в литературе во многих других тканях, в основном на основании простого присутствия транскриптов OR. Это включает межклеточное распознавание (24) и химическое обнаружение экзогенных или эндогенных лигандов (25).

Кроме того, мы можем предположить, что снижение экспрессии трех ORs у пациентов с азооспермией и остановкой созревания сперматоцитов может представлять собой причину остановки или может быть следствием различий в гормональных (ФСГ) или генетических путях. Снижение экспрессии исследуемых ОР у этих пациентов, хотя и нуждается в подтверждении дальнейшими исследованиями, может представлять собой маркер, который необходимо оценить при остановке созревания сперматоцитов.

Наконец, мы наблюдали интенсивное и диффузное окрашивание OR4S1, OR4C13 и OR1I1 в псевдомногослойном столбчатом эпителии придатка яичка, что указывает на их роль в миграции сперматозоидов.

В 1993 г. Vanderhaeghen et al. идентифицировали экспрессию обонятельных транскриптов в придатках яичка собак. В настоящем исследовании мы сообщаем о первой идентификации экспрессии ORs в придатках яичка человека (26). Дальнейшие исследования должны помочь лучше понять физиологию ОР в придатке яичка.

Это первая идентификация с помощью протеомного подхода широкого репертуара OR в семенной плазме. Используя подход «белок-мишень», мы также продемонстрировали присутствие OR4S1, OR1I1 и OR4C13 в сперме и в протоках яичка и придатка яичка.Присутствие этих рецепторов на зрелых клетках может быть связано с активностью акросом и подвижностью сперматозоидов, в то время как их присутствие в канальцах яичка и в придатках яичка может свидетельствовать о специфической роли этих рецепторов в регуляции созревания и миграции сперматозоидов.

В заключение, несмотря на ограничения этого исследования (выполненного на относительно небольшой выборке и основанного исключительно на описательных данных, не подкрепленных функциональным анализом для идентифицированных OR), это первое применение протеомики на основе МС с высоким разрешением в оценка множества ОР в семенной плазме и описание их экспрессии в сперме, семенниках и придатках яичка.

Заявление об этике

Протокол одобрен Этическим комитетом Fondazione Policlinico «A. Джемелли. Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Вклад авторов

DM разработал исследование и написал рукопись; CC выполнил вестерн-блоттинг и анализ конфокальной микроскопии; GG проанализировал данные и написал статью; FV выполнила протеомный анализ семенной жидкости; FP провел анализ конфокальной микроскопии; FM провел протеомный и вестерн-блот анализ; SB выполнил анализ спермы и критически пересмотрел работу для существенного вклада; MC, RM и AP критически пересмотрели работу, сделав существенный вклад.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Клаудию Менальдино (Нью-Йорк, США) и Эстер Махони (Кардифф, Великобритания) за любезное и тщательное редактирование на английском языке.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2017.00379/full#supplementary-material.

Рисунок S1 . Обилие белка в идентифицированных OR (×10 6 ).

Рисунок S2 . Ряд данных вестерн-блоттинга.

Ссылки

4. Друтель Г., Арранг Дж. М., Диаз Дж., Вишневски С., Шварц К., Шварц Дж. К. Клонирование OL1, предполагаемого обонятельного рецептора, и его экспрессия в развивающемся сердце крысы. Receptors Channels (1995) 3(1):33–40.

Реферат PubMed | Академия Google

5. Feingold EA, Penny LA, Nienhuis AW, Forget BG. Ген обонятельного рецептора расположен в расширенном кластере генов бета-глобина человека и экспрессируется в эритроидных клетках. Genomics (1999) 61(1):15–23. doi:10.1006/geno.1999.5935

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

7. Blache P, Gros L, Salazar G, Bataille D. Клонирование и распределение в тканях нового крысиного обонятельного рецептора (OL2). Biochem Biophys Res Commun (1998) 242(3):669–72. doi:10.1006/bbrc.1997.8041

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

8. Юань Т.Т., Той П., Макклари Дж.А., Лин Р.Дж., Миямото Н.Г., Кречмер П.Дж. Клонирование и генетическая характеристика эволюционно законсервированного обонятельного рецептора человека, который по-разному экспрессируется у разных видов. Ген (2001) 278:1–2. дои: 10.1016/S0378-1119(01)00709-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

9.Neuhaus EM, Zhang W, Gelis L, Deng Y, Noldus J, Hatt H. Активация обонятельного рецептора подавляет пролиферацию клеток рака предстательной железы. J Biol Chem (2009) 284(24):16218–25. дои: 10.1074/jbc.M109.012096

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

10. Parmentier M, Libert F, Schurmans S, Schiffmann S, Lefort A, Eggerickx D, et al. Экспрессия членов предполагаемого семейства генов обонятельных рецепторов в зародышевых клетках млекопитающих. Nature (1992) 355 (6359): 453–5.дои: 10.1038/355453a0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

11. Vanderhaeghen P, Schurmans S, Vassart G, Parmentier M. Молекулярное клонирование и хромосомное картирование генов обонятельных рецепторов, экспрессируемых в мужской зародышевой линии: свидетельство их широкого распространения в геноме человека. Biochem Biophys Res Commun (1997) 237(2):283–7. doi:10.1006/bbrc.1997.7043

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

12. Вандерхаген П., Шурманс С., Вассар Г., Перментье М.Специфический репертуар генов обонятельных рецепторов в мужских половых клетках нескольких видов млекопитающих. Genomics (1997) 39(3):239–46. doi:10.1006/geno.1996.4490

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

13. Zhang X, Rogers M, Tian H, Zhang X, Zou DJ, Liu J и другие. Высокопроизводительный микрочип для обнаружения экспрессии генов обонятельных рецепторов у мышей. Proc Natl Acad Sci U S A (2004) 101(39):14168–73. doi:10.1073/pnas.0405350101

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

14.Spehr M, Schwane K, Riffell JA, Barbour J, Zimmer RK, Neuhaus EM, et al. Аденилатциклаза в виде частиц играет ключевую роль в хемотаксисе, опосредованном обонятельными рецепторами сперматозоидов человека. J Biol Chem (2004) 279(38):40194–203. дои: 10.1074/jbc.M4030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

15. Фукуда Н., Йомогида К., Окабе М., Тоухара К. Функциональная характеристика обонятельного рецептора яичка мыши и его роль в химическом восприятии и регуляции подвижности сперматозоидов. J Cell Sci (2004) 117(24):5835–45. дои: 10.1242/jcs.01507

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

16. Spehr M, Gisselmann G, Poplawski A, Riffell JA, Wetzel CH, Zimmer RK, et al. Идентификация тестикулярного рецептора запаха, опосредующего хемотаксис сперматозоидов человека. Наука (2003) 299(5615):2054–8. doi:10.1126/наука.1080376

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

17. Миларди Д., Гранде Г., Винченцони Ф., Мессана И., Понтекорви А., Де Маринис Л. и соавт.Протеомный подход к выявлению паттерна фертильности в семенной плазме фертильных мужчин. Fertil Steril (2012) 97(1):67–73. doi:10.1016/j.fertnstert.2011.10.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

18. Zuccarello D, Ferlin A, Garrolla A, Menegazzo M, Perilli L, Ambrosini G, et al. Как сперматозоиды человека ощущают ооцит: новая роль передачи сигналов SDF1-CXCR4. Int J Androl (2011) 34 (6Pt2): e554–65. дои: 10.1111/j.1365-2605.2011.01158.х

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

20. Spehr M, Schwane K, Riffell JA, Zimmer RK, Hatt H. Одорантные рецепторы и обонятельные сигнальные механизмы в сперме млекопитающих. Mol Cell Endocrinol (2006) 250(1–2):128–36. doi:10.1016/j.mce.2005.12.035

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

21. Оттавиано Г., Мариони Г., Фрассон Г., Зуккарелло Д., Марчезе-Рагона Р., Стафьери К. и соавт. Обонятельный порог буржуазного и полового влечения у молодых взрослых мужчин. Med Hypotheses (2015) 84 (5): 437–41. doi:10.1016/j.mehy.2015.01.035

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

22. Оттавиано Г., Зуккарелло Д., Фрассон Г., Скарпа Б., Нарделло Э., Фореста С. и др. Обонятельная чувствительность и половое влечение у молодых взрослых и пожилых мужчин: вводное исследование. Am J Rhinol Allergy (2013) 27(3):157–61. doi:10.2500/ajra.2013.27.3879

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

24.Дрейер В.Дж. Пересмотренная гипотеза кода области: обонятельные рецепторы и другие родственные трансмембранные рецепторы могут функционировать как последние цифры в коде клеточной поверхности для сборки эмбрионов. Proc Natl Acad Sci U S A (1998) 95(16):9072–7. doi:10.1073/pnas.95.16.9072

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

26. Vanderhaeghen P, Schurmans S, Vassart G, Parmentier M. Обонятельные рецепторы отображаются на зрелых сперматозоидах собак. J Cell Biol (1993) 123 (6 Pt 1): 1441–52.дои: 10.1083/jcb.123.6.1441

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аллергия на сперму: причина бесплодия?

У меня часто возникает ощущение жжения во влагалище после эякуляции моего партнера. Мой лечащий врач предположил, что у меня может быть аллергия на сперму. Влияет ли аллергия на сперму на возможность забеременеть?

Ответ от Чандры С. Шеной, доктора медицины

Аллергия на сперму, также называемая гиперчувствительностью к семенной плазме, возникает, когда у вас возникает вредная реакция иммунной системы на белки в сперме.Это состояние не является распространенным. Аллергия на сперму не является прямой причиной бесплодия.

Симптомы аллергии на сперму включают изменение цвета кожи, жжение и отек в местах контакта спермы с кожей или тканями влагалища. У некоторых людей может быть реакция всего тела, включая крапивницу, зуд и затрудненное дыхание.

Если у вас есть какие-либо из этих симптомов, обратитесь к врачу. Ваш врач может провести кожные пробы, чтобы определить, есть ли у вас аллергия на сперму.

Лечение, снижающее чувствительность к сперме вашего партнера, может позволить вам забеременеть естественным путем.Другим вариантом является внутриматочная инсеминация (ВМИ), при которой для предотвращения реакции используется сперма, очищенная от белков спермы. Для тех, у кого сильная чувствительность к сперме, вспомогательные репродуктивные технологии, такие как экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ИКСИ), могут быть вариантом для беременности.

С

Чандра С. Шеной, доктор медицины

  • Вторичное бесплодие
  • Полезен ли домашний анализ спермы?
февр.19, 2022 Показать ссылки
  1. Bernstein DI, et al. Аллергические реакции на семенную плазму. https://www.uptodate.com/contents/search. По состоянию на 20 января 2022 г.
  2. Lavery WJ, et al. Обзор гиперчувствительности семенной плазмы и подход к лечению. Журнал аллергии и клинической иммунологии: на практике. 2020; doi:10.1016/j.jaip.2020.04.067.
Посмотреть больше ответов экспертов

Продукты и услуги

  1. Книга: Руководство клиники Майо по фертильности и зачатию

.

Дифференциальный белковый профиль в сперме крупного рогатого скота, разделенной по полу: исследование протеомики дробовика

Приготовление разделенной по полу спермы основано на дифференциальном содержании ДНК между сперматозоидами, несущими X- и Y-хромосому, определяемом с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Несмотря на присущие ему ограничения, это единственный эффективный метод. Однако использование разделенной по полу спермы для разведения животных, производящих продукты питания, в больших масштабах требует дополнительных знаний о белковом репертуаре для разработки улучшенных методов дифференцировки X- и Y-сперматозоидов, сохраняющих высокую жизнеспособность.Чтобы решить эту проблему, мы провели сравнительное протеомное исследование дробовика с помощью nUPLC-MS/MS, чтобы охарактеризовать сперму крупного рогатого скота с разделением по полу. Белковые профили этих двух типов сперматозоидов показали дифференциальную экспрессию белков, которые могут быть непосредственно связаны с основными компонентами цитоскелетных структур жгутика, такими как аксонема, наружные плотные волокна и фиброзная оболочка, а также гликолитические ферменты и кальмодулин, участвует в регуляции энергетического обмена. В целом эти результаты могут послужить основой для лучшего понимания биологических особенностей сперматозоидов и могут быть полезны для разработки альтернативных методов разделения.

Эта статья находится в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Семен берет под контроль женские гены

Согласно исследованию, опубликованному сегодня в Proceedings of the Royal Society B, секс может вызвать замечательные женские реакции, включая изменение фертильности, иммунитета, либидо, режима питания и сна, путем активации различных наборов генов.

Исследователи из Университета Восточной Англии изучили, как самки Drosophila melanogaster, или плодовых мушек, реагируют на спаривание.

Они обнаружили, что один белок, обнаруженный в сперме, вызывает у самок широкий спектр ответов многих генов, которые проявляются в разное время и в разных частях тела самки после спаривания. Полученные данные в принципе могут быть аналогичны реакциям многих животных, включая людей.

Ведущий исследователь, профессор Трейси Чепмен из Школы биологических наук UEA, сказала: «Уже известно, что белки семенной жидкости, перенесенные от самцов во время спаривания, вызывают заметные эффекты у самок, включая изменение яйцекладки, питания, иммунитета, режима сна, водного баланса и сексуальная восприимчивость.

«Мы протестировали здесь действие одного загадочного белка семенной жидкости, известного как «половой пептид», и обнаружили, что он изменяет экспрессию замечательного набора многих генов у женщин — как во времени, так и в разных частях тела.

«Были значительные изменения в генах, связанных с развитием яйца, ранним эмбриогенезом, иммунитетом, восприятием питательных веществ, поведением и, неожиданно, фототрансдукцией — или путями, по которым они видят.

«Это показало, что белок спермы является «главным регулятором», что в конечном итоге означает, что самцы эффективно имеют прямое и глобальное влияние на поведение и репродуктивную систему самки.Такие эффекты вполне могут проявляться у многих видов.

«Дополнительный и интригующий поворот заключается в том, что эффекты белков спермы могут благоприятствовать интересам мужчин, в то же время вызывая затраты у женщин, что приводит к сексуальным конфликтам.

«Например, может быть перетягивание каната, когда самцы используют белки спермы, чтобы гарантировать, что самки сделают большие инвестиции в текущий выводок, даже если это не соответствует долгосрочным интересам самок».

Эволюция генов семеногелина гоминоидов, основных белков эякулированной спермы

  • МДж Андерсон АФ Диксон (2002) ArticleTitleПодвижность и средний отдел приматов. Природа 416 496 Вхождение Ручка10.1038/416496а Вхождение Ручка11932733

    Артикул пабмед Google ученый

  • ЮАР Асделл (1964) Закономерности размножения млекопитающих.Комсток Итака, Нью-Йорк

    Google ученый

  • . де Ламиранд К Ёсида М Йошиике Т Ивамото С Ганьон (2001) СтатьяЗаголовокСеменогелин, основной белок сгустка спермы, ингибирует капацитацию сперматозоидов, препятствуя образованию супероксидного аниона во время этого процесса. Дж Андрол 22 672–679 Вхождение Ручка11451365

    ПабМед Google ученый

  • Д.А. Дьюсбери (1988) СтатьяЗаголовокИспытание роли копулятивных пробок в конкуренции сперматозоидов у мышей-оленей ( Peromyscus maniculatus ). J Млекопитающее 69 854–857

    Google ученый

  • АФ Диксон (1998а) Сексуальность приматов: сравнительные исследования полуобезьян, обезьян, человекообразных обезьян и людей. Издательство Оксфордского университета Оксфорд

    Google ученый

  • АФ Диксон (1998б) СтатьяЗаголовокПоловой отбор и эволюция семенных пузырьков у приматов. Фолиа Приматол 69 300–306

    Google ученый

  • АФ Диксон МДж Андерсон (2002) СтатьяЗаголовокПоловой отбор, коагуляция семенной жидкости и образование копулятивной пробки у приматов. Фолиа Приматол 73 63–69 Вхождение Ручка10.1159/000064784 Вхождение Ручка12207054

    Артикул пабмед Google ученый

  • дрочка Дуббинк NS Веркаик PW Фабер Дж Ловец ФХ Шредер Джей Си Ромджин (1996) СтатьяЗаголовокТканеспецифическая и регулируемая андрогенами экспрессия простатспецифической трансглютаминазы человека. Биохим J 315 901–908 Вхождение Ручка8645175

    ПабМед Google ученый

  • Дж Фельзенштейн (1993) PHYLIP (пакет филогенетического вывода) версии 3.5в. Вашингтонский университет Сиэтл

    Google ученый

  • Дж Фрейн л зал (1998) СтатьяЗаголовокГен поверхностного белка сперматозоидов человека tMDC I нефункционален: последствия его предполагаемой роли в распознавании сперматозоидов млекопитающих. Биохим J 334 171–176 Вхождение Ручка9693117

    ПабМед Google ученый

  • Дж Фрейн ЕАС Димси JA Жюри л зал (1999) ArticleTitleТранскрипты, кодирующие поверхностный белок сперматозоидов tMDC II, не функционируют у человека. Биохим J 341 771–775 Вхождение Ручка10.1042/0264-6021:3410771 Вхождение Ручка10417343

    Артикул пабмед Google ученый

  • Дж Гудолл (1986) Шимпанзе из Гомбе: Модели поведения.Белкнап Пресс Гарвард, Кембридж, Массачусетс

    Google ученый

  • АХ Харкорт РН Харви СГ Ларсон фургон короткий (1981) СтатьяЗаголовок Масса яичек, масса тела и система размножения приматов. Природа 293 55–57 Вхождение Дескриптор1:STN:280:Bi6B2s%2FnsFE%3D Вхождение Ручка7266658

    КАС пабмед Google ученый

  • РН Харви АХ Харкорт (1984) Конкуренция сперматозоидов, размер семенников и системы размножения у приматов.РЛ Смит (ред.) Конкуренция сперматозоидов и эволюция систем спаривания животных. Академическая пресса Орландо, Флорида

    Google ученый

  • р Айвелл Вт Пуш М Балверс М Валентин Н Вальтер грамм Вайнбауэр (2000) СтатьяЗаголовокПрогрессирующая инактивация гаплоидного экспрессированного гена спермоспецифического эндозепиноподобного пептида (ELP) в ходе эволюции приматов. Джин 255 335–345 Вхождение Ручка11024294

    ПабМед Google ученый

  • JA Жюри Дж Фрейн л зал (1997) СтатьяЗаголовокЧеловеческий ген фертилина α нефункционален: значение его предполагаемой роли в оплодотворении. Биохим J 321 577–581 Вхождение Ручка

  • 39

    ПабМед Google ученый

  • JA Жюри Дж Фрейн л зал (1998) СтатьяЗаголовокАнализ последовательности различных генов фертилина α приматов: данные о нефункциональных генах у гориллы и человека. Мол Репрод Дев 51 92–97 Вхождение Ручка10.1002/(SICI)1098-2795(199809)51:1<92::AID-MRD11>3.0.CO;2-W Вхождение Ручка9712322

    Артикул пабмед Google ученый

  • ЧАС Койстинен Т Сойни Дж Лейнонен С Хайден-Гранског Дж Сало М Халттунен ЭМ-М-М Стенман М Сеппала р Койстинен (2002) СтатьяЗаголовокМоноклональные антитела, иммунофлюорометрический анализ и обнаружение человеческого семеногелина в мужских половых путях, отсутствие связи со способностью сперматозоидов к оплодотворению in vitro. Биол Репрод 66 624–628

    Google ученый

  • С Кумар К Тамура IB Якобсен М Ней (2001) СтатьяЗаголовокMEGA2: Программное обеспечение для молекулярно-эволюционного генетического анализа. Биоинформатика 17: 1244–1245 гг. Вхождение Ручка10.1093/биоинформатика/17.12.1244

    Артикул Google ученый

  • Ш-В Ли (1993) СтатьяЗаголовокНепредвзятая оценка показателей синонимичных и несинонимичных замен. Дж Мол Эвол 36 96–99 Вхождение Ручка1: CAS: 528: DyaK3sXnsVCmsA%3D%3D Вхождение Ручка8433381

    КАС пабмед Google ученый

  • ЧАС Лиля Дж Олдбринг грамм Ранневик ЦБ Лорелл (1987) СтатьяЗаголовокБелки, секретируемые семенными пузырьками, и их реакции при гелеобразовании и разжижении спермы человека. Дж Клин Инвест 80 281–285 Вхождение Ручка3611349

    ПабМед Google ученый

  • ЧАС Лиля Пенсильвания Абрахамссон А Лундволл (1989) СтатьяЗаголовокСеменогелин, преобладающий белок в сперме человека: первичная структура и идентификация близкородственных белков в мужских добавочных половых железах и сперматозоидах. Дж Биохим 264 1894–1900 гг.

    Google ученый

  • ЧАС Лиля А Лундволл (1992) СтатьяЗаголовокМолекулярное клонирование эпидидимальных и семенных везикулярных транскриптов, кодирующих белок, родственный семеногелину. Proc Natl Acad Sci США 89 4559–4563 Вхождение Ручка1584792

    ПабМед Google ученый

  • HJ Лин CW Луо Г-Ч Чен (2002) СтатьяЗаголовокЛокализация сайта перекрестного связывания трансглютаминазы в SVS III, новом гликопротеине, секретируемом из семенных пузырьков мыши. J Биол Хим 277 3632–3639 Вхождение Ручка10.1074/jbc.M107578200 Вхождение Ручка11723121

    Артикул пабмед Google ученый

  • А Лундволл С Лазурь (1995) ArticleTitleНовое семейство генов, кодирующих белки с сильно отличающейся структурой из-за быстро развивающегося экзона. FEBS Письмо 374 53–56 Вхождение Ручка10.1016/0014-5793(95)01076-Q Вхождение Ручка7589511

    Артикул пабмед Google ученый

  • А Лундволл (1996а) СтатьяЗаголовокКлонирование быстро развивающегося транскрибируемого семенными пузырьками гена, кодирующего основной сгусткообразующий белок спермы мышей. Евро J Биохим 235 424–430

    Google ученый

  • А Лундволл (1996б) СтатьяЗаголовокСтруктура локуса семеногелина: нуклеотидная последовательность межгенной и фланкирующей ДНК. Евро J Биохим 235 466–470

    Google ученый

  • А Лундволл АЙМ Олссон (2001) СтатьяЗаголовокГен семеногелина II заменен укороченным повтором LINE1 у тамарина хлопчатобумажного. Биол Репрод 65 420–425 Вхождение Ручка11466209

    ПабМед Google ученый

  • А Лундволл А Питер Дж Ловгрен ЧАС Лиля Дж Мальм (1997) СтатьяЗаголовокХимическая характеристика преобладающих белков, секретируемых семенными пузырьками мышей. Евро J Биохим 249 39–44 Вхождение Ручка9363751

    ПабМед Google ученый

  • А Лундволл А Бьяртелл АУ Олссон Дж Мальм (2002) СтатьяЗаголовокСеменогелин I и II, преобладающие белки семенной плазмы человека, также экспрессируются в негенитальных тканях. Моль Гум Репродукт 8 805–810 Вхождение Ручка 10.1093/моль час/8.9.805 Вхождение Ручка12200457

    Артикул пабмед Google ученый

  • младший Маккиннон КС Маккиннон (1984) Территориальность, моногамия и песня у гиббонов и долгопятов.ЧАС Преушофт диджей Чиверс ВГ Брокельман Н Крил (ред.) Меньшие обезьяны: эволюционная и поведенческая биология. Издательство Эдинбургского университета Эдинбург

    Google ученый

  • Дж Мальм Дж Хеллман ЧАС Магнуссон ЦБ Лорелл ЧАС Лиля (1996) СтатьяЗаголовокВыделение и характеристика основных гелевых белков спермы человека, семеногелина I и семеногелина II. Евро J Биохим 238 48–53 Вхождение Ручка8665951

    ПабМед Google ученый

  • А Мандал АК Бхаттачарья (1995) СтатьяЗаголовок Активация гиалуронидазы спермы очищенными преобладающими и основными белками семенного сгустка человека. Репродукция гула 10 1745–1750 гг. Вхождение Ручка8582973

    ПабМед Google ученый

  • Дж Мартан бакалавр Шепард (1976) СтатьяЗаголовокРоль копулятивных пробок в репродукции морской свинки. J Exp Zool 196 79–83 Вхождение Дескриптор1:STN:280:CSmB3Mnks1w%3D Вхождение Ручка932657

    КАС пабмед Google ученый

  • DE Мартин КГ Гулд (1977) Половой тракт самца обезьяны и его выделения.CE Грэм (ред.) Репродуктивная биология человекообразных обезьян: сравнительный и биомедицинский взгляды. Академическая пресса Нью-Йорк

    Google ученый

  • Д Мортимер (1993) Практическая лаборатория андрологии.Издательство Оксфордского университета Нью-Йорк

    Google ученый

  • А Питер ЧАС Лиля А Лундволл Дж Мальм (1998) СтатьяЗаголовокСеменогелин I и семеногелин II, основные гелеобразующие белки спермы человека, являются субстратами для трансглутаминазы. Евро J Биохим 252 216–221 Вхождение Ручка10.1046/j.1432-1327.1998.2520216.x

    Артикул Google ученый

  • Г.А. Паркер (1984) Конкуренция сперматозоидов и эволюция стратегий спаривания животных.РЛ Смит (ред.) Конкуренция сперматозоидов и эволюция систем спаривания животных. Академическая пресса Орландо, Флорида

    Google ученый

  • мм Роббинс (1995) СтатьяЗаголовокДемографический анализ истории жизни самцов и социальной структуры горных горилл. Поведение 132 21–48 Вхождение Ручка1:STN:280:BiuC2M3hvFA%3D Вхождение Ручка6703540

    КАС пабмед Google ученый

  • М Роберт С Ганьон (1999) СтатьяЗаголовокСеменогелин I: образующий сгусток многофункциональный белок семенных пузырьков. Cell Mol Life Sci 55 944–960 Вхождение Ручка10.1007/s000180050346 Вхождение Ручка10412373

    Артикул пабмед Google ученый

  • М Роберт БФ Гиббс Е Джейкобсон С Ганьон (1997) Статья Название Характеристика протеолитической активности пролат-специфического антигена в отношении основного физиологического вещества, предшественника ингибитора подвижности сперматозоидов / семеногелина I. Биохимия 36 3811–3819 Вхождение Ручка10.1021/bi9626158

    Артикул Google ученый

  • PS Родман Джей Си Митани (1987) Орангутанги: Половой диморфизм у одиночного вида.ББ Смэтс DL Чейни РМ Зайфарт RW Рэнгем ТТ Штрузакер (ред.) Общества приматов.Издательство Чикагского университета Чикаго 146–154

    Google ученый

  • я Сато М Йошиике Т Ямасаки К Ёсида С Такано Т Мукаи Т Ивамото (2001) СтатьяЗаголовокДот-блот-иммуноанализ для идентификации спермы с использованием поликлональных антител против семеногелина, мощного семенного маркера. Судебно-медицинская экспертиза, международный 15 27–24 Вхождение Ручка10.1016/S0379-0738(01)00435-2

    Артикул Google ученый

  • В Лето U Райхард (2000) Переосмысление моногамии: дело о гиббонах.ВЕЧЕРА Каппелер (ред.) Самцы приматов: причины и последствия изменчивости группового состава. Издательство Кембриджского университета Кембридж

    Google ученый

  • WJ Суонсон ВД Вакье (2002) СтатьяЗаголовокБыстрая эволюция репродуктивных белков. Нат Рев Жене 3 137–144 Вхождение Ручка10.1038/nrg733 Вхождение Ручка1: CAS: 528: DC% 2BD38XhsV2ntLY% 3D Вхождение Ручка11836507

    Артикул КАС пабмед Google ученый

  • Д Такахата ЧАС Ихобе грамм Идани (1996) Сравнение совокуплений шимпанзе и бонобо: проявляют ли самки восприимчивость или восприимчивость?Туалет Макгрю НЧ Маршан Т Нисида (ред.) Общества великих обезьян. Издательство Кембриджского университета Кембридж 146–155

    Google ученый

  • ПФ Таубер Д Подпорка ГФБ Шумахер LJD Заневельд (1980) СтатьяЗаголовокБиохимические аспекты коагуляции и разжижения спермы человека. Дж Андрол 1 280–288

    Google ученый

  • Джей Ди Томпсон ГД Хиггинс ТиДжей Гибсон (1994) ArticleTitleCLUSTAL W: Повышение чувствительности прогрессивного множественного выравнивания последовательностей за счет взвешивания последовательностей, штрафов за пробелы для конкретных позиций и выбора матрицы весов. Рез. нуклеиновых кислот 22 4673–4680 Вхождение Ручка7984417

    ПабМед Google ученый

  • ПР Тинклпо (1930) ArticleTitleПоявление вагинальной пробки у шимпанзе. Анат Рек 46 329–332

    Google ученый

  • ГД Торгерсон РЖ Кулатинал РС Сингх (2002) СтатьяЗаголовок Белки сперматозоидов млекопитающих быстро эволюционируют: свидетельство положительного отбора в функционально разнообразных генах. Мол Биол Эвол 19 1973–1980 гг. Вхождение Ручка12411606

    ПабМед Google ученый

  • М Ульвсбак А Лундволл (1997) СтатьяЗаголовокКлонирование гена семеногелина II макаки-резуса: дупликации 360 п.н. расширяют кодирующую область у человека, макаки-резуса и бабуина. Евро J Биохим 245 25–31 Вхождение Ручка

    20

    ПабМед Google ученый

  • КП ван Шайк ДЖАРАМ ван Хофф (1996) К пониманию социальной системы орангутанга.Туалет Макгрю НЧ Маршан Т Нисида (ред.) Общества великих обезьян. Издательство Кембриджского университета Кембридж 3–15

    Google ученый

  • р Восс (1979) СтатьяЗаголовокМужские добавочные железы и эволюция копулятивных пробок у грызунов. Occas Pap Mus Zool Univ Mich 689 1–27

    Google ученый

  • ДП Вт (1990) СтатьяЗаголовокЭкология горилл и ее связь с переносом самок у горных горилл. Int J Приматол 11 21–45

    Google ученый

  • ГД Вайкофф Вт Ван C-I Ву (2000) СтатьяЗаголовокБыстрая эволюция мужских репродуктивных генов у потомков человека. Природа 403 304–309 Вхождение Ручка10.1038/35002070 Вхождение Ручка10659848

    Артикул пабмед Google ученый

  • Z Ян (1998) СтатьяЗаголовок Тесты отношения правдоподобия для обнаружения положительного отбора и применения к эволюции лизоцима приматов. Мол Биол Эвол 15 568–573 Вхождение Ручка9580986

    ПабМед Google ученый

  • АО Заленский п Яу ДжВ Бренеман ЭМ Брэдбери (1993) ArticleTitleОбильный белок массой 19 килодальтон, связанный с ядрами сперматозоидов человека, который связан с α-ингибинами семенной плазмы. Мол Репрод Дев 36 164–173 Вхождение Ручка8257566

    ПабМед Google ученый

  • .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.