Дыхание икры черноморского калкана (Scophthalmus maeoticus) как показатель ее развития

Author:

Ханайченко, А.Н.

Светличный, Л.С.

Гирагосов, В.Е.

Губарева, Е.С.

Khanaychenko, Antonina N.

Svetlichny, Leonid S.

Giragosov, Vitaly E.

Hubareva, Elena S.

Journal Name:

Журнал Сибирского федерального университета. Биология. Journal of Siberian Federal University. Biology;2017 10 (1)

Abstract:

Исследовано дыхание черноморского калкана (Scophthalmus maeoticus) в течение раннего онтогенеза в зависимости от стадии, наличия морфологических аномалий развития и температуры (11 и 16 °С). Скорость потребления кислорода была наименьшей на стадии бластулы и незначимо варьировала от 0,0057 до 0,0061 мкг О2 экз-1ч-1 между икрой разных серий и при разных температурах. При нормальном морфологическом развитии аэробный метаболизм возрастает от бластулы до стадии подвижного эмбриона в 22 раза, равняясь (0,1348±0,0205) мкг О2 экз-1ч-1 при 16 °C и только в 13 раз при 11 °C. Температурный коэффициент Q10 составил в среднем 2,6 для аэробного метаболизма калкана в течение эмбриогенеза. Аэробный метаболизм на стадии гаструлы оказался вдвое ниже у икры, для которой на более поздних стадиях, начиная с образования хвостовой почки, обнаруживали аномалии развития, не совместимые с развитием до жизнеспособной личинки, по сравнению с нормально развивавшейся икрой

 

Rate of oxygen consumption of the Black Sea turbot (Scophthalmus maeoticus) during early ontogenesis depending on stage of development, morphological norm and temperature (11 and 16 °C) was studied. Oxygen consumption at blastula stage was the lowest, varied between 0.0057 and 0.0061 mg O2 ind-1 h-1 and was independent among egg batches in studied temperature range. Aerobic metabolism increased 22 times at 16 °C, reaching 0.1348±0.0205 mg O2 ind-1 h-1, and only 13 times at 11 °C from blastula to active embryo stage. Temperature interval 5 °С gave a mean Q10 of 2.6 for the rate of oxygen consumption of the Black Sea turbot during embryogenesis. Aerobic metabolism appeared twice lower at gastrula stage in embryos with morphological defects revealed from tail bud stage onwards incompatible with the development to a viable larvae, than that in normally developing embryos

 

Лактатдегидрогеназа

ЛДГ (L-лактат-НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) – цинксодержащий фермент, обратимо катализирует окисление лактата в пируват. ЛДГ является тетрамером, содержит субьединицы М и Н. В цитоплазме клеток и сыворотке крови ЛДГ представлена 5 изоферментами, обозначаемыми в соответствии с их подвижностью к аноду в электрическом поле: ЛДГ-1 (НННН), ЛДГ-2 (НННМ), ЛДГ-3 (ННММ), ЛДГ-4 (НМММ) и ЛДГ-5 (ММММ). ЛДГ представлена практически во всех органах и тканях организма, при этом распределение изоферментов ЛДГ органоспецифично. ЛДГ-4 и ЛДГ-5 преобладают в печени и скелетных мышцах, тканях с преимущественно анаэробным метаболизмом, ЛДГ-1 и ЛДГ-2 – эритроцитах, лейкоцитах, миокарде, почках – тканях с аэробным типом метаболизм, наиболее высокое содержание ЛДГ-3 – в легких, лимфоидной ткани, тромбоцитах и опухолях.

ИМ обычно сопровождается 3–4 кратным повышением общей активности ЛДГ; подобное повышение ЛДГ отмечается при миокардите, нарушениях ритма сердца. При ИМ повышение общей активности ЛДГ в сыворотке крови отмечается спустя 8–10 ч, и достигает максимальной активности через 48–72 ч. Выброс миокардиальных изоферментов ЛДГ при ИМ в кровь ведет к увеличению активности ЛДГ-1и ЛДГ-2. Активность ЛДГ-1 увеличивается через 12–24 ч после возникновения острого ИМ, совпадая во времени с максимумом активности КК-МВ и опережая возникновение пика общей активности ЛДГ (24 ч).

Выявление спектра изоферментов, характерного для ИМ, возможно при застое крови в печени и почках вследствие сердечной недостаточности, при ишемическом поражении некоторых органов в силу резкого снижения сердечного выброса. В настоящее время определение активности ЛДГ и ее изоферментов не входит в число обязательных тестов для диагностики ИМ вследствие недостаточной специфичности.

К повышению активности ЛДГ приводят миопатии, заболевания печени, мегалобластные и гемолитические анемии, острые и хронические заболевания почек. Увеличение активности ЛДГ отмечается при повреждении печени, но это повышение не так велико, как повышение активности АЛТ и АСТ. Особенное повышение (в 10 раз выше верхней границы нормы) отмечают при токсическом гепатите, сопровождающемся желтухой.

Физиологическое повышение уровня ЛДГ в крови происходит во время беременности, у новорожденных, а также после интенсивной физической нагрузки.

Показания к исследованию:

• Болезни печени;
• выявление поражений миокарда;
• миопатии;
• гемолитические анемии;
• злокачественные новообразования;
• легочная эмболия (дифференциальная диагностика с инфарктом миокарда).

Особенности взятия и хранения образцов.  

Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин) без признаков гемолиза. Хранение образцов не более 2-х суток при 18–25°C. Хранение проб при 4–8°C или замораживание снижает активность фермента.

Методы исследования. Метод, основанный на рекомендациях IFCC. ЛДГ катализирует окисление лактата в пируват при щелочном рН, одновременно НАД+ восстанавливается до НАДН. Скорость возрастания оптической плотности реакционной смеси при 340 нм, отражающая увеличение концентрации НАДН, пропорциональна активности фермента в образце.

Повышенные значения:

• Поражение миокарда;
• поражение печени;
• повреждение, воспалительные и дегенеративные заболевания скелетных мышц;
• эмболия и инфаркт легких;
• заболевания почек;
• заболевания и состояния, сопровождающиеся распадом клеток;
• злокачественные опухоли любой локализации;
• прием анаболических стероидов, этанола, гепатотоксичных препаратов.

Пониженные значения: Генетические нарушения или полное отсутствие субъединиц ЛДГ.

Изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-2

ЛДГ-1 и ЛДГ-2 — изоферменты с высоким содержанием Н-субъединиц, могут использовать в качестве субстрата α -кетобутират и катализировать его превращение в α -гидроксобутират; изофермент ЛДГ-1, обладающий большим сродством к названному субстрату, получил название α -гидроксибутиратдегидрогеназа (α -ГБДГ). Параллельное исследование активности общей ЛДГ и α -ГБДГ может быть использовано для дифференциальной диагностики заболеваний печени и сердца: при поражении сердечной мышцы увеличение активности фермента обусловлено возрастанием ЛДГ-1 (α -ГБДГ), при поражении паренхимы печени – изоформой ЛДГ-5, активность ЛДГ-1 не увеличивается.

Показания к исследованию:

• Выявление поражений миокарда;
• гемолитические анемии;
• злокачественные новообразования;
• легочная эмболия (дифференциальная диагностика с инфарктом миокарда).

Особенности взятия и хранения образцов. Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин) без признаков гемолиза. Хранение образцов не более 2 суток при 18–25°C. Хранение проб при 4–8°C или замораживание снижает активность фермента.

Методы исследования. ЛДГ катализирует превращение α -кетобутирата в α -гидроксибутират, при этом происходит окисление β -НАДН2 до β -НАД. Скорость уменьшения оптической плотности при длине волны 340 нм пропорциональна активности фермента в образце.

Повышенные значения:

• Поражение миокарда;
• заболевания и состояния, сопровождающиеся распадом клеток крови;
• острые заболевания почек.

Пониженные значения:

• Генетические нарушения или полное отсутствие субъединиц ЛДГ.

Названы 5 способов подстегнуть свой метаболизм — Российская газета

Многие люди, которым трудно похудеть, винят в этом свой медленный метаболизм.

Обмен веществ — это сложный естественный процесс, происходящий в клетках организма и помогающий преобразовывать полученную пищу в энергию, необходимую для жизни. Конечно, какие-то вещи, влияющие на его работу (например, возраст или история заболеваний), человек не в состоянии изменить. Но кое-что все-таки в его власти. Существует несколько простых советов, как повысить свой метаболизм, пишет Zee News.

1. Нормально питайтесь.

Дело в том, что когда урезаешь себя в питании, организм ради сохранения энергии начинает снижать скорость, с которой сжигаются калории. Таким образом, метаболизм замедляется. Поэтому вместо диет, тормозящих обмен веществ, лучше позаботиться о том, чтобы обеспечить себя достаточным количеством калорий для поддержания нормальной метаболической функции.

2. Не пропускайте завтрак.

Многие пропускают завтрак или другие приемы пищи, пытаясь тем самым ограничить  количество потребляемых калорий и сбросить лишний вес. Но это неправильно. Регулярное питание, частые приемы пищи, особенно завтраки помогают запускать процесс пищеварения и вместе с ним метаболизм, а также регулировать уровень сахара в крови.

3. Включайте в рацион питания продукты с жирными кислотами омега-3. Эти полезные вещества способствуют повышению метаболизма. Кроме того, они, похоже, помогают уравновешивать уровень сахара в крови и уменьшать воспалительные процессы в организме, что помогает в регуляции обмена веществ.

4. Сохраняйте физическую активность. Хорошо известно, что аэробные нагрузки — это отличный способ сжечь лишние калории. Согласно рекомендациям, в неделю на подобные активные занятия (к ним относят, например, прогулки, езду на велосипеде) надо отводить не менее 150 минут (к примеру, по полчаса в день пять дней в неделю). Физическая активность в сочетании с разумным подходом в питании могут помочь быстрее расстаться с лишним весом.

5. Высыпайтесь. Сон играет важную роль в регуляции метаболизма и аппетита.  Доказано существование связи между нехваткой сна и недостаточным уровнем метаболизма. Потеря сна может влиять на основные метаболические функции, например, связанные с регулированием гормонов. Ранее исследователи выяснили, что недостаток сна приводит к повышенной потребности в пище.

Лактат

Лактат – это продукт клеточного метаболизма, производная молочной кислоты. Может находиться в клетках в виде самой молочной кислоты либо в виде ее солей.

Синонимы русские

Молочная кислота, соли молочной кислоты.

Синонимы английские

Lactate, lactic acid.

Метод исследования

Кинетический колориметрический метод.

Единицы измерения

Ммоль/л (миллимоль на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не принимать пищу в течение 12 часов до исследования.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

В ходе анализа измеряется количество лактатов в крови. Они являются продуктом клеточного метаболизма и в зависимости от рН (кислотности) могут присутствовать в клетках в виде молочной кислоты или при нейтральной рН в форме солей молочной кислоты.

В норме концентрация лактатов в крови очень низкая. В мышцах, эритроцитах, клетках мозга и в других тканях она повышается при недостатке кислорода в клетке либо если первичный путь производства энергии в клетках нарушен.

Основные запасы клеточной энергии производятся в митохондриях, крошечных «энергетических станциях» внутри клеток организма. Митохондрии используют глюкозу и кислород для производства АТФ (аденозинтрифосфата), главного энергетического источника в организме. Это называется аэробным образованием энергии.

При падении уровня кислорода в клетке либо при нарушении нормального функционирования митохондрий организм переключается на менее эффективное производство энергии (анаэробное) путем расщепления глюкозы с образованием АТФ. Лактат является основным побочным продуктом этого анаэробного процесса. Молочная кислота может накапливаться в случае, если она производится быстрее, чем печень успевает ее утилизировать. Когда ее содержание в крови значительно повышается, наступает гиперлактатацидемия, которая может далее развиться в лактацидоз, если молочная кислота будет продолжать накапливаться. Организму часто удается компенсировать эффект лактацидоза, однако в тяжелых случаях нарушается кислотно-щелочной баланс, что сопровождается слабостью, учащенным дыханием, тошнотой, рвотой, потливостью и даже комой.

Причины повышения уровня лактатов подразделяются на две группы в соответствии с механизмом, который вызывает лактацидоз.

Лактацидоз А-типа наиболее распространен и ассоциирован с факторами, вызывающими недостаточный захват кислорода легкими либо замедленное кровообращение, что приводит к уменьшению снабжения тканей кислородом. Примеры лактацидоза А-типа:

Лактацидоз Б-типа не связан с поступлением кислорода к тканям, он является причиной повышенной потребности в кислороде из-за проблем обмена веществ. Примеры лактацидоза Б-типа:

• болезни печени,
• почечные заболевания,
• сахарный диабет,
• лейкемия,
• СПИД,
• болезни, связанные с сохранением гликогена (например, глюкозо-6-фосфатазная недостаточность),
• лекарства и токсины, такие как салицилаты, цианиды, метанол, метформин,
• различные наследственные митохондриальные и метаболические заболевания, являющиеся формами мышечной дистрофии и затрагивающие синтез АТФ,
• состояние при интенсивных физических нагрузках.

Для чего используется исследование?

• Для выявления лактацидоза, то есть высокого содержания лактатов.
• Чтобы определить гипоксию и лактацидоз и оценить их тяжесть, если есть факторы, понижающие снабжение кислородом клеток и тканей (лактацидоз чаще всего возникает именно из-за этого), например шок или застойная сердечная недостаточность.
• Для оценки кислотно-щелочного баланса и оксигенации (вместе с анализом на газы в крови).
• При диагностике болезней, которые способны привести к повышенному содержанию лактатов, а также при симптомах ацидоза, поскольку лактацидоз может вызываться факторами, не связанными с уровнем кислорода в тканях.
• Чтобы выяснить, не являются ли сопутствующие заболевания, например болезни печени или почек, причиной лактацидоза (вместе с другими исследованиями, такими как клинический анализ крови или мочи, некоторые биохимические тесты).
• Для обследования больных с подозрением на сепсис. Если уровень лактатов у них падает ниже нормы, лечение им назначается незамедлительно. При своевременной диагностике и безотлагательном лечении сепсиса шансы на успешное выздоровление увеличиваются во много раз.
• Для наблюдения за течением гипоксии и контроля за эффективностью ее лечения в случае обострения таких болезней, как сепсис, инфаркт и застойная сердечная недостаточность.

Когда назначается исследование?

• При симптомах недостатка кислорода (одышка, учащенное дыхание, бледность, потливость, тошнота, слабость в мышцах).
• При подозрении на сепсис, шок, инфаркт, сердечную недостаточность, почечную недостаточность или сахарный диабет.
• При острых головных болях, лихорадке, расстройстве и потере сознания, а также признаках менингита.

Что означают результаты?

Референсные значения: 0,5 — 2,2 ммоль/л.

Клиническое значение имеет лишь повышение концентрации лактата в крови.

• Высокая концентрация лактата указывает на болезнь (либо иные  факторы), которая является причиной накопления лактатов в тканях. В целом чем выше уровень лактатов, тем острее протекает заболевание. Если накопление лактатов связано с гипоксией, то их повышение означает, что организм не способен ее компенсировать. В то же время сама по себе избыточная концентрация лактатов не является прямым указанием на диагноз, она лишь помогает подтвердить либо исключить возможные причины наблюдаемых симптомов.
• Если есть подозрение на состояние, ведущее к кислородной недостаточности, например на шок, полученный в результате травмы или сильной кровопотери, сепсис, инфаркт, застойную сердечную недостаточность, острые респираторные или легочные заболевания, отек легких, острую анемию, то повышенный уровень лактатов может быть признаком гипоксии и/или дисфункции органов.
• Иногда лактацидоз является осложнением болезней печени, почек, диабета, лейкемии, СПИДа, болезней, связанных с сохранением гликогена (например, глюкозо-6-фосфатазной недостаточностью), различных наследственных митохондриальных и метаболических заболеваний (форм мышечной дистрофии и тех, которые затрагивают синтез АТФ).
• Увеличивать концентрацию лактатов способны лекарства и токсины (салицилаты, цианиды, метанол, метформин) и интенсивные физические нагрузки.
• При симптомах менингита значительно повышенный уровень лактатов в цереброспинальной жидкости указывает на вероятность бактериального менингита, в то время как слегка повышенный – на его вирусную разновидность.
• Нормальный уровень лактатов свидетельствует о том, что у пациента нет лактацидоза, а также о достаточном снабжении кислородом на клеточном уровне.
• При лечении лактацидоза или гипоксии уменьшение концентрации лактатов со временем отражает реакцию организма на процесс лечения.

Минкевич И.Г. Влияние метаболизма клеток на выход биомассы при росте на различных субстратах

Рассмотрены биоэнергетические закономерности, определяющие максимальный выход биомассы при аэробном росте микроорганизмов на различных субстратах. Подход основан на методе материально- энергетического баланса и использовании пакета компьютерных программ GenMetPath. Сформулирована система уравнений, описывающих балансы количеств (1) восстановленности метаболитов и (2) образованных и затраченных макроэргических связей. Чтобы сформулировать эту систему, целостный метаболизм разделен на конструктивный и энергетический парциальные обмены. Конструктивный обмен, в свою очередь, разделен на две части: передний и стандартный конструктивные обмены. Последнее разделение основано на выборе узловых метаболитов. Передний конструктивный обмен существенно зависит от субстрата роста: он превращает субстрат в стандартный набор узловых метаболитов. Последний затем превращается в макромолекулы биомассы стандартным конструктивным обменом, который одинаков на различных субстратах. Показано, что вариации потоков через узловые метаболиты оказывают незначительное влияние на стандартный конструктивный обмен. В качестве отдельного случая рассмотрен рост на субстратах, требующих участия оксигеназ и/или оксидаз. Биоэнергетические характеристики стандартного конструктивного обмена найдены из большого числа данных для роста различных организмов на глюкозе. Описанный подход может быть использован для предсказания выхода биомассы на субстратах с известными реакциями их первичной метаболизации. В качестве примера рассмотрен рост культуры дрожжей на этаноле. Значение максимального выхода, предсказанное описанным здесь методом, показало хорошее соответствие значению, найденному экспериментально.

Ключевые слова: выход биомассы, метаболизм клеток, конструктивный обмен, энергетический обмен, узловые метаболиты, материально-энергетический баланс

Цитата: Минкевич И.Г. Влияние метаболизма клеток на выход биомассы при росте на различных субстратах // Компьютерные исследования и моделирование, 2017, т. 9, № 6, с. 993-1014

Citation in English: Minkevich I.G. The effect of cell metabolism on biomass yield during the growth on various substrates // Computer Research and Modeling, 2017, vol. 9, no. 6, pp. 993-1014

DOI: 10.20537/2076-7633-2017-9-6-993-1014

Просмотров за год: 17.

Механизм повреждения энергетического обмена при гипоксии и возможные пути его коррекции фумаратсодержащими растворами

Л.В. Слепнева, Г.А. Хмылова

ФГБУ «Российский НИИ гематологи трансфузиологии ФМБА», г. Санкт-Петербург

 

Трансфузиология №2, 2013

Резюме

Статья посвящена вопросам механизма действия препаратов, влияющих на процессы энергообразования в организме. Показаны пути коррекции нарушений энергетического обмена и преимущества фумаратсодержащих инфузионных растворов.

Ключевые слова: гипоксия, цикл Кребса, сукцинат, фумарат, фумаратсодержащие инфузионные растворы, мафусол, полиоксифумарин, конфумин.

В настоящее время нарушения энергетического обмена рассматриваются как один из ведущих патологических процессов, приводящих к необратимым последствиям и гибели организма, что обусловливает исключительную важность рассматриваемой проблемы. Коррекция или устранение энергодефицита является обязательным компонентом в лечении большинства патологических состояний, и в связи с этим, понимание механизма действия препаратов, способных влиять на различные звенья энергообмена, для практикующих врачей приобретают особую ценность.

Жизнедеятельность организма с многообразием всех физиологических функций и биохимических процессов возможна лишь при условии его постоянного энергообеспечения. В настоящее время имеется значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о том, что различные экстремальные воздействия на организм (тяжелая кровопотеря, ожог, травма, сердечная недостаточность, острое отравление и др.) вызывают однотипные повреждения в клеточной системе энергообразования. Это явление обусловлено тем, что результирующим эффектом различных по своей природе экстремальных факторов является развитие острого кислородного голодания тканей. Дефицит кислорода — акцептора электронов в митохондриальной дыхательной цепи, приводит к глубокому подавлению биоэнергетической функции митохондрий. Выходит из строя основная энергетическая система клетки, энергопродукция клетками резко снижается, и, как следствие, нарушается течение многочисленных энергозависимых процессов в организме [2, 6, 11, 13, 24, 34, 36, 37, 43].

Недостаточность систем энергообразования в клетке составляет существенный элемент патогенеза многих заболеваний. По мнению ряда авторов, поддержание жизни в экстремальных условиях возможно до тех пор, пока дефицит энергии не достигнет критических величин. Истощение клеточных энергетических резервов ниже допустимого уровня сопровождается развитием в клетке необратимых процессов и гибелью организма.

Прежде чем перейти к рассмотрению вопросов, связанных с нарушением энергетического обмена в клетке при патологических состояниях и его коррекции применением различных лекарственных средств, кратко остановимся на описании процессов энергообразования в нормально функционирующей клетке [16, 41].

На рис. 1 схематически представлен сложный процесс распада питательных веществ, который обеспечивает ступенчатое постепенное освобождение энергии и аккумуляцию ее в виде макроэргической фосфатной связи аденозинтрифосфата (АТФ).

Распад сложных питательных веществ на более простые является необходимым условием для дальнейшего использования их в клетке в качестве источников энергии и пластического материала. В катаболизме основных питательных веществ (углеводов, белков и жиров) можно выделить три основные стадии.

На первой стадии крупные молекулы под влиянием сложных ферментативных систем расщепляются на более простые. В результате действия этих ферментативных систем углеводы расщепляются до гексоз и пентоз, липиды – до глицерина и жирных кислот, из белков образуется около 20-ти аминокислот.

На второй стадии происходит дальнейшее расщепление образовавшихся соединений. Из 20-ти различных аминокислот образуется лишь несколько конечных продуктов, а именно, ацетил-коэнзим А, α-кетоглютаровая и щавелевоуксусная кислоты.

Жирные кислоты в процессе β-окисления превращаются в ацетил-КоА. Гексозы под действием ферментативных систем гликолиза расцепляются до пировиноградной кислоты, которая затем в процессе окислительного декарбоксилирования превращается также в ацетил-КоА.

Гликолиз является тем механизмом, посредством которого многие организмы получают химическую энергию из глюкозы и других субстратов в отсутствие молекулярного кислорода. У большинства аэробных организмов процесс гликолиза является предварительной ступенью для дальнейшего окисления продуктов брожения кислородом в процессе дыхания.

Метаболиты, образовавшиеся на второй стадии распада питательных веществ (ацетил-КоА, α-кето-глютаровая, щавелевоуксусная кислоты) вступают в третью стадию, которая для них является общей и на которой они в конечном итоге окисляются до СО2 и Н2О.

Третья стадия – стадия терминального окисления питательных веществ, во время которой освобождается основная масса энергии, осуществляется в митохондриях через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и митохондриальную дыхательную цепь. ЦТК – общий конечный путь окислительного катаболизма всех видов клеточного топлива в аэробных условиях. В этом цикле под действием специфических дегидрогеназ протекают процессы дегидрирования субстратов, восстановительные эквиваленты от которых (протоны и электроны) поступают на митохондриальную дыхательную цепь. Дегидрирование – отщепление молекул Н2 от интермедиатов цикла Кребса происходит, в основном, при помощи дегидрогеназ, простетической группой которых является никотинамидаденин-динуклеотид (НАД), и лишь дегидрирование янтарной кислоты осуществляется ФАД-зависимой дегидрогеназой (сукцинатдегидрогеназой).

Дыхательная цепь, состоящая из серии переносчиков электронов, передает восстановительные эквиваленты конечному акцептору электронов – молекулярному кислороду. Дыхательная цепь – это полиферментная система, локализованная во внутренней мембране митохондрий, основными компонентами которой являются НАД-зависимые дегидрогеназы, флавопротеиды и цитохромы (рис. 1).

Сопряженно с транспортом электронов протекает процесс окислительного фосфорилирования, в котором значительная часть свободной энергии электронов, передаваемых редокс-цепью на кислород, аккумулируется и трансформируется в специфическую макроэргическую связь АТФ. Таким образом, необходимая для нужд организма энергия образуется благодаря функционированию взаимосвязанных процессов гликолиза и дыхания. В процессе гликолиза высвобождается лишь незначительная часть той химической энергии, которая потенциально может быть извлечена из молекулы глюкозы. Полное окисление глюкозы до СО2 и Н 2О, осуществляемое в процессе дыхания, приводит к синтезу значительно большего количества макроэргов. При окислении одной молекулы глюкозы в гликолитическом цикле образуется 2 молекулы АТФ, тогда как дальнейшее расщепление продуктов гликолиза в цикле Кребса сопровождается синтезом 38 молекул АТФ. Таким образом, митохондриальная дыхательная цепь является основным местом приложения и утилизации кислорода в клетке.

При дефиците кислорода – конечного акцептора электронов в редокс-цепи митохондрий – отмечается выраженная гиперредукция всех компонентов терминального звена окисления. Прекращаются транспорт электронов по дыхательной цепи и сопряженный с ним процесс образования макроэнергических фосфатов. Известно, что в условиях нормоксии НАД-звено дыхательной цепи митохондрий принимает восстановительные эквиваленты из различных источников:

1. от субстратов цикла Кребса при участии специфических дегидрогеназ;

2. оксиацил-КоА-дегидрогеназы поставляютионы водорода на НАД- звено при окислении жирных кислот;

3. сложная система пируват-дегидрогеназы, отщепляя ионы водорода в реакциях окислительного декарбоксилирования, передает их на НАД-звено редокс-цепи;

4. внемитохондриальный НАД-Н, образованный в центральной реакции гликолитической оксидоредукции, также отдает свои протоны на митохондриальную дыхательную цепь (рис.1).

Мощный поток восстановительных эквивалентов в условиях кислородной недостаточности не может реализоваться из-за гипервосстановленности НАД-зависимого участка дыхательной цепи. Выключается из функционирования основная энергетическая система клетки, резко снижается продукция АТФ.

В анаэробных условиях клетка стремится восполнить энергетический дефицит за счёт активации гликолиза. Несмотря на то, что при анаэробном гликолизе продуцируется почти в 20 раз меньше АТФ, чем при полном сгорании глюкозы в цикле Кребса, потенциальная скорость процесса в основном может обеспечить энергозатраты организма. Однако для осуществления гликолитических реакций необходим постоянный приток окисленной формы НАД, который при нормоксии обеспечивается работой специфических челночных механизмов. Гликолитический НАД-Н проникает через митохондриальные мембраны посредством функционирования α-глицерофосфатного, β-оксибутиратного и других механизмов переноса восстановительных эквивалентов.

Оксибутиратный и глицерофосфатные шунты являются основными конкурентами лактатдегидрогеназного механизма окисления гликолитического НАД-Н, деятельность которого при нормальной концентрации кислорода в клетке подавлена более активными вышеназванными механизмами.

При нарушении электронтранспортной функции редокс-цепи и гиперредукции ее НАД-звена клетка вынуждена изыскивать другие пути реокисления цитоплазматического НАД-Н. В условиях острой гипоксии конечный продукт гликолиза – пируват – не подвергается декарбоксилированию и не вовлекается в цикл Кребса, а, принимая восстановительные эквиваленты от цитоплазматического НАД-Н, превращается в лактат с освобождением новых порций окисленной формы НАД (рис. 2).

Активация лактатдегидрогеназного механизма поставки НАД для гликолиза в конечном итоге приводит к истощению запасов гликогена и тканевому ацидозу вследствие накопления кислых продуктов метаболизма (лактата, пирувата, оксибутирата, глицерофосфата и др.). Избыточные концентрации конечного субстрата анаэробного гликолиза – лактата – тормозят последнюю реакцию гликолитического цикла.

Регенерация НАД прекращается, и, именно, дефицит пиридиннуклеотида останавливает гликолиз и анаэробную продукцию АТФ. Клеточный ацидоз способствует нарушению проницаемости мембран, вплоть до разрушения лизосом. В цитоплазму поступают аутолитические ферменты. Развивается процесс аутолиза клеток, сопровождающийся повреждением тканей и органов. В организме формируются необратимые изменения.

Таким образом, степень повреждения митохондриального метаболизма в условиях тяжелой кислородной недостаточности определяет тяжесть многих патологических состояний. Накопленный опыт лечения шока и кровопотери показывает, что существующие инфузионнотрансфузионные среды, проявляя лечебное действие в стадиях легкой и средней тяжести, оказываются недостаточными на поздних стадиях процесса. Особенности течения поздних стадий геморрагического шока связывают главным образом с генерализованными нарушениями метаболизма и возникающими в результате этого расстройствами энергообмена.

В связи с этим применение совместно с кровезаменителями препаратов, способных повысить энергетический потенциал клетки в условиях гипоксии, рассматривается как один из путей повышения эффективности инфузионной терапии гиповолемических состояний.

В ликвидации энергетического дефицита большое значение придается антигипоксантам. К настоящему времени не выработано единого общепринятого определения антигипоксантов и их классификации, так как в ответ на гипоксическое воздействие вовлекаются самые разные системы организма. Препараты биоэнергетического действия можно разделить на несколько групп.

К первой группе следует отнести препараты, являющиеся источником энергетического сырья (глюкоза, сорбит, АТФ, фосфорилированные гексозы и др.). Использование их показано при патологических состояниях, сопровождающихся истощением энергетических ресурсов в клетке. Включение в состав противошоковых кровезаменителей 5-10% глюкозы или фосфорилированных гексоз [1, 42] для поддержания гликолиза в клетках не позволяет существенно повысить эффективность инфузионной терапии из-за неизбежно возникающего накопления кислых продуктов метаболизма и дефицита окисленной формы пиридиннуклеотида (НАД). Отсюда понятно, что введение таких субстратов окисления, как глюкоза или гексозы, при гипоксии целесообразно лишь с препаратами, ускоряющими утилизацию лактата. Таким свойством обладают соединения группы гутимина. В эксперименте показан антигипоксический эффект гутимина и амтизола при геморрагическом шоке [8].  

Ко второй группе препаратов можно отнести средства, которые, не являясь энергетически богатыми соединениями, способны активно воздействовать на энергетический обмен посредством коррекции отдельных звеньев многоступенчатого процесса аккумуляции энергии в клетке. Данные о нарушении транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий при шоке и кровопотери [28] являются теоретической предпосылкой для применения антигипоксантов с электрон-акцепторными свойствами. В литературе имеются довольно обширные сведения о применении естественных и искусственных антигипоксантов – переносчиков электронов. К числу первых относится цитохром С, который, как известно, является одним из компонентов дыхательной цепи митохондрий и служит мобильным переносчиком электронов. Играя важную роль в энергетическом метаболизме клетки, цитохром С показал высокую лечебную эффективность в клинической практике при терапии шока, кровопотери и постишемической гипоксии [12, 32].

Разработке и исследованию искусственных переносчиков электронов посвящено значительное количество работ. Эти соединения способны модифицировать дыхательную цепь митохондрий так, чтобы осуществлять «сброс» восстановительных эквивалентов непосредственно на кислород, минуя заблокированные участки дыхательной цепи. К числу таких веществ относится ряд соединений из класса хинонов (ортопарабензохиноны, нафтохиноны, гексогидрохиноны). Высокий редокс-потенциал этих препаратов определяет их способность к транспорту электронов [30]. При проведении экспериментов на животных многие из этих соединений оказались токсичными, что не позволило рекомендовать их в качестве лечебных средств. Из всех средств, формирующих искус- ственные редокс-системы, в медицинскую практику внедрен препарат «Гипоксен», представляющий собой синтетический полихинон [9].

Известно, что антигипоксанты группы хинонов осуществляют перенос электронов с НАД-Н звена на кислород, минуя все 3 пункта фосфорилирования в дыхательной цепи и, следовательно, устранение дефицита энергии при введении этих препаратов может происходить лишь за счет активации гликолитической выработки АТФ. Однако для полноценного проявления антигипоксических свойств этих соединений необходим акцептор электронов – кислород. Наибольший интерес для включения в состав новых комплексных кровезаменителей представляют, так называемые, истинные антигипоксанты или антигипоксанты прямого действия, непосредственно влияющие на митохондриальный метаболизм при гипоксии.

Согласно теоретическим предпосылкам, одна из возможностей поддержания биоэнергетики клетки может быть реализована посредством стимуляции адаптационных механизмов к гипоксии, работающих на последних этапах цикла Кребса. Из всех субстратов цикла Кребса только влияние сукцината на энергетический обмен подробно изучено в эксперименте на животных.

Исследование механизма действия сукцината при гипоксических состояниях проведено в работах М.Н. Кондрашовой с соавторами [5, 6]. Исследователи считают, что в условиях гипоксии сукцинат, не являясь НАД-зависимым субстратом, «монополизирует» дыхательную цепь и активно в ней окисляется. Высокая скорость реакции окисления сукцината, поставляющей 2 молекулы АТФ, позволяет компенсировать выработку 3-х молекул АТФ, образующихся при окислении НАД-зависимых субстратов. Однако в условиях прогрессирующей гипоксии дефицит кислорода, лимитирующий скорость окисления всех субстратов, снижает ценность сукцината и ставит его в один ряд с другими субстратами окисления. Поэтому применение сукцината в качестве антигипоксанта должно быть особенно эффективно в комплексе с препаратами, улучшающими кислородообеспечение организма. Преимущественное использование сукцината – естественная защита клетки против гипоксии. При этом пополнение фонда субстрата может происходить за счет реакций цикла Кребса, идущих как в прямом, так и в обратном направлениях (рис. 3).

При обратном течении реакций имеющийся запас малата по мере необходимости превращается в фумарат, который восстанавливается в сукцинат. Восстановление фумарата сопровождается выработкой АТФ, и поэтому реакции обращения в системе «малат-фумарат-сукцинат» способны поддерживать окислительное фосфорилирование даже при аноксии.

В условиях же гипоксии инверсивные превращения фумарата выполняют роль триггера, который, в зависимости от концентрации кислорода регулирует течение конечных реакций цикла Кребса в прямом либо в обратном направлениях, и эти реакции сопровождаются синтезом АТФ. Механизм инверсивных превращений фумарата в цикле Кребса объясняет эффективность применения фумаратсодержащих инфузионных сред, таких как кристаллоидный раствор – мафусол, коллоидный кровезаменитель – полиоксифумарин и концентрированный раствор фумарата натрия – конфумин. Эти препараты разработаны и основательно изучены в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии. Лечебная эффективность была изучена на моделях геморрагического и ожогового шока, а также при экспериментальном перитоните [17–20, 23, 25,45]. Оценку эффективности инфузионных растворов определяли по совокупности показателей системной гемодинамики, кислородного режима, кислотно-основного состояния (КОС), перекисного окисления липидов и митохондриального метаболизма в печени и сердце животных. Полярографическое исследование митохондрий, выделенных из печени и сердца животных, леченных фумаратсодержащими растворами, свидетельствовало о полном восстановлении энергопродуцирующих функций этих органелл. Следует отметить, что летальность животных в контрольной группе (тяжелый шок) составляло 100%, при лечении мафусолом или полиоксифумарином – 17–20%.

Результаты исследования митохондриального метаболизма позволяют предположить, что парентеральное введение фумарата индуцирует суперкомпенсацию адаптационного механизма к гипоксии, функционирующих на последних этапах цикла Кребса. Фумарат в системе «малат-фумарат-сукцинат» способен поддерживать синтез АТФ как в аэробных, так и в анаэробных условиях. При дефиците кислорода фумарат, восстанавливаясь ФАД∙Н2-группой сукцинатдегидрогеазой, превращается в сукцинат и освобождает новые порции окисленной формы ФАД. Принимая восстановительные эквиваленты от НАД-Н, ФАД способствует снятию гипервосстановленности НАД звена дыхательной цепи и синтезу АТФ в бескислородной среде. При поступлении кислорода в клетку сукцинат, синтезируемый из фумарата, монополизирует дыхательную цепь и, активно окисляясь в ней, продуцирует АТФ (рис. 3). К тому же, образование в этих реакциях окисленной формы НАД запускает также и механизм гликолитической продукции АТФ. Поддержание энергетического потенциала клетки при инфузия фумарата способствует удлинению периода обратимых изменений в организме и предотвращает развитие «необратимости» при патологических состояниях, отягощенных глубокой гипоксией.

Парентеральное введение фумаратсодержащих растворов наряду с восстановлением биоэнергетики клетки, сопровождается «мягким» ощелачивающим действием препаратов на кислотно-основное состояние крови при ацидозе. Это действие обусловлено тем, что такие органические соли, как фумарат-, ацетат-, лактат-, сукцинат- и малат натрия являются соединениями, образованными сильным основанием (NaOH) и слабой кислотой. При гидролизе подобных солей в кровеносном русле освобождается соответствующая кислота и NaOH, который расходуется на нейтрализацию кислых продуктов метаболизма. Реакция гидролиза смещена вправо, так как постоянно происходит потребление продукта гидролитической реакции – NaOH (рис. 4).

Следует отметить, что вышеназванные соли оказывают мягкое ощелачивающие действие по сравнению с бикарбонатом натрия, широко используемым в клинической практике для ликвидации ацидоза. Реакция гидролиза NaHСО3 протекает значительно быстрее, так как в ходе реакции удаляются оба ее продукта: NaOH расходуется на нейтрализацию метаболитов, а второй продукт реакции – угольная кислота, нестоек и разлагается на Н2О и СО2. Образованная в избыточном количестве щелочь может способствовать развитию алкалоза, что имеет место в клинических условиях при передозировке бикарбоната натрия.

Все вышеперечисленные соли входят в состав различных инфузионных растворов (мафусол, полиоксифумарин, конфумин, лактасол, Рингер-лактат, ацесоль, реамберин, стерофундин и др.). Однако оказывая ощелачивающее действие при ацидозе, далеко не все эти препараты способны поддержать энергетический обмен при гипоксии. Восстановление показателей КОС «химическим путем» является недостаточным для успешной терапии шока.

Следует к тому же учитывать, что при гидролизе лактата натрия выделяется молочная кислота, которая в сумме с эндогенной молочной кислотой, возникающей в больших концентрациях при гипоксии, могут способствовать подавлению реакций гликолиза, что, в свою очередь, вызывает снижение продукции гликолитической АТФ. Существуют также исследования, указывающие, что лактат может вызвать интерстициальный отек головного мозга и повышать агрегацию тромбоцитов и эритроцитов [14, 39, 44]. Лактатсодержащие инфузионные растворы нельзя использовать при печеночной недостаточности [35, 38, 40], а также в случаях шока, сопровождающегося гиперлактатемией или лактатным ацидозом [33].

Ацетат натрия, в отличие от лактата, не проявляет токсического действия при тяжелом шоке. Однако утилизация уксусной кислоты, образованной при гидролизе ацетата натрия, в условиях кислородной недостаточности затруднена вследствие постгипоксического дефекта в функционировании митохондриальной дыхательной цепи. Лечебное действие фумарата натрия в сравнении с лактатом и ацетатом представляется более физиологичным, так как при его введении наряду с ощелачивающим эффектом проявляется и его влияние на восстановление процессов генерации энергии в митохондриях, а, следовательно, устраняется причина возникновения метаболического ацидоза.

Сукцинатсодержащие растворы, в частности «Реамберин», способствуют поддержанию энергетического обмена, однако, в условиях острого дефицита кислорода подавляется окисление сукцината и существенно снижается его энергопродуцирующая функция. Окисление малата в цикле Кребса осуществляется НАД-зависимой малатдегидрогеназой, и эта реакция тормозится из-за гипервосстановленности НАД-звена редокс-цепи митохондрий при гипоксии. Следовательно, в этих условиях субстрат не способен повысить энергетический потенциал клетки. К тому же, в инфузионном малатсодержащем растворе «Стерофундин» концентрация малата очень низкая, чтобы обеспечить достаточную продукцию АТФ. В условиях гипоксии повышение концентрации малата могло бы создать условия для обращения реакций в цикле Кребса с увеличением фонда фумарата, способного принимать восстановительные эквиваленты (Н2) и синтезировать АТФ. Однако концентрация малата в стерофундине (5 ммоль/л) незначительна для запуска реакций в цикле Кребса в обратном направлении.

Фумаратсодержащие растворы (мафусол, полиоксифумарин) содержат высокие концентрации фумарата (86 ммоль/л), обеспечивающие как выработку АТФ, так и накопление сукцината, который активно окисляется при поступлении кислорода. Введение субстратов в организм при гипоксии показано еще и вследствие того, что кислородная недостаточность сопровождается значительным субстратным голодом клетки. Препараты «Мафусол» и «Полиоксифумарин» с высокой концентрацией фумарата и возможностью инфузий больших объемов этих растворов без побочных эффектов являются высокоэффективными средствами терапии шока различного генеза. Это подтверждено клинически. Так, кристаллоидный кровезаменитель «Мафусол» разрешен к медицинскому применению уже более 20 лет и широко используется в разных областях медицины (хирургия, неврология, кардиология, реаниматология, педиатрия, акушерство и гинекология, комбустиология, токсикология и др.) [3, 15, 22, 27, 29, 31]. Отличительной особенностью этого препарата является то, что его можно переливать в больших количествах, не только внутривенно, но и внутриартериально, а также в смеси для заполнения контура АИК при открытых операциях на сердце. Ни один из существующих сейчас на фармацевтическом рынке инфузионных антигипоксических препаратов не обладает этими свойствами. Полифункциональный коллоидный плазмозаменитель «Полиоксифумарин» с 1999 года успешно применяется у взрослых и детей в клинической практике гиповолемических состояний различной степени тяжести [10, 21, 22]. Аналогов ему нет ни в России, ни зарубежом.

Применение концентрированного раствора фумарата натрия (препарата «Конфумин») в качестве антигипоксического компонента в схемах инфузионно-трансфузионной терапии существенно увеличивает уровень субстратов окисления в кровеносном русле и позволяет повысить лечебную эффективность общепринятых в клинической практике плазмозаменителей [3, 4, 22, 25-27]. Конфумин разрешен к широкому медицинскому применению у взрослых, промышленный выпуск препарата освоен в ОАО «Фирма Медполимер».

Пределы аэробного метаболизма в раковых клетках

Бремя аэробного роста OxPhos из-за глюкозы

Чтобы лучше понять метаболизм клеток как функцию роста метаболической потребности, мы выполнили предварительный расчет, сосредоточив внимание на основных компоненты биомассы клеток млекопитающих. Сухая масса клеток млекопитающих в основном состоит из белков, липидов и полисахаридов (таблица 1). Основываясь на этом составе, мы можем оценить биосинтетические потребности в метаболитах-предшественниках и энергию, необходимую для дублирования содержимого клеток.Для дупликации типичной клетки млекопитающего требуется около 1,1 моль / л аминокислот для синтеза белка, 1,2 моль / л AcCoA для синтеза липидов и потребность в энергии b _{потребность} = 6,0 моль / л АТФ (таблица 1).

Таблица 1 Требования к росту.

В синтезе предшественников биомассы из глюкозы используются различные дегидрогеназы, производящие / потребляющие НАДН (рис. 1). Синтез некоторых аминокислот включает трансаминирование в сочетании с глутаматом в превращение α-кетоглутарата.α-кетоглутарат может быть преобразован обратно в глутамат через обратную глутаматдегидрогеназу, потребляющую NADH. Когда все эти вклады приняты во внимание, мы получаем чистое производство НАДН, связанного с биосинтезом метаболитов-предшественников из глюкозы. Произведенный НАДН может окисляться в митохондриях, что связано с образованием АТФ. Предполагая, что выход АТФ / НАДН составляет 2,5, мы получаем, что клетки млекопитающих могут продуцировать b _{, связанный} = 7,6 моль АТФ / л, связанный с продукцией NADH биосинтетическими путями (NADH OxPhos, таблица 1).

Рисунок 1

Биосинтез из глюкозы. Синтез метаболитов-предшественников из глюкозы. Текст, выделенный курсивом, представляет требования к предшественникам для дублирования ячейки с использованием однобуквенной номенклатуры для аминокислот и x для AcCoA. Шаги дегидрогеназы выделены красными стрелками (сплошные прямые и пунктирные обратные), а шаги трансаминаз — синими стрелками. АТФ и другие кофакторы для простоты опущены.

Аэробный биосинтез клетки из глюкозы зависит от способности митохондрий вырабатывать энергию, необходимую для биосинтеза, и окислять НАДН, образующийся в результате биосинтеза.Далее мы вычисляем, насколько быстро клетка может пролиферировать при заданном содержании митохондрий. Если a — это не зависящая от роста потребность в энергии для поддержания клеток, b — это потребность OxPhos для дублирования содержимого клетки, T — время удвоения клеток, r _M — емкость митохондрий OxPhos (моль АТФ / л митохондрий) и ϕ _M — объемная доля митохондрий (L митохондрий / L клетки), тогда должно выполняться следующее ограничение

$$ a + b \ frac {\ mathrm {ln} \, 2} {T} \ le {r} _ {M} {\ varphi} _ {M} $$

(1)

Если клетки размножаются слишком быстро, сокращая время удвоения (левая часть уравнения 1), они преодолеют максимальную емкость OxPhos (правая часть уравнения 1).Из уравнения 1 мы можем определить минимальное время удвоения, которое поддерживается аэробным биосинтезом из глюкозы

$$ {T} _ {{\ rm {\ min}}} = \ frac {b \, \ mathrm {ln} \, 2} {{r} _ {M} {\ varphi} _ {M} -a} $$

(2)

Емкость митохондрий OxPhos ( r _M ) был измерен для изолированных митохондрий (рис. 2 и дополнительная таблица S2). В мышечных клетках он может достигать 0,38 моль АТФ / л митохондрий / мин.Митохондрии дрожжевых клеток столь же эффективны, с r _M = 0,29 моль АТФ / л митохондрий / мин. Однако митохондрии раковых клеток в 10 раз менее эффективны, а именно r . _M = 0,042–0,068 моль АТФ / л митохондрий / мин.

Рисунок 2

Емкость митохондрий. Собственная емкость митохондрий (на объем митохондрий) для генерации АТФ, на основе данных, представленных в литературе (дополнительная таблица S2).Красный представляет данные для различных тканей и клеточных линий млекопитающих. Зеленый цвет представляет данные для дрожжей. Для справки синим пунктиром мы выделяем внутреннюю способность гликолиза.

Фазы роста

Как обсуждалось выше, даже при работе митохондрий с максимальной емкостью ограниченное содержание митохондрий приводит к ограниченной способности окислительного фосфорилирования как для выработки энергии, так и для окисления НАДН. Остается определить, актуально ли такое ограничение, если принять во внимание фактическое содержание митохондрий и потребность клеток в энергии.С этой целью на рис. 3 мы изображаем различные сценарии, которые могут возникать в зависимости от содержания митохондрий, энергии поддержания и времени удвоения, как подразумевается уравнением (2). Верхний правый угол соответствует фазе роста, когда клетки могут пролиферировать, производя всю энергию из OxPhos, и могут синтезировать метаболиты-предшественники из глюкозы (факультативный OxPhos и факультативное сочетание биосинтеза с продукцией NADH, фаза FF). Мы замечаем, что «они могут» не означает «они должны». Клеточная линия может иметь время удвоения и содержание митохондрий в этой области, но может иметь повышенную регуляцию аэробного гликолиза из-за генетических изменений.Клетки могут также использовать альтернативные источники углерода из-за сверхэкспрессии транспортных систем, снижая продукцию НАДН, связанную с биосинтезом. В таких случаях мы действительно можем говорить о неэффективном / расточительном / случайном фенотипе. Другой крайностью является серая зона, выделенная на рис. 3, где потребность в энергии, связанная с обслуживанием ячейки, превышает емкость OxPhos ( a > r _м φ _м в уравнении 2).В этой области клетки не могут выжить без активации аэробного гликолиза.

Рисунок 3

Фазовая диаграмма роста. Различные фазы роста в зависимости от времени удвоения клеток и содержания митохондрий. Сплошная черная линия получена с использованием уравнения 2, при котором потребность OxPhos устанавливается равной потребности в энергии для дублирования клеток (b = b _спрос ). Красная пунктирная линия получена с использованием уравнения 2, устанавливающего потребность OxPhos равной NADH OxPhos дупликации клеток (b = b _{спаренный} ).Серая область обозначает область, в которой мощности OxPhos недостаточно для удовлетворения потребности в энергии для обслуживания ячеек: сплошные и пунктирные диаграммы указывают на среднее значение по определенной площади минус одно стандартное отклонение, а неопределенные значения (среднее плюс минус два стандартных отклонения) с учетом наших текущих оценок. обслуживания клетки. Плюсы представляют 60 линий раковых клеток из панели NCI60.

В клетках млекопитающих энергия, которая может быть генерирована OxPhos из НАДН, образующегося в биосинтетических путях, превышает потребность в энергии биосинтеза ( b _спрос < b _{спаренный} , таблица 1).Поскольку клетки уменьшают время удвоения и / или уменьшают свое митохондриальное содержание, они сначала будут ограничены неспособностью митохондрий обменивать продуцируемый NADH, связанный с биосинтезом метаболитов-предшественников (рис. 3, красная пунктирная линия). Чтобы размножаться быстрее, сокращая время удвоения, клеткам млекопитающих необходимо отделить продукцию НАДН от синтеза метаболитов-предшественников (факультативный OxPhos и обязательное отделение биосинтеза от продукции НАДН, фаза FO). В фазе FO клетки млекопитающих могут удовлетворять свою потребность в энергии от OxPhos, пока потребность в энергии биосинтеза не достигнет емкости OxPhos (рис.3, сплошная черная линия). Ниже черной-сплошной линии клетки млекопитающих не могут удовлетворить свои потребности в энергии с помощью OxPhos, и они должны включить аэробный гликолиз (обязательный аэробный гликолиз и обязательное отделение биосинтеза от продукции NADH, фаза OO). В этом случае аэробный гликолиз не является неэффективным / расточительным / случайным фенотипом, это единственный оставшийся выбор для более быстрого размножения.

Чтобы определить расположение раковых клеток на фазовой диаграмме роста на рис. 3, мы сосредотачиваемся на панели NCI60 клеточных линий, полученных из опухоли.Время удвоения для этих клеточных линий было сообщено программой NCI Developmental Therapeutics Program, и мы оценили их митохондриальное содержание. Каждый крест на рис. 3 представляет собой линию клеток на панели NCI60. Большинство клеточных линий попадают в серую зону, где OxPhos не может удовлетворить потребности в энергии для поддержания клеток, и должен быть активирован аэробный гликолиз. Действительно, эти клеточные линии превращают примерно 70% импортированной глюкозы в лактат ^21,22 . В отношении этих раковых клеток можно сделать вывод, что аэробный гликолиз является следствием ограниченной способности OxPhos.Оценки метаболического потока показывают, что эти клетки производят АТФ из OxPhos в количествах, сравнимых с аэробным гликолизом ²² . Наблюдение за этим смешанным фенотипом аэробного гликолиза / OxPhos не противоречит нашему выводу, что аэробный гликолиз является обязательным для этих клеток. Просто энергия, вырабатываемая OxPhos, не удовлетворяет потребности в энергии.

Отделение производства НАДН от биосинтеза

Биосинтез может быть отделено от образования НАДН по-разному.НАДН может быть обменом (НАДН → НАД +), связанным с продукцией НАДФН (НАДФ + → НАДФН), с использованием комбинаций цитозольных / митохондриальных НАД + и НАДФ + дегидрогеназ и митохондриальной трансгидрогеназы. Мы замечаем, что преобразование НАДН в НАДФН трансгидрогеназой переносит протоны из матрицы митохондрий в цитозоль, отсоединяя OxPhos от генерации АТФ. Следовательно, оборот NADH трансгидрогеназой происходит за счет увеличения ограниченного количества OxPhos для производства энергии.

В качестве альтернативы, клетки могут переключаться на другие источники углерода, чтобы уменьшить производство НАДН.Ограниченная емкость OxPhos диктует, какие источники углерода более подходят для отделения производства НАДН от биосинтеза. Конечно, для каждой аминокислоты сама аминокислота является подходящим альтернативным источником углерода. В принципе, выбор для AcCoA более избыточен (рис. 4a). Ацетат можно использовать за дополнительную плату в размере 1 АТФ для стадии ацетил-КоА-лигазы. С другой стороны, β-окисление жирных кислот генерирует NADH и FADh3 и, следовательно, не снижает нагрузку на образование NADH. AcCoA также может быть получен из аминокислот.Однако в большинстве случаев образуется НАДН (рис. 4а, серые линии). Катаболизм изолейцина, лейцина, лизина, метионина, триптофана и валина требует одной или нескольких стадий дегидрогеназы, генерирующих НАДН. Аланин, цистеин, глицин, треонин и серин могут быть преобразованы в пируват, который по-прежнему требует пируватдегидрогеназы для производства AcCoa (рис. 1). Аспартат и аспарагин можно превратить в оксалоацетат, который по-прежнему требует источника AcCoA для синтеза цитрата или преобразования в пируват, что опять же требует пируватдегидрогеназы для производства AcCoa.Наконец, аргинин и пролин могут быть преобразованы в глутамат, но при этом образуется НАДН.

Рисунок 4

Метаболизм при ограниченной емкости OxPhos. ( a ) Синтез AcCoA из альтернативных источников углерода. Серым цветом выделены источники углерода, которые приводят к образованию НАДН. В рамках выделены источники углерода, которые отделяют синтез AcCoA от производства NADH. ( b ) Компартментализация метаболизма аэробных клеток эукариот в контексте ограниченной способности OxPhos.

Есть только две группы аминокислот, которые могут быть преобразованы в цитрат без образования НАДН. В первую группу входят глутамат и глутамин. Глутамат можно превратить в цитрат посредством восстановительного карбоксилирования. По этому пути продукция NAD (P) H глутаматдегидрогеназой компенсируется обратной активностью NAD (P) изоцитратдегидрогеназы (рис. 1). Глутамат может быть взят из среды или произведен из глутамина с помощью глутаминазы. Интересно, что аргинин и пролин могут продуцироваться из глутамата при одновременном потреблении НАДН (рис.4а). Это могло бы обеспечить дополнительный механизм оборота NADH. Вторую группу составляют аминокислоты фенилаланин и тирозин, которые превращаются в ацетоацетат и фумарат (рис. 4а). Ацетоацетат дает 2 AcCoa через объединенной активности ацетоацетат-CoA лигазы (потребляющей один АТФ) и ацетил-CoA трансферазы. С другой стороны, фумарат лучше выводится из организма, чтобы избежать дополнительной нагрузки OxPhos. Мы замечаем, что катаболизм фенилаланина и тирозина до ацетоацетата потребляет 3 и 2 молекулы кислорода соответственно.Следовательно, эти аминокислоты не подходят для отделения продукции НАДН от биосинтеза в условиях гипоксии.

Продукция НАДФН

Для простоты мы опустили баланс некоторых ключевых кофакторов, которые также необходимы для пролиферации клеток. НАДФН — это свободный источник энергии, необходимый для биосинтеза некоторых аминокислот и липидов. Пентозофосфатный путь (PPP) является основным источником продукции NADPH. PPP связан с верхней частью гликолиза, выше стадии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.Следовательно, PPP не изменяет соотношение выхода пирувата / NADH при гликолизе, что является единственной характеристикой гликолиза, используемой для расчета биосинтетических требований, указанных в таблице 1. Увеличение выхода NADPH просто снижает процент глюкозных углеродов, включенных в биомассу. (На каждые 2 НАДФН выделяется 1 молекула CO ₂ ).

НАДФН может также производиться посредством одноуглеродного метаболизма с использованием серина в качестве одноуглеродного источника ^23,24 . При синтезе серина из глюкозы образуется НАДН (рис.1). Следовательно, глюкоза → серин → одноуглеродный путь образования NADPH подходит только тогда, когда клетки не достигли своей максимальной емкости OxPhos. Когда клетки преодолевают свою способность OxPhos, они могут импортировать серин из среды, чтобы отделить продукцию NADH от продукции NADPH посредством одноуглеродного метаболизма. Чтобы отдать одноуглеродную единицу, серин превращается в глицин, и глицин также может отдавать одноуглеродную единицу через в системе расщепления глицина. Система расщепления глицином генерирует НАДН, и поэтому этот путь подходит только тогда, когда клетки не достигли своей максимальной емкости OxPhos.В противном случае глицин лучше выводится, чтобы избежать дополнительной продукции НАДН.

Внутриклеточный челнок: лактат-аэробный метаболизм

Лактат — это высокодинамичный метаболит, который может использоваться в качестве топлива несколькими клетками человеческого тела, особенно во время физических упражнений. Традиционно считалось, что первая стадия окисления лактата происходит в цитозоле; однако недавно эта идея подверглась сомнению. Была представлена ​​новая гипотеза, основанная на том факте, что превращение лактата в пируват не может происходить в цитозоле, поскольку характеристики фермента ЛДГ и цитозольная среда не допускают такой реакции.Вместо этого гипотеза внутриклеточного лактатного челнока утверждает, что лактат сначала попадает в митохондрии, а только потом метаболизируется. В некоторых тканях человеческого тела эта идея широко распространена, но в скелетных мышцах она довольно устойчива. В этой статье мы представим не только исследования, которые являются главными действующими лицами в этом обсуждении, но и потенциальный механизм, с помощью которого происходит это окисление, а также связь между лактатом и митохондриальной пролиферацией. Эта новая точка зрения имеет некоторые последствия и меняет наше понимание взаимодействия между энергетическими системами, поскольку продукт одной служит субстратом для другой.

1. Введение

Вопреки тому, что считалось ранее, лактат является побочным продуктом гликолиза, который может производиться и использоваться различными клетками организма в состоянии покоя и даже в условиях адекватной оксигенации [1–3]. Это очень динамичный метаболит, и его перемещение через интерстиций и кровоток работает как важный источник углерода для окисления во многих тканях [4–7] или для глюконеогенеза в печени [8, 9], особенно в ситуациях, когда требуется интенсивное физическое усилие. требуется [10, 11].Кроме того, было показано, что воздействие лактата снижает активность ферментов гексокиназы и фосфофруктокиназы (PFK) и, следовательно, гликолиз мышц в зависимости от дозы [12, 13].

В последние несколько лет были опубликованы некоторые исследования метаболизма лактата, в основном касающиеся пути его удаления внутри клетки, и возникла новая гипотеза. В отличие от традиционной точки зрения Стейнсби и Брукса [1], согласно которой преобразование лактата в пируват происходит в соседних митохондриях, гипотеза внутриклеточного лактатного челнока (ILS) в настоящее время предполагает, что эта химическая реакция происходит внутри митохондрий, точнее в митохондриях. межмембранное пространство [14, 15].

Эта новая модель требует участия некоторых белков, уже известных в динамике лактата, в частности, фермента лактатдегидрогеназы (LDH) — белка, ответственного за окисление и восстановление лактата, — и MCT1, одной из изоформ транспортера монокарбоксилата, которые присутствуют в заряд за перенос лактата между тканями. Вероятное расположение этих двух структур в митохондриях могло бы позволить реакцию окисления лактата и последующий транспорт вновь образованного пирувата в митохондриальный матрикс.Многие исследования подтверждают эту гипотезу [16–21]. Однако существуют значительные разногласия по поводу присутствия обоих белков и, следовательно, окисления лактата в митохондриальном ретикулуме, в основном в ткани скелетных мышц.

Таким образом, цель этого обзора состоит в том, чтобы (1) раскрыть все продолжающиеся дискуссии о наличии / отсутствии ILS в ключевых тканях, связанных с физической нагрузкой, (2) дать критическую оценку комплекса окисления лактата (LOX). , вероятный механизм, с помощью которого лактат используется клетками в качестве источника энергии, и (3) комментируют недавнее открытие лактата как сигнальной молекулы, а также его предполагаемую роль в митохондриальном биогенезе.Знания об этих проблемах необходимы для понимания функционирования систем энергоснабжения и того, как они взаимодействуют друг с другом для удовлетворения энергетических потребностей организма.

2. Теоретические основы

Прежде чем более подробно остановиться на теме, предложенной в этой статье, необходимо пояснить структуру и работу основных компонентов, которые играют центральную роль в ILS: LDH и MCT1.

3. Фермент лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

ЛДГ представляет собой тетрамерный фермент, состоящий из четырех субъединиц.Эти меньшие единицы, в свою очередь, могут быть двух типов: мышца (M) или сердце (H). Следовательно, различные возможные комбинации допускают существование пяти изоформ (от LDh2 до LDH5), все из которых способствуют выработке лактата [22]. Как правило, книги по физиологии или биохимии указывают на направление реакции, опосредованной ЛДГ (1), на действующую изоформу [23-25], где изоформы с преобладанием М будут действовать главным образом в образовании лактата, в то время как изоформы, демонстрирующие преобладание Н, будут способствовать реакция в обратном направлении.Однако вместо этого консервативного взгляда недавно было высказано предположение, что компартментализация клеток и ассоциация ЛДГ со специфическими клеточными структурами (например, саркоплазматическим или митохондриальным ретикулумом) могут играть важную роль в определении концентраций лактата и пирувата в каждом внутриклеточном компартменте. независимо от присутствующей ферментативной изоформы [26]. Пируват + НАДН + Н + Лактат + НАД + (1)

Такая ситуация возможна, среди прочих причин, потому что ЛДГ является почти равновесным ферментом; то есть он не регулируется аллостерически или ковалентно, а регулируется концентрациями их субстратов и продуктов [22].

4. Транспортер монокарбоксилата (MCT)

Транспорт лактата через различные ткани осуществляется семейством белков, называемых транспортерами монокарбоксилата (MCT) [14, 27–31], которые стереоспецифичны для L-лактата [32]. При таком типе транспорта каждая молекула переносится через мембрану вместе с ионом водорода (H ⁺ ), что придает МСТ довольно важную роль в регуляции pH во время упражнений [28, 33].

Что касается транспозиции лактата, в частности, несколько изоформ MCT, по-видимому, играют несколько разные функции в организме человека.Например, MCT1 и MCT4, по-видимому, являются наиболее важными конвейерами в связанном с упражнениями обмене лактата между тканями, и это особенно верно в отношении скелетных мышц. В то время как MCT4, по-видимому, связан с оттоком лактата из мышечных волокон с высокой степенью гликолиза, MCT1 связан с его поглощением для дальнейшего окисления [14, 28, 30, 31, 34–36].

Подобно тому, как семейство MCT обеспечивает перенос лактата между многими барьерами организма, эти белки также способны переносить другие формы монокарбоксилатов через клеточные мембраны, особенно пируват.Эта информация будет полезна в будущем для понимания противоречий, возникших из-за присутствия MCT1 в митохондриальном ретикулуме.

5. Внутриклеточный лактатный челнок — основные концепции

ILS был впервые предложен в 1998 г. в [10]. Общий принцип основан на том факте, что превращение лактата в пируват вряд ли может происходить в цитозоле, если (1) ЛДГ имеет высокое сродство к субстрату (т. Е. Более низкий), (2) его Vmax является наибольшим среди ферментов гликолитического пути и (3) его константа равновесия способствует реакции образования лактата [17, 18].Другими словами, как могло произойти окисление задержанной молекулы лактата в цитозольной среде, если все характеристики ЛДГ благоприятствуют реакции в противоположном направлении?

Согласно ILS, лактат является неизбежным продуктом гликолиза, который может непосредственно использоваться в качестве источника энергии митохондриями различных клеток организма, таких как поперечнополосатые мышечные клетки и нейроны, особенно в ситуациях физических упражнений. Кроме того, ILS позволяет и помогает объяснить функционирование теории лактатного челнока между клетками [11, 37], согласно которой лактат в основном образуется в клетках с высокой гликолитической способностью (например.g., мышечные волокна типа II) могут быть экструдированы во внеклеточный отсек и захвачены как печенью для глюконеогенеза, так и высокоокислительными клетками (например, мышечными волокнами типа I) для дальнейшего окисления митохондрий, в основном в субарколеммальных митохондриях мышечной ткани [3].

Несмотря на то, что митохондриальный ретикулум является общей чертой почти всех клеток млекопитающих, нам следует с осторожностью интерпретировать различные исследования, касающиеся его методов и тканей. Поэтому мы решили разделить темы по тканям, а в некоторых случаях по структуре, чтобы облегчить понимание и лучше организовать его текущий статус в литературе.

6. Сердце

Несколько исследований подтвердили мнение о митохондриальном окислении лактата миокардом. В 1988 году Герц и др. [5] были первыми, кто продемонстрировал увеличение потребления лактата волокнами сердечной мышцы во время умеренных физических нагрузок у людей. После этого Laughlin et al. [38] вводили меченые изотопами лактатные индикаторы в коронарный кровоток собак и обнаружили его включение и использование в качестве источника энергии. Однако, как заявил Брукс [39], никаких индикаторов не было ни в пируватной, ни в аланиновой формах, чего можно было бы ожидать, если бы окисление лактата происходило в цитозоле.В соответствии с этими исследованиями, прямое окисление лактата наблюдалось как на изолированных митохондриях крысы [18], так и с помощью магнитно-резонансной спектроскопии (MRS) в изолированном перфузируемом сердце крысы [40]. Кроме того, в этих клетках также была продемонстрирована компартментализация метаболизма, при этом лактат, полученный из гликолиза, преимущественно вытесняется клетчаткой, тогда как экзогенный лактат абсорбируется и доставляется в митохондрии в качестве потенциальной энергии.

Тем не менее, чтобы эта энергия была извлечена и эффективно использована, она должна иметь обязательное преобразование лактата в пируват внутри митохондриального ретикулума.Действительно, некоторые исследования сообщили о наличии ЛДГ в митохондриях сердца [18, 41, 42]. Эти исследования подтвердили первоначальные данные Бабы и Шармы [16], которые первыми продемонстрировали существование митохондриальной ЛДГ (mLDH) в этой ткани с использованием комбинированных методов иммуногистохимии и электронной микроскопии, что положило начало предположениям об участии этой органеллы в аэробный метаболизм лактата.

До сих пор только одно исследование показало, что оно противоречит ILS в сердце, потому что не удалось добиться выраженного окисления лактата в митохондриях крысы in situ [43].Однако утверждалось, что методология этой работы приводит к потере млDH во время подготовки образца и что низкие полученные значения окисления отражают небольшое количество остатков в межмиофибриллярных митохондриях, расположенных в самых глубоких частях волокна [20].

Возможно, реальное противоречие, касающееся ILS в кардиомиоцитах, — это действительный механизм, с помощью которого происходит это окисление митохондрий. В дополнение к повторной демонстрации окисления млДГ и митохондриального лактата, Brooks et al.[17] показали присутствие митохондриального MCT1 (mMCT1), что позже было воспроизведено [19]. Это открытие привело к предположению, что этот переносчик будет играть ключевую роль в окислении лактата. С другой стороны, было также высказано предположение, что система, которая включает митохондриальный лактат / пируватный антипортер (отличный от МСТ), отвечает за контроль митохондриального импорта восстанавливающих эквивалентов [42]. Однако эти более поздние результаты были связаны с неправильной интерпретацией данных [19].

Основываясь на этих выводах, кажется вполне разумным сказать, что митохондрии сердца способны окислять лактат напрямую, и, хотя есть небольшие расхождения вокруг двигателя, данные указывают на MCT1 как на оперативный переносчик митохондриального окисления лактата в этих клетках. Это позднее утверждение будет как-то усилено при анализе исследований, проведенных на других тканях тела.

7. Нейроны

Хотя нервная ткань не является основным местом удаления тела, нейронные клетки действительно могут использовать лактат в качестве источника энергии [7, 44].Следовательно, предположение о наличии ILS в головном мозге помогает поддерживать уже продемонстрированный лактатный челнок астроцит-нейрон [45], который можно резюмировать как пример лактатного челнока между клетками, но только между этими двумя нервными клетками.

Недавно с помощью иммунологического анализа было показано, что митохондрии гранулярных клеток мозжечка крысы способны окислять лактат напрямую, а также присутствие млДГ во внутреннем компартменте митохондрий [46]. Более того, с помощью электрофоретического и иммуногистохимического анализа, ¹³ C-ЯМР и ВЭЖХ было обнаружено, что mLDH действовала на окисление лактата в культурах клеток астроцитомы человека, впервые продемонстрировав способность астроцитарных митохондрий потреблять этот метаболит [47 ].Эти работы послужили основой для самых последних результатов Hashimoto et al. [21], которые предоставили in vivo и in vitro доказательств LOX — текущей модели окисления лактата митохондриями (но это может подождать позже) — и, таким образом, ILS в мозге крысы, точнее в гиппокампе, таламус и кора. Тем не менее, помимо MCT1, авторы также сообщили о присутствии изоформы MCT2 в митохондриальном ретикулуме. Учитывая эту несколько неожиданную новизну, они пришли к выводу, что LOX может быть представлен в двух формах: с MCT1 и MCT4.Это изменение может быть очень важным, поскольку обе изоформы имеют различное сродство к субстрату и, следовательно, позволяют некоторую гибкость учитывать изменения внеклеточных концентраций лактата, которые имеют место в разных ситуациях.

8. Скелетная мышца

Скелетная мышца является основным местом производства и удаления лактата в организме. В некоторых типах упражнений лактат высвобождается в кровоток лишь временно, и по прошествии определенного периода времени происходит сдвиг, и активные мышцы начинают потреблять, а не производить лактат в качестве энергетического ресурса [6].Эта ситуация возникает в основном в мышечных волокнах типа I и IIa, где основная судьба лактата — окисление (в мышечных волокнах типа IIx его основной путь удаления — гликогенез) [6, 48]. Это особенно верно во время длительных субмаксимальных упражнений, когда концентрация лактата в крови выше значений в состоянии покоя, что составляет идеальный градиент концентрации для поглощения лактата [49]. Кроме того, некоторые другие факторы определяют интенсивность потребления лактата работающими мышцами, такие как скорость метаболизма мышц, оптимальные уровни внутри- и внеклеточного pH, адекватный кровоток и уровень физической подготовки [50].

В этой конкретной ткани ILS очень полемичен. Поскольку это особенно спорная тема, мы решили разбить ее на основные части. Во-первых, будут представлены исследования, в которых предпринималась попытка получить значительное митохондриальное дыхание из лактата и было предпринято попытка определить местонахождение mLDH в митохондриальном ретикулуме. После этого мы изложим обсуждение изоформы MCT, которая действует в этом процессе, и, в конечном итоге, мы расскажем о LOX, предполагаемом механизме, с помощью которого происходит окисление лактата в митохондриях.

8.1. Окисление лактата в митохондриях и млДГ

В литературе ведутся огромные споры о том, содержат ли митохондрии изоформу ЛДГ и осуществляют ли прямое окисление лактата. Исследование предполагаемой ЛДГ в митохондриях основывается в основном на двух подходах: (i) выделение митохондриальной фракции, свободной от других клеточных компонентов, с последующим анализом дыхательной и ферментативной активности и (ii) гистология ткани с последующей совместной локализацией митохондрий и иммуномеченых ЛДГ.У каждого из этих методов есть свои подводные камни, которые могут объяснить расхождения между исследованиями, рассмотренными ниже.

Окисление лактата скелетными мышцами крысы было подтверждено анализом метаболизма субстратов, меченных углеродом. Эти данные свидетельствуют о том, что преобразование лактата в пируват происходит в митохондриях, а не в цитозоле [51]. В том же году Brooks et al. [18] показали окисление экзогенного лактата в изолированных митохондриях крысы, а также возникновение MLDH в этой ткани с использованием иммуно-мечения золотыми частицами и электронной микроскопии.Кроме того, изоформы млДГ и характер их распределения отличались от ЛДГ, обнаруженных в соседних клеточных компартментах, что, как утверждалось, исключает любую вероятную контаминацию цитозольными изоформами (хЛДГ). Подобно митохондриям сердца, эта работа подтвердила более ранние открытия Baba и Sharma [16] относительно присутствия mLDH в скелетных мышцах, а также данные Nakae et al. [52], которые продемонстрировали совместную локализацию ЛДГ с митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой у мышей и, следовательно, привели к заключению Brooks et al.[18], лактат является основным монокарбоксилатом, окисляемым митохондриями скелетных мышц in vivo , в основном при высоком соотношении лактат / пируват, как при физических упражнениях.

После этого в ряде статей оспаривалась концепция ILS, и было высказано несколько опасений по поводу потери митохондриальных компонентов и загрязнения образцов цитозольными компонентами. Во-первых, Расмуссен и др. [53] и Sahlin et al. [54] не наблюдали митохондриальное дыхание с лактатом в качестве субстрата в органеллах, выделенных из скелетных мышц крыс и человека; таким образом предполагая, что результаты Brooks et al.[18], возможно, были артефактом контаминации cLDH, которые могли остаться в митохондриальном ретикулуме во время подготовки образца. В ответ Брукс [39] представил теоретические аргументы в пользу ILS и заявил, что эти противоречащие данные могут быть связаны с методологическими различиями, такими как использование протеаз в процессе выделения митохондрий, что привело бы к потере млДГ во время подготовки. Последнее утверждение было легко опровергнуто некоторыми исследованиями [55, 56], в которых упоминались работы Ponsot et al.[43] с кожными мышечными волокнами, где не использовалась протеаза и все еще не происходило значительного митохондриального окисления лактата. Однако это утверждение было опровергнуто группой Брука, и последний результат на этот раз был связан с лечением сапонином, что также привело к потере млДГ во время процедур подготовки [20].

Кроме того, Йошида и др. Приводили и другие аргументы. [56] в попытке опровергнуть концепцию ILS. Они использовали исследование Szczesna-Kaczmarek [57], первое, которое показало прямое окисление митохондриального лактата (и другое исследование, которое показало наличие MLDH в мышцах крысы), но в следующей работе с людьми они приписали свои более ранние результаты загрязнению [58] .Кроме того, Yoshida et al. [56] обеспечили главный барьер против ILS. Они изолировали сильно окислительные и гликолитические мышечные волокна (икроножная и передняя большеберцовая мышца) от крыс и сравнили их скорости окисления лактата и пирувата. Они также исследовали, есть ли какие-либо различия в метаболической емкости между двумя митохондриальными субпопуляциями (субсарколеммальной и интермиофибриллярной) в попытке оправдать выводы Brooks et al. [18]. Среди результатов Yoshida et al.[56]: (1) незначительное окисление лактата обеими митохондриальными популяциями (от 1/31 до 1/186 пирувата), (2) чрезвычайно низкая активность ЛДГ (от 1/200 до 1/240 от активности гомогенатов цельных мышц) ) и (3) добавление экзогенного ЛДГ способствовало окислению лактата. По мнению авторов, использование пирувата на гораздо более высоких уровнях, чем лактат, согласуется с предыдущими исследованиями [43, 53, 54, 58] и отражает отсутствие mLDH и, следовательно, ILS.

Действительно, интересно, что ни одна другая группа не смогла успешно воспроизвести результаты Brooks et al.[18]. Поэтому настойчиво предполагалось, что результаты этого исследования могут отражать либо некоторую степень загрязнения цитозольной ЛДГ, либо окисление малата, а не лактата [55, 56]. Тем не менее эти намеки были отвергнуты Бруксом и Хашимото [59]. Они заявили, что наличие необходимых структур для ИЛС было продемонстрировано несколько раз и с различными методическими подходами. Кроме того, они предположили, что протеаза, использованная Yoshida et al. [56] (субтилизин A) завершился потерей основных компонентов ILS: mLDH и MCT1.

Вероятно, лечение протеазой действительно является виновником разногласий по поводу ILS на скелетных мышцах. Недавно другая исследовательская группа заявила, что воспроизвела результаты Brooks et al. [18] в предварительном анализе [60]. При использовании митохондрий икроножной мышцы кролика наблюдалось усиление флуоресценции внутримитохондриального НАД (Ф) Н. Параллельно они также сообщили о возникновении mLDH. Примечательно, что ни один из этих результатов не может быть воспроизведен при использовании протеазы.Относительно этих проблем с протеазами можно утверждать, что предполагаемая потеря mLDH при обработке ткани в присутствии протеазы означает, что mLDH находится в клеточном компартменте, легко доступном для протеазы, то есть вне внутренней митохондриальной мембраны.

MitoCarta, доступная на http://mitominer.mrc-mbu.cam.ac.uk/, указывает на протеомные исследования, которые идентифицировали ЛДГ как митохондриальный белок человека. Однако это еще не конец спора, потому что протеомный подход хорош настолько, насколько хороши неповрежденность и чистота проанализированных образцов (т.э., изолированные митохондрии). Таким образом, некоторые опасения, связанные с респираторными и ферментативными анализами, также препятствуют протеомному подходу. Тем не менее вполне вероятно, что митохондрии скелетных мышц также способны напрямую окислять лактат. Однако, с нашей точки зрения и с точки зрения других [61], только методические достижения, связанные с изоляцией митохондрий, положат конец этой дискуссии.

8.2. Митохондриальный переносчик монокарбоксилата и комплекс окисления лактата

Brooks et al.[17] локализовали митохондриальную MCT (mMCT) в двух митохондриальных субпопуляциях крыс и обнаружили, что это MCT1. Впоследствии это открытие было воспроизведено в ходе тщательного исследования [19]. Эти результаты подтвердили результаты Dubouchaud et al. [62], которые оценили влияние девяти недель тренировок на латеральную широкую мышцу бедра у людей, ведущих малоподвижный образ жизни. Они обнаружили увеличение содержания MCT1 в митохондриях, а также более высокую активность mLDH (связанную с повышенной массой митохондрий), что укрепляет идею ILS также у людей.

С другой стороны, другие исследования показали очень разные результаты [56, 63]. При этом изоформы MCT1 и MCT4 были локализованы в субарколемме, но полностью отсутствовали в интермиофибриллярных митохондриях крыс, тогда как MCT2 присутствовал в обеих субпопуляциях. Основываясь на этих результатах, Benton et al. [63] предположили, что субпопуляции митохондрий могут иметь разные метаболические возможности и что если митохондрии действительно могут окислять лактат, это, вероятно, будет класс субсарколемм.

С целью анализа расхождений в вышеупомянутых исследованиях Hashimoto et al.[14] использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) для исследования внутриклеточных доменов, занимаемых MCT в различных типах мышечных волокон скелетных мышц крыс. В результате были обнаружены только слабые сигналы для MCT2 (в сарколемме), тогда как MCT1 присутствовал во внутренней части мышечных волокон типов I и IIa, а также в субарколеммальных и интермиофибриллярных митохондриях. Впоследствии эти результаты были дополнительно усилены [20]. Кроме того, они прокомментировали обе работы, опровергающие представление о MCT1 как действующем переносчике митохондриального монокарбоксилата.Им [14, 59], Yoshida et al. [56] и Benton et al. [63] проигнорировали убедительные доказательства того, что митохондрии существуют в форме ретикулума — и это действительно так [64], и что использованная ими методология привела к разрушению митохондрий и, следовательно, к потере некоторых митохондриальных компонентов и функций, а также контаминация образцов изоформами МСТ, относящимися к другим клеточным структурам.

С этого момента представление о MCT1 как о mMCT стало сильнее, и исследования приняли новый курс.Например, Hashimoto et al. [20] использовали комбинации строгой конфокальной сканирующей микроскопии, иммунопреципитации и вестерн-блоттинга после фракционирования клеток, чтобы продемонстрировать совместную локализацию LDH, MCT1 и шаперонного белка CD147 (базигина) — белка, который предположительно закрепляет MCT1 — с митохондриальным ретикулумом. культивированных клеток L6. Метод вестерн-блоттинга показал большое количество NADH-дегидрогеназы (NADHDH), цитохромоксидазы (COX), LDH, MCT1 и CD147 в митохондриальных фракциях этих клеток, а метод иммунопреципитации показал взаимодействия с COX, MCT1 и CD147.Эти новые результаты расширили те, которые были продемонстрированы ранее [14], где уже была продемонстрирована совместная локализация MCT1 и COX в обоих митохондриальных доменах, и, таким образом, позволили группе предположить существование комплекса митохондриального окисления лактата (LOX), связанного с комплекс IV электронно-транспортной цепи на внутренней митохондриальной мембране, в котором участвуют белки MCT1, mLDH, CD147 и COX (полную схему см. [20]).

Согласно модели LOX, высокая цитозольная концентрация лактата, лактата / пирувата и H ⁺ , а также высокое соотношение лактат / пируват в этом компартменте сопоставляются с его более низкими концентрациями в матриксе митохондрий.Кроме того, в отличие от изменений, наблюдаемых в цитозоле, цепь переноса электронов относительно более окисляется во время упражнений. Эти факторы способствуют притоку лактата и, следовательно, окислению митохондрий, поскольку окружающая среда способствует удалению пирувата и H ⁺ через цикл лимонной кислоты и митохондриальную АТФазу, соответственно. Кроме того, как упоминалось ранее, характеристики ЛДГ не способствуют цитозольному окислению лактата. Итак, модельный механизм предполагает, что лактат окисляется mLDH, который, возможно, прикреплен к внешней стороне внутренней митохондриальной мембраны вместе с COX.Эта эндергоническая реакция, по-видимому, связана с экзергоническим окислительно-восстановительным изменением ЦОГ во время митохондриального транспорта электронов. Другими словами, окислительная среда СОХ способствует превращению лактата в пируват. Как только реакция произошла, новообразованная молекула пирувата могла покинуть межмембранное пространство, где она была сформирована, и транспортироваться через MCT1 в митохондриальный матрикс, чтобы катаболизироваться в процессе клеточного дыхания [15, 20, 37].

Таким образом, на основании вышеупомянутых исследований, проведенных на ткани скелетных мышц, мы можем заключить, что (1) лактат действительно может окисляться с помощью mLDH в митохондриях скелетных мышц и (2) процесс окисления использует MCT1 для последующего транспорта пирувата. в митохондриальный матрикс.Несмотря на то, что это относительно новая модель, подтвержденная лишь несколькими исследованиями, LOX заключается в вероятном механизме, с помощью которого скелетные мышцы потребляют лактат, и, таким образом, помогает объяснить, почему тренировка увеличивает выведение лактата активными мышцами, а также играет роль в накоплении лактата во время упражнений. [20, 65]. Присутствие LOX на митохондриях вполне разумно, поскольку еще одним сильным моментом является то, что его структуры были описаны в исследованиях митохондриального протеома [66, 67].

9.Роль лактата в митохондриальном биогенезе

После предложения LOX, Hashimoto et al. [68] исследовали эффекты воздействия лактата на культуры клеток L6 и обнаружили, что контакт с метаболитом, а также увеличение потребления O ₂ приводит к образованию активных форм кислорода (ROS), таких как водород. пероксид (H ₂ O ₂ ). Как следствие, начинается каскад событий, повышающий экспрессию нескольких генов, связанных с митохондриальным биогенезом, и тем самым увеличивая митохондриальную массу.Кроме того, воздействие лактата увеличивало все LOX-связанные белки. Кроме того, было также показано, что митохондрии существуют как сложная и динамичная сеть, где каждая митохондрия существует индивидуально только временно. Следовательно, баланс между скоростями слияния и деления определяет фактическую морфологию всего ретикулума [64]. По этому поводу Fan et al. [64] недавно продемонстрировали, что воздействие H ₂ O ₂ временно влияет на эти показатели, и, таким образом, предположили, что окислительный стресс может вносить вклад в индуцированную физической нагрузкой морфологию митохондрий in vivo .

Взятые вместе, эти данные опосредованной лактатом генетической стимуляции и острой модификации морфологии митохондрий демонстрируют важную роль в передаче клеточных сигналов, осуществляемой лактатом, и, следовательно, термин лактормон использовался как эпитет, поскольку он может влиять на экспрессию транспортных белков, митохондриального биогенеза и других адаптивных ответов, вызванных физической нагрузкой [15, 69].

10. Заключение

Таким образом, лактат, по-видимому, является основным монокарбоксилатом, окисляемым митохондриальной сетью in vivo , особенно в ситуациях, когда соотношение лактат / пируват высокое, например, при интенсивных физических нагрузках.Кроме того, он действует как своего рода «козырь» между тканями, движущийся гликоген, который может предоставить сырье для ресинтеза АТФ в митохондриях самых разных клеток организма. ILS включает и объясняет, как происходит этот механизм. Через ILS этот ценный метаболит может напрямую импортироваться митохондриями наиболее важных тканей, участвующих в упражнении, а затем окисляться LOX, по крайней мере, в поперечно-полосатых и нервных тканях, где существование такого механизма было продемонстрировано.Эта ситуация подразумевает, что большая часть образовавшегося лактата будет окисляться, не покидая мышцы, и даже больше, никогда не покидая продуцирующую клетку. Кроме того, было показано, что воздействие лактата приводит к генерации АФК и что этот окислительный стресс отвечает за (1) активацию нескольких генов, способствующих митохондриальному биогенезу, и (2) может даже влиять на морфологию всего митохондриального ретикулума, поскольку он вмешивается в оба скорости слияния и деления митохондрий.

В частности, в скелетных мышцах, ILS меняет наше понимание энергетических систем, а также взаимодействия, которое происходит между ними.С этой новой точки зрения, а не две относительно изолированные энергетические системы, их можно рассматривать как две независимые части одной и той же взаимосвязанной системы, потому что конечная точка одной служит топливом для другой [37, 70]. Поскольку скорости поступления АТФ из этих систем различны и по-разному регулируются, гораздо более быстрая начальная часть пути (т. фосфорилирование не может объяснить полную скорость высвобождения энергии.

Благодарность

Авторы хотели бы поблагодарить Тьяго Резенде Фигейру за его комментарии к статье. Финансирование этой работы не было получено ни от одной организации, и конфликта интересов не было.

Рост, аэробный метаболизм и потребности в растворенном кислороде эмбрионов и алевинов Steelhead, Salmo gairdneri

Цитируется по

1. Реакция на тепловой шок демонстрирует пластичность у зародыша озерного сига (Coregonus clupeaformis), подвергавшегося повторяющемуся термическому стрессу

2. Повышенная температура и осажденные отложения совместно влияют на особенности раннего периода жизни в самых южных популяциях арктического гольца.

3. Выживание, рост и развитие на ранних стадиях тропического саженца Atractosteus tropicus: критические окна развития и влияние температуры, солености и доступность кислорода

4. Дифференциальная чувствительность к потеплению и гипоксии во время развития и долгосрочные эффекты воздействия на развитие на ранних стадиях жизни Чавычь

5. Влияние повышенной температуры эмбриона во время окон развития на выживаемость, морфологию и потребление кислорода радужной форели (Oncorhynchus mykiss)

6. Влияние постоянной и циклической гипоксии на выживаемость, рост и метаболическую физиологию инкубационного атлантического лосося (Salmo salar)

7. Взаимосвязь между пиковым гипоксическим дыхательным ответом и критическим давлением O2 у личинок и взрослых рыбок данио ( Данио Рерио )

8. Температурная зависимость размера вылупившихся у озерного сига (Coregonus clupeaformis)

9. Оксигенация, выживаемость и развитие эмбрионов иглобрюхов: размер икры, размер самцов и температурные эффекты

10. Эффект аэрации и оксигенация на рост и выживаемость радужной форели в коммерческой системе с последовательным проходом и проточным каналом. Псевдакрис ипохондриака

12. Физиологические эффекты растворенного кислорода зависят от стадии инкубации атлантического лосося (Salmo salar)

13. Комбинированное воздействие тепла и гипоксии на физиологию и развитие чавычи на ранних этапах жизни

16. Ориентационные модели японских летчиков Кальмар Todarodes pacificus Эмбрионы в яичной массе и реакция параларв на свет

17. Температурные окна и кривые метаболических показателей у развивающихся антарктических рыб

18.Пример : пластичность жабр у личинок рыб

19. Размножение и жизнеспособность эмбрионов тропических пресноводных рыб с ограниченным ареалом, подверженных колебаниям гипоксии

20. Seeökosysteme III: Ökologische Nischen aquatischer Organismen im Gradienstngef , der Redox-Diskontinuität und des Sulfid-Methan-Habitats

21. Нарушение кардиореспирометрии у эмбрионов рыбок данио (Danio rerio), подвергшихся обратному потоку гидроразрыва и пластовой воде

22. Гипоксическая акклиматизация приводит к метаболической компенсации после реоксигенации в алевинах желточного мешка атлантического лосося

23. Толерантность к гипоксии и реакция на гипоксический стресс во время воспаления сердца и скелетных мышц атлантического лосося (Salmo salar)

24. Воздействие Добыча и дробление камня на характеристиках водотоков и здоровье растительности бассейна реки Дварка в Джаркханде и Западной Бенгалии, Восточная Индия

25. Температурные требования для роста, выживания и аэробных характеристик личинок метеорологической рыбы Misgurnus fossilis

26. Критические допуски растворенного кислорода для устойчивой к вихревой болезни радужной форели

27. Влияние летучей золы на морфологию русла и качество окружающей воды реки Чандрабхага в Восточной Индии

28. Материнский эффект влияния различий в размере яиц скорость метаболизма и гипоксия, вызванные вылуплением из яиц атлантического лосося: последствия для респираторного газообмена через капсулу яйца

29. Влияет ли экология разведения на отбор по признакам развития и жизненного цикла? Пример двух амбистоматид-саламандр

30. Влияние повышенной постоянной температуры инкубации и кумулятивного воздействия острого теплового шока на морфологию и выживаемость эмбрионов озерного сига (Coregonus clupeaformis)

31. Физиология развития австралийской двоякодышечной рыбы Neoceratodus forsteri

32. Критические эмбрионы : изменения температуры инкубации влияют на выживаемость, фенотип вылупления и стоимость развития озерного сига (Coregonus clupeaformis)

33. Толерантность к гипоксии европейского осетра ( Acipenser Sturio L., 1758) молодые стадии при двух температурах

34. Гипоксия-индуцируемый фактор-1 опосредует адаптивную пластичность развития толерантности к гипоксии у рыбок данио, Данио рерио

35. Развитие функции двигательных систем: переход грудных плавников между респираторной и локомоторной ролями у рыбок данио

36. Трансгенез и полиплоидия гормона роста увеличивают скорость метаболизма, изменяют кардиореспираторный ответ и влияют на экспрессию HSP в ответ на острую гипоксию у атлантического лосося ( Salmo salar ) желточный мешок алевинов

37. Влияние перенасыщенной воды общего растворенного газа на ранний период жизни шизоторацина Давида (Schizothorax davidi)

38. Химический состав воды в микросреде радужной форели Oncorhynchus mykiss эмбрионы подвержены влиянию развития, капсулы яйца и скученности

39. Кислая вода мешает симбиозу саламандры и зеленых водорослей во время раннего эмбрионального развития

40. Расчетное изменение во времени концентраций растворенного кислорода и углекислого газа в поровой воде красного морского леща, пагруса большого, скопления яиц

41. Биология и культура клоунского вьюна Chromobotia macracanthus (Cypriniformes, Cobitidae): 2- Важность движения воды и температуры во время инкубации яиц

42. Выбор места нереста во внутренних районах кижуча реки Фрейзер Oncorhynchus kisutch: находящаяся под угрозой популяция проходного лосося из заснеженного водораздела

43. Обзор факторов, влияющих на успех искусственной инкубации лососевых, и дизайн инкубатора для конкретной реки

44. Энергетика эмбрионального роста

45. Онтогенез регуляторного контроля радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ) сердце и как на это влияет хроническая гипоксия

46. Энергетическая стоимость эмбрионального развития рыб и земноводных, с акцентом на новые данные по австралийской двоякодышащей рыбе Neoceratodus forsteri

47. Стресс и размножение

48. Влияние седиментации и перифитонных сообществ на эмбриональную радужную корюшку, Osmerus mordax

49. Аэробный и анаэробный метаболизм у рыбок данио, Danio rerio, выращенных в нормоксических и гипоксических условиях и подвергшихся острой гипоксии во время развития

50. Высотная миграция американских ласточек (Cinclus mexicanus): производят ли мигранты потомство более высокого качества?

51. Супрафизиологические уровни кортизола подавляют лизоцим, но не реакцию антител у атлантического лосося Salmo salar L. после инъекции вакцины

52. Оценка влияния матери на динамику скорости метаболизма на ранних этапах развития у морской форели (Salmo trutta): индивидуальный подход

53. Абиотические условия в яйцах головоногих (Sepia officinalis): эмбриональное развитие при низком pH и высоком pCO2

54. Влияние температуры на частоту сердечных сокращений у диплоидных и триплоидных гольцов, Salvelinus fontinalis, эмбрионов и личинок

55. Глава 3 Влияние гипоксии на воспроизводство и развитие рыб

56. Концентрация кислорода в пограничном слое воды далее на эмбрионы радужной форели (Oncorhynchus mykiss) влияют время воздействия гипоксии, скорость метаболизма и расход воды

57. Распределение ресурсов у рыб, питающихся желтком

58. Имеет ли значение размер для толерантности рыб к гипоксии?

59. Дисфункция дыхания и осмотической регуляции личинок камбалы японской, пораженной вирусной эпидермальной гиперплазией

60. Почему лососевые имеют розовый цвет?

61. Онтогенетическое масштабирование метаболизма рыб в диапазоне значений массы от мыши к слону

62. Полевая оценка поступления кислорода к инкубационным эмбрионам атлантического лосося (Salmo salar)

63. Энергетика и метаболизм желтохвостой королевской рыбы (Seriola lalandi Valenciennes 1833) в процессе эмбриогенеза

64. Параметры, влияющие на растворенный кислород в пограничном слое радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ) эмбрионы и личинки

65. Кислород как сдерживающий фактор в изменении размера яиц у лососевых

66. Физиология и токсикология икры и личинок лососевых в зависимости от критериев качества воды

67. Обзор факторов, влияющих на доступность растворенного кислорода для инкубационных эмбрионов лососевых

68. Удаление хориона перед вылуплением приводит к увеличению подвижности и ускорению роста радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ) эмбрионы

69. Влияние кислорода на рост эмбрионов Oncorhynchus mykiss с хорионом и без него

70. Влияние частиц глины на кожный обмен кислорода через хорион икры атлантического лосося

71. Максимальные пределы температуры для чавычи, кижуча, кеты и стальной форели на северо-западе Тихого океана

72. Потребление кислорода в неоплодотворенных яйцах лосося: показатель качества яиц?

73. Догмы и противоречия в обращении с азотсодержащими отходами: осморегуляция во время раннего эмбрионального развития у морского ската. Раджа эринацея ; реакция на изменение внешней солености

74. Влияние насыщения воды кислородом на репродуктивную функцию Pacu Piaractus brachypomus

75. Сравнение функций яичников для содержания эмбрионов путем измерения концентрации растворенного кислорода в яичниках копулятивных и не спаривающихся яйцекладущих рыб и живородящих рыб

90 Рост и метаболизм у эмбриональной белопятнистой бамбуковой акулы, Хилосциллий плагиосум : Сравнение с эмбриональными птицами и рептилиями

77. Развитие в Salmo trutta при различных температурах, с использованием метода количественной оценки для внутривидовых сравнений

78. O 2 потребление и частота сердечных сокращений у развивающихся рыбок данио ( Данио Рерио ): влияние температуры и окружающей среды O 2

79. Температура и напряжение кислорода влияют на развитие мышечной клеточности эмбриональной радужной форели

80. Онтогенез кардиореспираторной функции в условиях хронически измененного состава газов у ​​Xenopus laevis

81. Доступность кислорода и температура влияют на развитие эмбриональной мускулатуры атлантического лосося (Salmo salar L.)

82. Физиологическая гипоксия является движущей силой сила температурного воздействия на развитие мышц эмбрионального атлантического лосося (Salmo salar L.)?

83. Онтогенетическое изменение взаимосвязи между скоростью метаболизма и массой тела у морского леща Pagrus major (Temminck & Schlegel)

84. Влияние температуры на использование запасов эндогенной энергии во время эмбрионального развития диплоидной и триплоидной радужной форели (Salmo gairdneri R.)

85. Значения кислородной проводимости и структурные характеристики капсул яйца тихоокеанских лососевых

86. Комбинированное воздействие перенасыщения газом и уровней растворенного кислорода на икру, личинки и мальков стальной форели (Salmo gairdneri)

Влияние кислорода на метаболическое развитие: химиоинформатическое исследование

Цитата: Jiang YY, Kong DX, Qin T, Ли X, Caetano-Anollés G, Zhang HY (2012) Влияние кислорода на метаболическую эволюцию: хемоинформатическое исследование.PLoS Comput Biol 8 (3): e1002426. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002426

Редактор: Рубен Валас, JCVI, Соединенные Штаты Америки

Поступило: 19 сентября 2011 г .; Принята к печати: 27 января 2012 г .; Опубликовано: 15 марта 2012 г.

Авторские права: © 2012 Jiang et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано Национальной программой фундаментальных исследований Китая (гранты 2010CB126100 и 2012CB721000), Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 30870520, 21075046 и 21173092), Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов ( гранты 2011PY142 и 2011PY027), а также Национальный научный фонд (грант MCB-0749836 GCA). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Накопление биологических и геологических данных показывает, что кислород оказал большое влияние на биологическую эволюцию [1] — [3]. Атмосфера и моря нашей планеты были анаэробными ∼3 миллиарда лет назад [4] — [6], в то время как жизнь еще не была разнообразной [7]. Однако повышение уровня кислорода в атмосфере спровоцировало, по крайней мере, появление эукариот [7]. Позднее в эволюции молекулярный кислород продолжал играть решающую роль.Например, существенное повышение содержания кислорода в атмосфере 750 миллионов лет назад, вероятно, стало причиной кембрийского взрыва разнообразия животных [8], [9]. Повышение содержания кислорода в атмосфере в течение девона также совпало с излучением наземных растений и крупных хищных рыб [10]. Наконец, повышение уровня кислорода за последние 205 миллионов лет могло привести к увеличению размеров тела животных [11].

Выяснение молекулярной связи между появлением кислорода и биологической эволюцией было одной из самых сложных тем в эволюционной биологии.Прямое объяснение этой связи состоит в том, что аэробное дыхание намного более эффективно, чем анаэробное дыхание, по выработке АТФ [12]. Недавний анализ эволюции белковых структур показал, что кислород в значительной степени расширил структурное пространство белка [2], [3]. Это подразумевает сопутствующее расширение их химического и функционального пространства. Действительно, 100 000 симуляций метаболических сетей в анаэробных или аэробных условиях показали, что молекулярный кислород активировал более 1000 метаболических реакций, чем реакции в его отсутствие [13].Хотя небольшая часть этих аэробных реакций имеет анаэробные аналоги, большинство из них являются новыми и приводят к появлению новых наборов метаболитов. Все реакции с потреблением кислорода необратимы [14]. Следовательно, аэробные реакции термодинамически более эффективны [15]. Однако влияние кислорода на метаболическую эволюцию выходит за рамки термодинамических соображений. В частности, новые аэробные метаболиты могут демонстрировать некоторые функциональные новшества, которые могут дать важные ключи к пониманию влияния глобальной оксигенации на биологическую эволюцию.

Поскольку метаболиты представляют собой небольшие молекулы, а метаболические реакции — это в основном химические реакции, их лучше всего проанализировать с помощью химиоинформатики [16] — [18], дисциплины, посвященной хранению, управлению, анализу, распространению и использованию химической информации. Здесь мы используем химиоинформатические методы для проведения всестороннего сравнительного анализа химических структур, свойств и реакций анаэробных и аэробных метаболитов. Наши результаты показывают, как кислород оказал влияние на метаболическую эволюцию в химическом пространстве, и дают новое понимание взаимосвязи между повышением уровня кислорода и биологической эволюцией.

Результат / Обсуждение

Профили анаэробных и аэробных метаболических сетей

Аэробные и анаэробные метаболические сети, смоделированные Раймондом и Сегре, состоят из 1145 анаэробных и 454 аэробных реакций, из которых можно идентифицировать 1326 анаэробных метаболитов и 538 аэробных метаболитов [13]. Источники этих метаболических реакций разнообразны, около 50% аэробных реакций специфичны для эукариот. Многие из них типичны для животных и растений.Хотя большая часть биологического разнообразия является микробной и может, таким образом, включать систематическую ошибку выборки в исследуемых нами метаболитах, исследование функциональных аннотаций белковых структур почти в тысячах секвенированных геномов показывает, что паттерны ферментативного разнообразия в значительной степени сохраняются на протяжении всей жизни [19]. . Большая часть протеомного репертуара была потрачена на метаболические процессы, но, за некоторыми исключениями, общие метаболические функции были в высокой степени сохранены у всех организмов архей, бактерий и эукарий.Следовательно, мы не ожидаем, что систематическая ошибка выборки, существующая в наборе ферментативных методов, сделает недействительными основные выводы нашего исследования.

Анализ структуры метаболической сети показывает наличие некоторых преобладающих модулей в аэробных и анаэробных путях. Например, 48 и 19 основных модулей составляют 80,2% и 80,8% анаэробных метаболитов и аэробных метаболитов соответственно (таблицы S1 и S2). Анализ метаболических реакций смоделированных сетей показывает, что 81 исходный реагент для 48 основных анаэробных модулей участвует в среднем в 8.1 реакции (Таблица S1). Для сравнения, 23 исходных реагента для 19 основных аэробных модулей участвуют в среднем только в 3,4 реакциях, и эти реагенты далеки от анаэробных центральных метаболитов (среднее расстояние 8,7 реакций) (Таблица S2). Это говорит о том, что реакции в анаэробных путях обычно начинаются из центра метаболических сетей. Напротив, кислородзависимые пути обычно начинаются с периферии анаэробной сети, что согласуется с предыдущими наблюдениями (Рисунок S1) [13].

На уровне белка предыдущие исследования показали, что по крайней мере 31 кратность используется исключительно аэробными ферментами, большинство из которых (90%) явно используют кислород [2]. Сравнение активности ферментов показало, что оксидоредуктазы преобладают в аэробных, но не анаэробных ферментах (рис. 1). Это ожидаемо, поскольку кислород предпочитает участвовать в окислительно-восстановительных реакциях. Поскольку одной примечательной особенностью оксидоредуктаз является их зависимость от кофакторов для выполнения окислительно-восстановительных реакций, мы проанализировали использование кофакторов для 154 анаэробных и 121 аэробных оксидоредуктаз (Таблица 1).В анаэробных ферментах органические кофакторы (, например, , NAD (H), NADP (H) и FAD) были более распространены, чем металлические аналоги (, например, , железо, медь и молибден), тогда как в аэробных ферментах металлические окислительно-восстановительные кофакторы были более популярным. Это отражает низкую биодоступность меди и молибдена в анаэробном мире [20] — [22], а также согласуется с предыдущими выводами о том, что примитивные окислительно-восстановительные ферменты (которые являются анаэробными ферментами) в основном использовали в катализе органические кофакторы [23]. Более того, хотя НАД (H) более распространен, чем НАДФ (H) в анаэробных ферментах, обратное верно для аэробных ферментов (Таблица 1).Это наблюдение особенно актуально, поскольку изоцитратдегидрогеназы имеют тенденцию генерировать НАДФ (H), а не НАД (H), при адаптации к окружающей среде с ацетатом [24]. Поскольку обилие ацетата было связано с повышением содержания кислорода [25], преобладание НАДФ (H) в аэробных ферментах, вероятно, является результатом эволюции с участием кислорода.

Таким образом, анаэробные и аэробные метаболические сети заметно отличаются и должны иметь заметные различия в своем химическом пространстве. Сюда входят структурные, химические и реакционные свойства их метаболитов.

Влияние кислорода на метаболическую эволюцию в структурном пространстве

Чтобы изучить влияние кислорода на метаболическую эволюцию в структурном пространстве, мы сначала рассчитали каркасы (химические ядра) для 1174 анаэробных метаболитов и 520 аэробных метаболитов с четко определенной структурой. Поскольку разные молекулы могут иметь один и тот же каркас, каркасы намного более консервативны, чем общие химические структуры [26]. Наши расчеты показывают, что 204 каркаса используются 1174 изученными нами анаэробными метаболитами.Это составляет в среднем 0,174 каркаса на анаэробный метаболит. В свою очередь, 165 каркасов используются 520 аэробными метаболитами, что составляет в среднем 0,317 каркасов на аэробный метаболит. Поскольку оба типа метаболитов имеют только 34 каркаса, аэробный метаболизм приводит к появлению большого количества (> 130) новых каркасов, и они больше представлены в его метаболических реакциях. В частности, наиболее распространены стероидные, хинолиновые и флавоноидные каркасы (рис. 2).

Чтобы интуитивно проиллюстрировать расширение структурного пространства аэробного метаболизма, мы построили «структурную карту кластера», состоящую из анаэробных и аэробных метаболитов.Эта карта представляет собой двумерный график рассеяния, который характеризует структуры структурного сходства соединений. На этой карте каждое соединение представлено точкой, и положение точки определяется ее сходством Танимото с другими соединениями (на основе общих субструктурных фрагментов) [27]. Подобные соединения расположены близко друг к другу на карте, а разнородные структуры находятся далеко друг от друга. Более того, аналогичные соединения (с подобием Танимото> 0,85) [28], [29] объединяются в кластеры (количество кластеризованных членов представлено размером точки).Кластерная карта для аэробных и анаэробных метаболитов (рис. 3) показывает, что анаэробные соединения (представленные синими точками) доминируют в нижней части карты, в то время как аэробные соединения (представленные красными точками) занимают центральную и верхнюю часть изображения карты. Очевидно, это указывает на то, что кислород значительно расширил структурное пространство метаболитов.

Рис. 3. Структурная кластерная карта анаэробных и аэробных метаболитов (представлена ​​синими и красными точками, соответственно).

На этой карте расстояние между двумя соединениями определяется их сходством Танимото (на основе общих субструктурных фрагментов). Подобные соединения объединяются в кластеры. Размер точки указывает количество сгруппированных соединений (с подобием Танимото> 0,85). Самые большие точки представляют собой кластеры, содержащие более 10 подобных соединений. Некоторые репрезентативные соединения для основных кластеров представлены вокруг карты.

https://doi.org/10.1371 / journal.pcbi.1002426.g003

Анализ основных кластеров (большие точки) анаэробных и аэробных метаболитов (рис. 3) показывает, что анаэробные молекулы в основном состоят из каркасов аминокислот, пиримидиновых и пуриновых нуклеотидов, сахаридов, гликозилов. фосфаты и фолиевая кислоты, которые почти все являются первичными метаболитами и необходимы для основных клеточных функций. Для сравнения, аэробные молекулы в основном включают стероиды, дитерпеноиды (, например, , гиббереллины), полифенолы ( e.грамм. , флавонолы и фенилпропаноиды), алкалоиды (, например, , берберины) и макроциклические лактоны (, например, , авермектины), большинство из которых являются вторичными метаболитами и важны для аспектов жизни, которые, как известно, происходят эволюционным путем, таких как трансмембранные экспорт и импорт (стероиды), передача сигналов (стероиды, дитерпеноиды и полифенолы), защита от биотических факторов (алкалоиды и макроциклические лактоны) и защита организма от окисления (полифенолы).

Влияние кислорода на метаболическую эволюцию в химическом пространстве

Чтобы изучить влияние кислорода на метаболическую эволюцию в химическом пространстве, некоторые обычно используемые дескрипторы химических свойств были рассчитаны для анаэробных и аэробных метаболитов (таблица 2). Поскольку модели распределения свойств в наборах данных метаболитов далеки от нормы (рис. S2), были рассчитаны как медианные, так и средние значения для этих дескрипторов.

Хотя анаэробные и аэробные метаболиты схожи по некоторым объемным характеристикам, таким как молекулярная масса, общая площадь молекулярной поверхности и общий молекулярный объем, они сильно различаются по другим свойствам (таблица 2).Во-первых, аэробные метаболиты содержат больше атомов, чем анаэробные соединения. Примечательно, что аэробные метаболиты содержат больше атомов углерода, но меньше атомов кислорода, азота и фосфора, чем последние. Низкое содержание кислорода в аэробных метаболитах, по-видимому, нарушает интуицию. Однако тот факт, что большинство атомов кислорода в биологических молекулах происходят не из молекулярного кислорода, а из воды и углекислого газа, помогает объяснить эту аномалию. Высокое содержание фосфора в анаэробных метаболитах соответствует преобладанию в этих молекулах фосфатной группы [3].Поскольку кислород, азот и фосфор обычно образуют полярные связи с другими атомами, в то время как связи с участием атомов углерода всегда неполярны, мы делаем вывод, что анаэробные метаболиты более полярны, чем аэробные соединения. Это подтверждается тем фактом, что анаэробные метаболиты имеют более низкий логарифм коэффициента распределения, большую площадь полярной молекулярной поверхности и полярный объем, больше доноров / акцепторов водородных связей и менее гидрофобных фрагментов и ароматических колец (Таблица 2). Во-вторых, кажется, что анаэробные метаболиты с конформационной точки зрения более гибкие, чем аэробные молекулы, потому что первые имеют больше вращающихся связей и содержат меньше колец (включая ароматические кольца), чем вторые.

Чтобы проиллюстрировать разницу между обоими видами метаболитов в химическом пространстве, был проведен факторный анализ дескрипторов химических свойств. Первые два фактора, которые могут объяснить 78,6% дисперсии, были извлечены с помощью анализа главных компонент и повернуты методом Varimax [30]. Картина распределения аэробных метаболитов (красным) в двумерном химическом пространстве, определяемом этими двумя факторами, явно отличается от такового анаэробных соединений (синим цветом) (Рисунок 4).Аэробные молекулы занимают относительно верхнюю и левую часть пространства. Анаэробные молекулы концентрируются в относительно нижней части. Из нормированных факторных нагрузок Varimax (Таблица S3) мы можем найти, что первый фактор объясняет 40,4% дисперсии и содержит высокие нагрузки (> 0,85) из свойств, связанных с полярностью (, т.е. , площадь полярной молекулярной поверхности и полярный объем, количество акцепторов водородной связи и количество атомов кислорода) (выделено жирным шрифтом). Для сравнения, второй фактор, объясняющий 38.2% дисперсии, содержит важные вклады (с нагрузками> 0,85) от структурных свойств (, т.е. , количество атомов углерода, количество гидрофобных фрагментов и общее количество связей и атомов) (жирным шрифтом, таблица S3). Эти высоконагруженные дескрипторы воплощают основные различия между анаэробными и аэробными метаболитами (таблица 2). Таким образом, мы пришли к выводу, что кислород значительно расширил химическое пространство метаболитов, в основном за счет повышения гидрофобности и жесткости метаболитов. Чтобы проверить надежность этого вывода, мы проверили последнюю версию KEGG (60.0) и идентифицировали 486 аэробных реакций, которые явно используют кислород, но не были доступны для моделирования в наборе данных Раймонда и Сегре (Таблица S4). Эти реакции содержат 440 продуктов, из которых 384 могут быть учтены в расчетах. Примечательно, что новые аэробные метаболиты демонстрируют полярность (со средним значением AlogP98 2,18) и жесткостью (со средним количеством вращающихся связей 5,92 и средним количеством колец 2,08), которые были аналогичны зарегистрированным ранее (Таблица 2). Таким образом, на наши выводы об особенностях химических свойств аэробных метаболитов экспансия KEGG не оказывает значительного влияния.

Рис. 4. Химическое пространство анаэробных и аэробных метаболитов, определяемое первыми двумя факторами из анализа 20 дескрипторов.

Аэробные метаболиты (синим цветом) преимущественно занимают левую и верхнюю части пространства, в то время как анаэробные метаболиты (показаны красным) концентрируются в относительно нижней части. Кислород, по-видимому, очень помог метаболизму в исследовании более широкого химического пространства.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002426.g004

Примечательно и любопытно, что различия в полярности аэробных и анаэробных метаболитов оставили отпечаток в составе остатков соответствующих ферментов.Поиск в Атласе каталитических сайтов (CSA) [31] показал, что использование аминокислотных остатков, которые существуют в каталитических сайтах 453 анаэробных и 257 аэробных ферментов, было значительно смещено. Примечательно, что анаэробные ферменты чаще используют полярные аминокислотные остатки (, например, , Asp, Glu, Lys и Arg) в каталитических сайтах ( P, <0,05), тогда как аэробные ферменты используют неполярные остатки (, например, , Trp и Иль) чаще ( P <0,05) (рисунок 5). Таким образом, паттерны полярности каталитических остатков соответствуют паттернам полярности аэробных и анаэробных метаболитов.

Рис. 5. Аминокислотный состав каталитических центров анаэробных (синий) и аэробных (красный) ферментов.

Видно, что анаэробные ферменты чаще используют полярные аминокислотные остатки (, например, , Asp, Glu, Lys и Arg) в каталитических сайтах ( P <0,05), в то время как аэробные ферменты используют неполярные остатки ( например, , Trp и Ile) чаще ( P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002426.g005

В процессе эволюции метаболические сети расширяются по мере того, как клетке становятся доступны новые химические вещества и ферменты [32].Поэтому мы исследовали, как химическое пространство метаболитов изменилось во время расширения анаэробных сетей. Масштабный филогеномный анализ метаболизма, основанный на анализе доменной структуры белка, выявил 163 самых древних фермента (с относительным возрастом ≤0,05 по шкале от 0 до 1, где 0 — самый древний) [33]. Из метаболических реакций, связанных с этими ферментами, мы выбрали набор из 236 метаболитов, которые содержатся в настоящем наборе данных анаэробных метаболитов, большинство из которых являются основными строительными блоками жизни, такими как аминокислоты, пиримидин и пуриновые нуклеотиды, сахариды, гликозилфосфаты. и порфирины.Эти соединения можно рассматривать как рано появляющиеся анаэробные метаболиты, а остальные 938 следует рассматривать как поздно появляющиеся анаэробные аналоги. Ранние метаболиты занимают правую и нижнюю часть химического пространства (рис. 6). Таким образом, первый фактор может различать возраст метаболитов, указывая на то, что химические различия между ранними и поздними метаболитами обусловлены свойствами, связанными с полярностью. Это подтверждается прямым сравнением двадцати проанализированных нами дескрипторов химических свойств, которое также указывает на то, что ранние анаэробные метаболиты намного более полярны, чем их поздние аналоги (Таблица S5).Сильная полярность ранних анаэробных метаболитов совпадает с недавними открытиями в метаболоме дрожжей [34], которые хорошо согласуются с широко распространенным представлением о том, что океаны являются колыбелью жизни. Взятые вместе, наши результаты показывают, что во время метаболической эволюции метаболиты в целом становились все менее и менее полярными, лучше удовлетворяя требованиям для модуляции мембранных функций и выполнения межклеточных коммуникаций, существующих в сложной жизни [35].

Рис. 6. Химическое пространство анаэробных метаболитов, определенное первыми двумя факторами из анализа 20 дескрипторов, показывающее, что ранние анаэробные метаболиты (выделены пурпурным цветом) преимущественно занимают правую и нижнюю части пространства.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002426.g006

Влияние кислорода на развитие метаболических реакций

Химические свойства аэробных метаболитов поднимают интересный вопрос. В реакциях оксигенации обычно вводятся гидроксильные группы, которые являются донорами / акцепторами водорода и гидрофильны. Учитывая этот факт, как мы можем объяснить наблюдение, что аэробные метаболиты содержат меньше доноров и акцепторов водорода и более гидрофобны, чем анаэробные соединения? Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали особенности, описывающие анаэробные и аэробные метаболические реакции.

На основании метаболических карт KEGG 1114 анаэробных реакций (охватывающих 938 анаэробных метаболитов) и 630 аэробных реакций (охватывающих 480 аэробных метаболитов) были определены как необратимые. Во время заданий «усиленные реакции», определенные в исх. 13 не рассматривались. Мы извлекли 1342 пары анаэробных реакций и 656 пар аэробных реакций из этих необратимых реакций, отбросив кофакторы и метаболиты ферментов с молекулярной массой <70 Да. Затем мы рассчитали чистые изменения (от реагентов к продуктам) для некоторых свойств, связанных с полярностью, и усредненными значениями (таблица 3).Примечательно, что продукты анаэробных метаболических реакций обычно менее полярны. Это подтверждает наши предыдущие наблюдения, что полярность метаболитов снижается во время расширения анаэробной сети. Напротив, тенденция изменения полярности в аэробных метаболических реакциях противоположна таковой в анаэробных реакциях. Эта тенденция согласуется с особенностями реакций оксигенации, которые обычно добавляют к продуктам гидроксильные группы. Однако эта тенденция не может объяснить, почему аэробные метаболиты менее полярны, чем анаэробные соединения.Принимая во внимание тот факт, что кислородзависимые пути в основном начинаются с периферии анаэробной метаболической сети, тогда как анаэробные реакции обычно начинаются из центра сети (как указано выше) [13], мы предполагаем, что ответ на этот вопрос может лежат в разных отправных точках аэробных и анаэробных метаболических реакций.

Наш расчет показывает, что средний логарифм коэффициента распределения (AlogP98) исходных анаэробных реагентов (-1,63) (Таблица S1) намного ниже, чем у исходных аэробных реагентов (2.75) (Таблица S2). Это говорит о том, что аэробные метаболиты менее полярны из-за гидрофобных исходных точек. Это объяснение четко представлено тенденциями изменения полярности путей биосинтеза стероидов и дитерпеноидов, двух представителей аэробных модулей (рис. 7). Из рисунка видно, что по мере развития анаэробных реакций полярность метаболитов неуклонно снижается до минимума (с AlogP98, равным 11,33). Напротив, полярность аэробных метаболитов увеличивается (в среднем AlogP98 составляет 4.05) с расширением аэробных сетей, но все еще слабее, чем у анаэробных метаболитов (со средним значением AlogP98 1,31).

Рис. 7. Тенденции изменения полярности путей биосинтеза стероидов и дитерпеноидов.

Каждый метаболит обозначен точкой. Синие линии соединяют анаэробные метаболиты (слева), а красные линии — аэробные метаболиты (справа). Дескриптор полярности метаболита (AlogP98) обозначен разными цветами, от синего (сильная полярность) до красного (сильная неполярность).Полярность метаболитов неуклонно снижается до минимума по мере развития анаэробных реакций (слева направо). Напротив, полярность аэробных метаболитов увеличивается с расширением аэробных сетей, но в среднем все еще слабее, чем у анаэробных метаболитов.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002426.g007

Таким образом, настоящий хемоинформатический анализ показывает два основных воздействия кислорода на метаболическую эволюцию, происходящую в химическом пространстве.Во-первых, новые типы реакций аэробного метаболизма включают в себя большое количество новых молекулярных каркасов. В частности, эпоксидирование сквалена кислородом и последующие кислородзависимые реакции генерируют ряд стероидов, которые являются наиболее популярными каркасами в аэробных метаболитах. Поскольку гидроксильная группа непосредственно присоединена к кольцевой структуре в C3, полярная структура стероидов контрастирует с их анаэробными аналогами, гопаноидами. Такое расположение позволяет стероидам играть решающую роль в эндо- и экзоцитозе одноклеточных и многоклеточных эукариот [36].Поскольку сложные организмы во многом зависят от сложных трансмембранных процессов экспорта и импорта, изобретение стероидов посредством аэробного метаболизма представляет собой ключевой шаг в переходе от прокариот к эукариотам, ответственного за многоклеточность и высшие организмы [37]. Во-вторых, аэробные метаболические реакции начинаются с сильных гидрофобных субстратов, а аэробные метаболиты в среднем менее полярны, чем анаэробные соединения. Это делает аэробные метаболиты более пригодными для прохождения через мембраны и в качестве лигандов ядерных рецепторов [35].Эти лиганды являются частью ядерной сигнальной системы, которая имеет решающее значение для функционирования сложных организмов. Хотя некоторые кислородзависимые реакции могут происходить без кислорода, аэробные реакции термодинамически более эффективны, чем анаэробные аналоги [15]. Это особенно важно для реакций, начинающихся с гидрофобных молекул, поскольку гидрофобные метаболиты имеют относительно низкие клеточные концентрации и, следовательно, менее биодоступны [18], [34]. Взятые вместе, можно сделать вывод, что кислород позволяет метаболизму эффективно исследовать более широкое структурное и химическое пространство, что определенно помогает повысить сложность клеточной организации.

Методы

Обработка данных

Метаболические сети, смоделированные Раймондом и Сегре (http://prelude.bu.edu/O2/networks.html), состоят из 1326 анаэробных метаболитов (синие узлы) и 538 аэробных метаболитов (красные узлы) [13]. Из них мы собрали 1174 анаэробных метаболитов и 520 аэробных метаболитов с четко определенной структурой (без R-группы или полимерной формы) следующим образом. Во-первых, для многокомпонентных записей мелкие фрагменты (противоионы в солях, молекулы растворителя) удалялись, и оставались только самые крупные фрагменты.Во-вторых, атомы водорода были добавлены для заполнения валентностей тяжелых атомов и нейтрализации молекулярных зарядов. Наконец, для всех соединений были созданы трехмерные структуры. Эти операции были выполнены с помощью Pipeline Pilot (версия 8.5, SciTegic Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Расчет структурных и химических свойств

Молекулярные каркасы были созданы с помощью метода Мурко [38]. Каркасы определяются как непрерывные кольцевые системы плюс цепи, которые их связывают, и были идентифицированы с помощью компонентов «Генерация фрагментов» в Pipeline Pilot, во время которых сохранялись экстрациклические двойные связи и двойные связи линкеров.

Коэффициент Танимото (TC) широко используется для характеристики структурного подобия молекул [27] — [29]. TC определяется следующим образом: где N _a и N _b — это количество битов, установленных для двоичных отпечатков пальцев молекул A и B, соответственно, а N _c — это установленные биты, которые A и B имеют общее. Структурная карта кластера была создана с помощью Benchware DataMiner (версия 1.6. Tripos Associates Inc. Сент-Луис, Миссури.), приняв параметры по умолчанию. Порядок построения следующий. Сначала мы провели анализ основных компонентов субструктурных отпечатков (2D-фрагменты UNITY, встроенные в Benchware DataMiner) и использовали первые два компонента в качестве начальных координат для первой партии соединений (случайно выбранных из набора данных). Во-вторых, все соединения были добавлены к графику уже спроектированных соединений с использованием сходства Танимото общих субструктурных фрагментов UNITY 2D. Подобные соединения (с подобием Танимото> 0.85) были объединены в кластеры. Наконец, расстояния за горизонтом сжались. Метод нелинейного картирования (NLM) использовался для минимизации общей дробной ошибки и сохранения фактических расстояний во многих измерениях при построении чертежей в меньших размерах.

Обычно используемые дескрипторы химических свойств, включая молекулярную массу, общую площадь молекулярной поверхности, общий молекулярный объем, общее количество атомов, полярную площадь молекулярной поверхности, полярный молекулярный объем, количество акцепторов H-связи, количество доноров H-связи, количество гидрофобных фрагментов, Количество колец, общее количество связей, количество вращающихся связей и количество хиральных центров рассчитывали с помощью Sybyl 7.0. Количество атомов углерода, количество атомов кислорода, количество атомов азота, количество атомов серы, количество атомов фосфора и количество ароматических колец были рассчитаны с помощью Pipeline Pilot. Логарифм коэффициента разделения (AlogP98) был рассчитан с помощью Cerius 2 (версия 4.11L, Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния). Все статистические анализы были выполнены с помощью SPSS (версия 15.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс).

Анаэробный метаболизм: связи с следовыми газами и аэробными процессами

Абстрактные

Жизнь развивалась и процветала в отсутствие молекулярного кислорода (O2).Когда около двух миллиардов лет назад содержание O2 в атмосфере выросло до нынешнего уровня 21%, анаэробный метаболизм постепенно вытеснялся аэробным. Анаэробная среда сохранилась на Земле, несмотря на преобразование в окисленное состояние из-за комбинированного воздействия воды и органических веществ. Молекулярный кислород диффундирует через воду примерно в 104 раза медленнее, чем через воздух, а органическое вещество поддерживает большую биотическую потребность в O2, которая расходует запасы быстрее, чем заменяется диффузией.Такие условия существуют в водно-болотных угодьях, реках, эстуариях, прибрежных морских отложениях, водоносных горизонтах, колоннах бескислородной воды, очистителях сточных вод, свалках, кишечных трактах животных и рубцах травоядных. Анаэробные микросайты также встроены в кислородную среду, такую ​​как почва на возвышенностях и столбы морской воды. Заметная скорость аэробного дыхания ограничена областями, которые находятся в прямом контакте с воздухом или населены организмами, производящими O2. Повышение атмосферного O2 сокращает глобальную площадь анаэробной среды обитания, но увеличивает общую скорость анаэробного метаболизма (по крайней мере, на определенной территории). базис) за счет увеличения количества доноров и акцепторов электронов.Резко увеличилось производство органического углерода, окисленных форм азота, марганца, железа, серы и многих других элементов. В современных анаэробных экосистемах почти вся восстанавливающая способность происходит за счет фотосинтеза, и большая часть ее в конечном итоге возвращается к O2, наиболее электроотрицательному акцептору электронов, которого много. Этот фотосинтетический окислительно-восстановительный градиент тщательно используется аэробными и анаэробными микроорганизмами для обмена веществ. То же самое можно сказать о гидротермальных жерлах (Tunnicliffe, 1992) и некоторых глубоких подземных средах (Chapelle et al., 2002), где тепловая энергия является основным источником восстанавливающей силы. Хотя анаэробные среды обитания в настоящее время составляют небольшую часть площади поверхности Земли, они оказывают глубокое влияние на биогеохимию планеты. Это очевидно из наблюдения, что содержание O2 и Ch5 в атмосфере Земли находится в крайне неравновесном состоянии (Sagan et al., 1993). Сочетание высокой аэробной первичной продукции и бескислородных отложений обеспечило большие залежи ископаемого топлива, которое стало жизненно важным и спорным источником энергии для современных индустриальных обществ.Анаэробный метаболизм отвечает за изобилие N2 в атмосфере; в противном случае N2-фиксирующие бактерии уже давно потребили бы большую часть пула N2 (Schlesinger, 1997). Анаэробные микроорганизмы — обычные симбионты термитов, крупного рогатого скота и многих других животных, способствующие пищеварению. Химический состав питательных веществ и загрязняющих веществ сильно изменяется из-за восстановленных условий, преобладающих в водно-болотных угодьях и водных экосистемах. В этом обзоре анаэробного метаболизма подчеркивается аэробное окисление, поскольку эти два процесса нельзя разделить при полном рассмотрении этой темы.Он ориентирован на процесс и выделяет удивительные микроорганизмы, которые участвуют в анаэробной биогеохимии. Мы начнем этот обзор с краткого обсуждения ассимиляции CO2 автотрофами, источника большей части восстанавливающей силы на Земле, а затем рассмотрим биологические процессы, которые используют эту потенциальную энергию. Высвобождение энергии начинается с разложения органических макромолекул до относительно простых соединений, которые дополнительно упрощаются ферментацией. Следующим рассматривается метаногенез, потому что Ch5 является продуктом ацетатной ферментации и, таким образом, завершает катаболизм органического вещества, особенно в отсутствие неорганических акцепторов электронов.Наконец, организмы, которые используют азот, марганец, железо и серу в качестве концевых акцепторов электронов, рассматриваются в порядке уменьшения выхода свободной энергии реакций.

Обзор аэробики | BioNinja

Навык:

• Анализ диаграмм путей аэробного дыхания для определения мест, где происходят декарбоксилирование и окисление

реакции

Аэробное дыхание включает расщепление глюкозы в присутствии кислорода с образованием воды и углекислого газа

• Оно требует участия митохондрий и генерирует большой выход АТФ (обычно 36 АТФ на потребляемую глюкозу)
• Аэробное дыхание может включать следующие процессы: гликолиз, реакция звена, цикл Кребса, цепь переноса электронов

Уравнение аэробного дыхания

Типы аэробных реакций

Аэробное дыхание включает три основных типа реакций — декарбоксилирование, окисление и фосфорилирование

• В следующей таблице эти реакции организованы в соответствии с различными стадиями аэробного дыхания
  

Декарбоксилирование :

• Атомы углерода удаляются из органической молекулы (глюкозы) с образованием углекислого газа
• Аэробное дыхание включает полное сгорание глюкозы (6C) — так образуется шесть молекул CO ₂

Окисление :

• Электроны и ионы водорода удаляются из глюкозы и поглощаются переносчиками водорода (NADH и FADH ₂ )
• Носители водорода, в свою очередь, окисляются в цепи переноса электронов (где энергия используется для производства АТФ)
• Затем электроны и ионы водорода поглощаются кислородом ( восстановление ) с образованием молекул воды
• Производятся двенадцать переносчиков водорода, поэтому требуется шесть молекул кислорода (12 × O = 6 × O ₂ )

Фосфорилирование :

• Энергия, выделяемая при распаде глюкозы se используется для фосфорилирования АДФ с образованием АТФ
• A net Всего четыре молекулы АТФ продуцируются непосредственно посредством фосфорилирования на уровне субстрата
• Оставшийся АТФ продуцируется косвенно через цепь переноса электронов ( окислительное фосфорилирование )

Краткое описание этапов аэробного дыхания

Производство АТФ

Аэробное дыхание обычно производит всего 36 АТФ на молекулу потребленной глюкозы

• Итого 2 АТФ производятся при гликолизе посредством фосфорилирования на уровне субстрата (четыре образуются, но два потребляются)
• Еще 2 АТФ производятся аналогичным образом в цикле Кребса (один АТФ за цикл — два цикла происходят на молекулу глюкозы)
• Наконец, 32 АТФ продуцируются в цепи переноса электронов с использованием энергии переносчиков водорода (окислительное фосфорилирование)

Носители водорода производят разное количество АТФ в зависимости от того, где они отдают электроны транспортной цепи.

• Молекулы НАДН, расположенные в матрице, отдают электроны в начало цепи и производят 3 АТФ на переносчик водорода
• Цитозольный НАДН (в результате гликолиза) отдают электроны позже в цепочке и производят только 2 АТФ на переносчик водорода
• FADH ₂ также отдает электроны позже в цепи и поэтому производит только 2 АТФ на переносчик водорода

Окислительное фосфорилирование: (8 × матричный НАДН) + (2 × цитозольный НАДН) + (2 × FADH ₂ ) = (8 × 3) + (2 × 2) + (2 × 2) = 32 ATP

Сводная информация о производстве ATP

Обзор аэробного дыхания

Производит ли аэробное дыхание двуокись углерода или ионы водорода и бикарбонаты? | Анестезиология

Поддержание внутриклеточного pH имеет решающее значение для клинического гомеостаза.Метаболизм глюкозы, жирных кислот и аминокислот, приводящий к образованию аденозинтрифосфата в митохондриях, сопровождается производством кислоты в цикле Кребса. Как природа этого ацидоза, так и механизм его устранения были доказаны двумя исследователями, давно проявляющими интерес к кислотно-щелочной физиологии. Они предлагают различные интерпретации и взгляды на молекулярный механизм регуляции внутриклеточного pH при нормальном метаболизме. Доктор Джон Северингхаус предположил, что ион водорода и бикарбонат являются прямыми конечными продуктами цикла Кребса.В конце 1960-х он показал в экспериментах с мозгом и гомогенатами мозга, что ацетазоламид, ингибитор карбоангидразы, снижает внутриклеточный pH. Это привело его к выводу, что ион водорода и бикарбонат являются конечными продуктами, а роль внутриклеточной карбоангидразы заключается в быстром образовании диффундирующего диоксида углерода для минимизации ацидоза. Доктор Эрик Свенсон утверждает, что углекислый газ является прямым конечным продуктом цикла Кребса, что является более широко распространенной точкой зрения, и что ацетазоламид предотвращает быстрое внутриклеточное образование бикарбоната, который затем может диффундировать с углекислым газом на поверхность клетки и там повторно превращаться для выхода. из клетки.Потеря этой «облегченной диффузии диоксида углерода» приводит к внутриклеточному ацидозу, поскольку все еще заметная некаталитическая скорость гидратации диоксида углерода генерирует больше протонов. Этот обзор суммирует имеющиеся данные и определяет, что решение этого вопроса потребует более сложных измерений внутриклеточного pH с более быстрым временным разрешением.

DR. У нас с ДЖОНОМ СЕВЕРИНГАУСОМ давние интеллектуальные различия в понимании этапов, с помощью которых несколько реакций декарбоксилазы в митохондриях во время аэробного метаболизма приводят к накоплению ионов водорода и углекислого газа.Я придерживаюсь стандартной точки зрения, согласно которой аэробный метаболизм углеводов, жиров и белков протекает с образованием углекислого газа в результате трех реакций декарбоксилирования митохондрий, в то время как он утверждает, что ион водорода и бикарбонат являются непосредственными конечными продуктами. Мы оба утверждаем, что внутриклеточный ацидоз после ингибирования карбоангидразы ацетазоламидом, наблюдаемый в мозге Северингхаусом, согласуется с нашим пониманием химии этих реакций и функции карбоангидразы.Редакционное руководство «Анестезиологии» предложило подробно опубликовать эти точки зрения с большей целью — стимулировать дополнительную работу в этой области биохимии и физиологии. Как и во многих случаях в течение своей долгой карьеры, доктор Северингхаус никогда не уклонялся от оспаривания общепринятого мнения, когда данные и веские физиологические аргументы предлагают логическое и альтернативное объяснение. Мне приятно представить наши позиции как дань уважения ему и тому большому влиянию, которое он оказал на мою карьеру и мышление.

Три стадии цикла Кребса являются катализируемыми реакциями декарбоксилирования: от пирувата до ацетил-кофермента А, катализируемого пируватдегидрогеназой, изоцитрата до α-кетоглутарата, катализируемого изоцитратдегидрогеназой, и от α-кетоглутарата до сукцината с помощью α-кетоглутарата. Все биохимики, начиная с Ганса Кребса и далее, рассматривали диоксид углерода как конечный продукт этих ферментативных реакций, хотя они не могли исключить ион водорода и бикарбонат, и у них не было методов, чтобы сделать это надежно.В более поздней работе Krebs and Roughton ^-1 показали, что диоксид углерода, а не бикарбонат, был конечным продуктом двух других реакций декарбоксилирования, уреазы и дрожжевой пируваткарбоксилазы, но эти эксперименты проводились в очищенных простых системах, а не в сложной среде организма. митохондрии или клетки. В начале двадцатого века было показано, что углекислый газ существует в трех взаимозаменяемых формах: сам углекислый газ, бикарбонат и углекислота, примерно в пропорциях 10, 90 и 0.1% соответственно. Карбоангидраза, один из самых быстрых известных ферментов, была открыта в 1932 году и, как было установлено, на много порядков ускоряет взаимное превращение этих трех видов. В то время как левая часть следующей реакции является практически мгновенной, правая часть протекает очень медленно с физиологической точки зрения (полупериод примерно 7 с при 37 ° C) без катализа. Однако карбоангидраза (СА) ускоряет его до завершения за миллисекунды.

В 1950-х годах ацетазоламид стал клинически доступным в качестве первого безопасного перорального диуретика при сердечной недостаточности и впоследствии оказался полезным при лечении многих заболеваний, от глаукомы до острой горной болезни.